Name: Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin, kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yöntemiyle TGF-β1'in SMAD2 ve STAT3 transkripsiyon faktörlerinin c-KIT promotörüne bağlanmasını incelemeyi. Bu teknik, insan karaciğer kanseri hücre hatlarında protein-DNA etkileşimlerini canlı hücrelerde çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi, Houston, TX (başlangıç ​​fonları, BB) tarafından desteklenmiştir.

1. Çözümlerin Hazırlanması <ol><li> Her bir deney için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. <ol><li> Sabitleme çözümü için % 37 formaldehit hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içinde% 1.42&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. DİKKAT: Formaldehit tahriş edici, aşındırıcı, mutajenik, teratojenik ve kanserojen olarak sınıflandırılmıştır. Beslenmeyin. Gaz / duman / buhar / sprey solumayın. Havalandırmanın yetersiz olduğu durumda solunumla ilgili uygun ekipman giyin. Deri ve gözlerle temasından kaçınınız. Oksitleyici maddeler, indirgeyici maddeler, asitler, alkaliler ve nem gibi bağdaşmayan maddelerden uzak tutun. </li><li> Glisin durdurma çözeltisi çözeltisi için, 1x PBS solüsyonunda 0.125 M glisin hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Hücre sıyırma çözeltisi için, dH20 içerisinde 1x PBS solüsyonu hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Kullanımdan hemen önce, proteinaz inhibitörü fenilmetilsülfonil fluorür (PMSF) t0.5 mM nihai konsantrasyon. DİKKAT: PMSF aşındırıcı ve toksik olarak sınıflandırılmıştır; Koruyucu giysiler giyin ve havalandırılan bir alanda kullanın. </li><li> Doğrudan hücre liziz tamponunu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 85 mM KCI ve% 0.5 NP40) kullanmadan önce, 1X Proteaz İnhibitörü Kokteyl (PIC; dimetil sülfoksitte 100X stok solüsyonu (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorid (AEBSF), 80 uM aprotinin, 4 mM enzatin, 1.4 mM E-64, 2 mM leupeptin ve 1.5 mM pepstatin A) ve 0.5 mM PMSF. </li><li> Çekirdek liziz tamponunu (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 1 SDS) kullanmadan önce doğrudan 1X PIC ve 0.5 mM PMSF ilave edin. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Tespiti ve Kesme <ol><li> 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde 70-80% konfluansa hücreleri büyütün. Hücreleri deneysel amaçlar doğrultusunda uyarırlar. </li><li> Doku kültürü ortamı çıkarın, 5 mL sabitleme solüsyonu ekleyin ve inkübe edin.Hücreleri titreşimli bir platformda oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. </li><li> Sabitleme çözeltisini çıkarın ve hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 1x PBS&#39;yi çıkarın, 5 mL glisin durdurma çözeltisi ilave edin ve hücreleri sallanan bir platformda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Glisin stop-fix çözeltisini çıkarıp hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 1x PBS&#39;yi çıkarın, 2 mL hücre kazıma çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir kazıyıcı kullanarak hasat edin. Hasat edilen hücreleri buz üzerinde konik bir tüpe aktarın. </li><li> Örnekleri 600 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı çıkarın, pelleti 1 mL&#39;lik 1X hücre liziz tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Alternatif olarak, pelet sıvıyı sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Pellet hücre liziz tamponunda bir kez yeniden süspansiyon haline getirildiğinde, hücre süspansiyonunu buz gibi dounce homojenleştiriciye aktarın ve bir B tipi böcek kullanarak 10 vuruş boyunca atınE hücre parçalanması için. </li><li> Hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2,400 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, 350 uL çekirdek sindirim tamponunda pellatı tekrar süspanse edin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Mikrokakal nükleaz (1 U / μL) ekleyin ve vorteksleme ile karıştırın. Numuneleri 37 ° C&#39;de 5-20 dakika inkübe edin; Numuneleri her 2 dakikada bir ters çevirerek karıştırın. NOT: Zaman ve enzim konsantrasyonu hücre çizgileri arasında farklıdır ve optimal olmayan enzimatik kesme durumunda optimizasyon gerektirebilir. </li><li> Alternatif olarak, piyasada bulunan sonikatörler kullanılarak sonikasyon ile kromatin makaslama elde edin. NOT: Sonication koşulları optimizasyon gerektirir. 300 uL&#39;lik bir örnek hacmi ve% 25&#39;lik bir örnek işleme gücü kullanılarak bir optimizasyon örnek protokolü aşağıda sağlanmaktadır. <ol><li> Adım 2.10&#39;ın ardından süpernatanı atın ve n&#39;yi tekrar süspanse edin1,0 mL ticari yılan tamponunda nükleer pellet. </li><li> Üç 1.7 mL mikrosantrifüj tübüne tekrar süspansiyon haline getirilmiş nükleer pelletden 300 uL alikot altına alın. Onları buz koyun. </li><li> Optimum sonikasyon koşullarını belirlemek için sabit renk kromatininin 3 kısımlarını% 25&#39;lik bir güçle 3 farklı koşul kullanarak kesilin: Her bir darbe arasında buz üzerinde 30 saniye dinlenme ile 20 sn&#39;lik 5 puls. Her puls arasında 10 saniye, buzda 30 saniye dinlenme. 20 puls, her biri 20 s, her nabız arasında buz üzerinde 30 s dinlenme ile. </li><li> Aşağıda özetlenen şekilde Adım 2.15 ile devam edin. </li></ol></li><li> Mikrokokal nükleaz ile kuluçkadan sonra reaksiyonu durdurmak için 7 uL buz soğukluğunda 0,5 M EDTA ilave edin. </li><li> Numuneleri kesilmiş DNA ile 16,200 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Kesilmiş DNA içeren süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Onaylamak için ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne 50 uL&#39;lik kısım ilave edinDNA&#39;nın ccessful makaslama (bