Name: Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin, NSC-34 motor nöron benzeri hücrelerde gerçek zamanlı nükleositoplazmik taşınımı ölçmek için hassas bir yöntem. Bu teknik, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklardaki taşınım bozukluklarını nicel olarak analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AI laboratuvarının tüm üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. Servis-GFP vektörünü bize sağladığı için Prof. Mark Hipp&#39;e (Max Planck Biyokimya Enstitüsü) teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Kariyer Entegrasyonu Hibe (CIG # 333794) ve İsrail&#39;de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitü ( NIPI # b133-14 / 15).

1. Hücre Hattı Hazırlama <ol><li> Sıvı azotlu bir kapta saklanan yaklaşık 1.000.000 fare nöroblastoma spinal kord hücresini (NSC-34 hücreleri) çözdürün. Hücreler tamamen eriyene kadar 37 ° C su kuluçka makinesini kullanın. </li><li> Taze, sıcak ortam (% 10 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 kalem strep antibiyotikleri içeren DMEM ortamı) ekleyin. </li><li> Çözülmüş hücreleri (SL16R) 500 xg&#39;de 5 dakika süreyle santrifüj ederek bir hücre pelletini oluşturun. Ortamı atın ve hücre yeniden süspansiyonu için 1 mL yeni ortam ekleyin. </li><li> Yeniden süspanse edilen hücreleri 15 mL&#39;lik bir şişeye yerleştirin ve ekstra 5 mL&#39;lik bir ortam ekleyin. Hücreleri bir gece boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile steril bir inkübatörde inkübe edin. </li><li> Buna paralel olarak, 60 mm&#39;lik bir kültür çanağına 8 kaplanmamış lamelleri (kapak camı: 12 mm, 0.13-0.17 mm kalınlığında) yerleştirin ve kuru olana kadar% 70 etanol ile 30 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. Her çanağa orta miktarda ilave edin ve artık etanolü yıkamak için atın.</li><li> Yapışkan hücrelerin ayrışmasına izin vermek için yaklaşık% 90 konfluansa (kaba yaklaşık 6 milyon hücreye ulaştıktan sonra) tripsin tamponu (1 L Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 2.5 g tripsin ve 0.2 g EDTA) ekleyin. NOT: NSC-34 hücreleri hassasdır ve ortamı kullanarak ayrılmadan önce 15 s tripsin tampon inkübasyonu ve tripsin içermeyen inkübasyondan 1 dakika daha gereklidir. </li><li> Plaka zaten 3 ml orta, yaklaşık 350.000 tabak başına lamelleri içeren 60 mm kültür yemekleri üzerine hücreleri. Lamelleri üzerine hücre eklenti sağlamak için 24 saat inkübatör bırakın. </li></ol> 2. Hücre Transfeksiyon NOT: Yaklaşık 24 saat sonra NSC-34 hücreleri% 40 birleşmeye (yaklaşık 800.000 hücre) ulaşır ve transfeksiyon için hazır olacaktır. <ol><li> Steril mikrosantrifüj tüpünde saf DMEM ortamı (her 60 mm kültür çanağı için 300 μL DMEM ortamı hazırlayın) hazırlayınes. </li><li> Her DMEM içeren mikrosantrifüj tüpüne transfeksiyon için gereken 2 μg&#39;lık her plazmid ilave edin. NOT: Mekik-GFP plazmiti, tüm hücre aktarımlarında zorunludur. </li><li> Gerekli plasmidleri içeren tüm mikrosantrifüj tüplerine transfeksiyon reaktifi ekleyin. Burada, her 2 ug DNA için ticari transfeksiyon reaktifi 4 mcL ekleyin. </li><li> DMEM, plazmid ve transfeksiyon reaktifi içeren mikrosantrifüj tüplerini vorteksleyin ve 25 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her mikrosantrifüj tüpünü bir kültür çanağına ekleyin ve homojen bir solüsyon oluşturmak için çanağı hafifçe karıştırın. Çanağı inkübatöre 48 saat geri koyun. NOT: Mekik-GFP&#39;nin tüm hücrelerde eksprese edilmesi gerektiği için, mekik-GFP transfeksiyon etkinliği kısmen incelenebilir ve gecede transfeksiyon sonrasında floresanlı mikroskopi kullanılarak ön test edilebilir. Floresansız ifade edilen proteinlerin tam bir incelemesi, bir immünoblot analiziolduğunu. </li></ol> 3. Mikroskopi <ol><li> Bir lamel tutucuya transfekte NSC-34 hücreleri içeren lamelleri takın ve müttefiki ölen hücreleri kaldırmak için hafifçe fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. </li><li> Ters çevrilmiş mikroskoplu yeşil bir fluoresan filtre kullanarak uygun bir hücre yamasını belirleyin. NOT: Uygun bir hücre yaması, çok sayıda hücreyi (bir alandaki 20-30 hücre) gösteren ve çekirdeklerin hücrelerde açıkça tanımlandığı bir mikroskop alan olarak tanımlanır. Hücre yamasındaki hücre çekirdeği önce gözle tanımlanır ve görüntüleme yazılımı ile manuel olarak işaretlenir. </li><li> Mikroskop altında lamelleri damlayan lamelleri PBS 10 ng / mL LMB içeren bir exportin-1 inhibitörü Leptomisin B (LMB) tampon 200 mcL ekleyin. NOT: Bu zaman noktası sıfır aralığı olarak ayarlanır. </li><li> İşaretli çekirdeklerin floresan yoğunluğunu yaklaşık 400-500 s boyunca 3 s aralıklarla ölçün. </li><li&gt; Her bir deneyde her bir transfeksiyon grubu için 3 ila 5 kapak fişi testi yapın. </li></ol> 4. Analiz NOT: Farklı hücreler, farklı düzeylerde floresan mekik-GFP ifade ettiğinden, her hücrenin nükleer flüoresan yoğunluğunu kendi başlangıç ​​flüoresan yoğunluğuna normalleştirmek önemlidir. <ol><li> İşaretlenen çekirdeğin flüoresan yoğunluğunu, her çekirdeğin 3-s floresan aralığını o çekirdeğin başlangıç ​​altı aralık ortalamasına bölerek normalize edin. </li><li> Her çekirdeğin normalleştirilmesinden sonra, her bir hücre yamasının zamana bağlı olarak çekirdek flüoresansındaki değişikliği temsil eden bir floresan yoğunluk eğrisi oluşturun. Bunu yapmak için, her hücre yamasındaki tüm hücrelerin ortalamasını hesaplayın (her yamanın yaklaşık 20-30 hücresinden oluşur). NOT: Çekirdek floresan yoğunluğu eğrisi artan ti içinde daha iyi gözlemlenen bir Michaelis-Menten doygunluk eğrisine benzemektedirBen dönemler. Bunun nedeni, nükleer transporta bağlı olarak zamanla mekik-GFP sitozolik miktarlarında bir azalmadır. Bu azalma, bir mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe taşınma ihtimalini istatistiksel olarak düşürmekte ve dolayısıyla nükleer flüoresan satürasyonuna ulaşmaktadır. Eğrinin doğrusal başlangıç ​​hızından türeyen eğim, V max giriş hızını çekirdeğe verir. </li><li> Her bir deney grubunu temsil eden bir eğim oluşturmak için grafik yazılımı kullanarak, üç ila beş bağımsız deneyden türetilen her bir hücre yamasının V maks eğimlerini analiz edin. Tek yönlü ANOVA istatistiksel analizini kullanarak niceleme yapın. </li></ol> 5. Protein İfade Doğrulaması <ol><li> Buz üzerindeki her bir deney grubundan kalıntı hücreleri (yukarıdaki deneyde kullanılmayan) içeren 60 mm&#39;lik kültür yemekleri yerleştirin. </li><li> Ortamı atın ve seyreltmek ve kalan ortamı yıkamak için hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Hücrelere 200-400 muamele edinPBS,% 0.5 Triton ve proteaz inhibitörü kokteyl tableti (PI) içeren lizis tamponu μL&#39;si. Hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın. </li><li> Lizis tamponunda hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buz altında 1 dakika süreyle 4.000 rpm&#39;de bir homojenleştirici ile homojenize edin. </li><li> Homojenleştirilmiş hücreleri 2500 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, bir Bradford testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve -20 ° C&#39;de kullanana kadar saklayın. </li><li> 30 ve 70 μg toplam protein (protein bağlı olarak) arasında toplayın ve bir immunoblot tahlili kullanılarak protein ekspresyonu için test etmek için bir SDS-PAGE jel yükleyin. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , 4th edn, Garland Science. (2002).</li>
<li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li>
<li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li>
<li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877(2016).</li>
<li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li>
<li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli%2C+impede+RNA+biogenesis%2C+and+kill+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li>
<li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li>
<li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li>
<li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9ORF72+poly%28GA%29+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li>
<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li>
<li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li>
<li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li>
<li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+frontotemporal+dementia+and%2For+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li>
<li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li>
<li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li>
<li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS%2FFTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar açıklayacak bir şeye sahip değiller.

Bu protokol, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas ve niceliksel yeni bir testi gösterir. Bu sistemi kullanarak, protein dağılımında dramatik değişikliklerle sonuçlanan büyük kusurları değil, nükleositoplazmik taşınmayı ve onun işlev bozukluğunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek ve ölçmek mümkündür. Bu tahlil sadece duyarlılık avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda hazırlık gerektirir, ucuzdur ve çok kolay ve düşük etkileşimli bir testtir. <p clas...

Nükleer gözenek kompleksi (NPC), büyük moleküllerin hücre çekirdeğine girip çıkmasını kontrol eder. Düzenleme 1 olmadan çekirdeğe girebilen küçük moleküllerin aksine, daha büyük moleküllerin taşınması NPC tarafından güçlü bir şekilde kontrol edilir. Proteinler ve RNA gibi bu büyük moleküller, çekirdekten ithal edilecek ve ihraç edilecek olan importinler ve exportinler de dahil olmak üzere ulaşım faktörleri ile ilişkilendirilmektedir. İthal edilmek için, proteinler, genellikle nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) olarak adlandırılan ve importins 2 ile bağlanan küçük bir peptid motifi içermelidir. Bu amino asit dizileri bir etiket görevi görür ve 3 , 4 bileşiminde çeşitlilik gösterir. Proteinler, çekirdeğin, exportin ile ilişkisinden dolayı sitoplazmaya ihraç edilebilirS, genellikle bir nükleer ihraç sinyali (NES) 2 olarak adlandırılan bir sinyal sekansını bağlar. Hem importins hem de exportins, küçük Ras ile ilgili nükleer protein GTPase (Ran) 2&#39;nin düzenlenmesi nedeniyle yüklerini taşıyabiliyorlar. Ran&#39;ın, GTP&#39;ye veya GSYİH&#39;ye bağlı olup olmadığına bağlı olarak farklı konformasyonel hallerde bulunduğu gösterilmiştir. GTP&#39;ye bağlandığında, Ran importins veya exportins&#39;e bağlanabilir. Exportins, RanGTP&#39;ye bağlandığında yüklerini serbest bırakırken, exportins&#39;ler ihracat kargolarıyla bir kompleks oluşturmak için RanGTP&#39;yi bağlamalıdır. Ran&#39;ın hakim nükleotid bağlanma durumu, çekirdeğin (RanGTP) veya sitoplazmanın konumuna (RanGDP) bağlıdır. Son zamanlarda, bir dizi çalışma, nükleositoplazmik yolakta ve hem amiyotrofik lateral sklerozda (ALS) hem de frontotemporal bunama (FTD) 5,6 arasındaki bozukluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir </sup&gt; , 7,8,9,10,11,12 . ALS, hem üst hem de alt motor nöronlarını (MN) etkileyen ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanan ilerleyici ve ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. Çoğu ALS vakası, herhangi bir görünür genetik bağlantı bulunmayan sporadik (SALS) olarak sınıflandırılır, ancak% 10 dominant bir şekilde miras kalır (ailesel ALS; FALS). Son zamanlarda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemeleri (HRE), ALS ve FTD&#39;nin genetik bir nedeni olarak 14 , 15 olarak tanımlandı. Bu mutantlar FALS vakalarının% 30-40&#39;ını oluşturur ve farklı çalışmalar iddia edilmiştirNükleositoplazmik taşınımı etkileyerek toksikliğe neden olduklarını, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Bu çalışmalar çoğunlukla HRE&#39;lerin nükleositoplazmik nakil üzerindeki nihai sonuçlarını ve tezahürlerini göstermiştir, ancak gerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik bozulma göstermezler. Sonuç olarak, sadece ağır nükleositoplazmik transport yetersizliği 11 , 17 , 18 olarak değerlendirildi. Bu protokol yeni ve veGerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik transport bozukluğunu değerlendirmek ve ölçmek için hassas duyarlılık testi. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu daha önce tarif edildiği gibi bir exportin inhibitörü kullanılarak yapılır, böylece mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe girmesine izin verir. Floresan mikroskopi ve gerçek zamanlı olarak flöresan değişiklikleri nicelikli bir yazılım kullanarak çekirdekte bulunan mekik-GFP&#39;nin flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişikliklerin sayısal olarak tespit edilmesi mümkündür. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresan-zaman ekseninin bir Michaelis-Menten benzeri doyum eğrisi yapılabilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak, flüoresans doygunluğundan önce çekirdeğe girme oranını temsil eden bir eğim oluşturmak mümkündür. Deneyi doğrulamak için, tercüme etmekDaha önce nükleositoplazmik taşınmayı kesintiye uğrattığı bildirilen poli (GR) ve poli (PR) C9orf72 dipeptide tekrarlar 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50&#39;lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişiklikleri incelenebilir. Dahası, farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik nakil defekti kurtarma kabiliyeti belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Fare Motor Nöron Benzeri Hibrit Hücre Hattı (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glikoz</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS Avrupa Sınıfı</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Termo Forma Serisi ii Su Ceketli CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı 12 mm çap, 0.13-0.17 mm kalınlık</td><td>Bar Naor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 ters mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Tezgahı 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomisin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör motoru / kontrol / ayna / 90 derece kelepçe</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Santrifüj, Soğutmalı</td><td>Termo Bilimsel</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

motor nöron benzeri nsc-34 hücrelerinde gerçek zamanlı nükleositoplazmik taşınımı Ölçüm testi

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nükleositoplazmik nakil, büyük moleküllerin hücre çekirdeğinden ithalatı ve ihracını ifade eder. Yakın geçmişte, bir dizi çalışma amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile nükleositoplazmik yolakta bozulmalar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. ALS motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanır ve ölümle sonuçlanır. Çoğu ALS olgusu, herhangi bir görünür genetik bağlantıdan yoksun, dağınıktır, ancak% 10 hakim bir şekilde kalıtsaldır. Yakın zamanda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemesi (HRE), ALS ve frontotemporal bunama (FTD) genetik bir nedeni olarak tanımlandı. Önemli olarak, farklı gruplar yakın zamanda, bu mutantların nükleositoplazmik taşınımı etkilediğini önermişlerdir. Bu çalışmalar çoğunlukla HRE&#39;lerin nükleositoplazmik nakil üzerinde nihai sonucu ve tezahür göstermiştir ancak bunlar nükleer transport bozukluğunu göstermemektedirgerçek zaman. Sonuç olarak, çoğunlukla yüksek aşırı ekspresyon veya eksojen protein yerleştirilmesinden dolayı ciddi nükleositoplazmik ulaşım eksikliği saptanabilir. Bu protokol, nükleositoplazmik transport bozukluğunun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi ve nicelleştirilmesi için yeni ve çok hassas bir tahlil tarif etmektedir. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu bir exportin inhibitörü kullanılarak gerçekleştirilir, böylece GFP&#39;nin mekik içine girmesine izin verilir. Tahlilin geçerliliği için, C9orf72 HRE, daha önce nükleositoplazmik taşınmayı bozduğu gösterilen, poli (GR) ve poli (PR) dipeptid tekrarlarını çevirmiştir. Tanımlanan tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50&#39;lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikler incelenebilir ve farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik tr&#39;ini (kısmen bile) kurtarma yeteneği incelenebilirAnsport defekti belirlenebilir.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri bir NLS-NES-GFP (mekik-GFP) proteini ile transfekte edildi. NLS ve NES sinyal sekanslarına sahip olan bu protein ( Şekil 1 ), çekirdek ve sitoplazma arasında dolaşım yapabilir. Jenerik GFP, difüzyon yoluyla herhangi bir lokalizasyon sinyal etiketinin yokluğunda çekirdeğe girebilir veya çekilebilir ve dolayısıyla çekirdek ile sitoplazma arasında eşit olarak dağıtılır ( Şekil 2A ). B...

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Bu deneyin genel amacı, potansiyel taşıma hızı baskılayıcı moleküllerin varlığında veya yokluğunda, hücrelerin nükleositoplazmik taşıma hızındaki küçük değişiklikleri gerçek zamanlı olarak tespit etmektir. Bu yöntem, nükleositoplazmik taşımayı olumsuz etkilediği öne sürülen ALS gibi belirli nörogenetik hastalıklar hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin bazı avantajları, yüksek hassasiyetli ve kantitatif olması ve nükleositoplazmik taşıma hızındaki küçük değişikliklerin gerçek zamanlı analizine olanak tanımasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Tom Shani uygulamalı olarak gösterecek. İşleme, sıvı azot depolamasındaki yaklaşık 1 × 10⁶ fare nöroblastoma omurilik hücrelerini 37 °C'lik bir su banyosunda çözerek başlayın. Hücreler tamamen çözüldüğünde, santrifüjasyonla toplayın ve peleti bir mililitre taze besiyerinde yeniden süspande edin.Ardından hücreleri, 37 °C'de ve %5 karbon dioksit içeren bir ortamda gece boyunca inkübasyon için beş mililitre hücre kültür ortamı içeren 15 mililitrelik flaska aktarın. Hücreler %90 konfluense ulaştığında, sekiz adet kaplanmamış lamel camı ayrı ayrı 60 milimetrelik kültür kaplarına yerleştirin ve lam

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Bu protokol, nöronal kanser hücrelerinden proteinlerin ekstraksiyonunu ana hatlarıyla belirtir. Hücreler bir tampon ile yıkanır ve enzimatik ve mekanik bozulma yoluyla parçalanır. Ekstrakte edilen protein açısından zengin süpernatant, santrifüjlemeden sonra toplanır.

Nöronal Hücrelerden Protein Ekstraksiyonu

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Bu protokol, optogenetik araçlar aracılığıyla nükleositoplazmik taşınmanın izlenmesinden elde edilen canlı hücre görüntüleme verilerinin otomatik analizlerinin nasıl verimli bir şekilde kurulacağını ve gerçekleştirileceğini açıklar.

Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Öğrenin, NSC-34 motor nöron benzeri hücrelerde gerçek zamanlı nükleositoplazmik taşınımı ölçmek için hassas bir yöntem. Bu teknik, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklardaki taşınım bozukluklarını nicel olarak analiz eder.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Daha fazla video keşfet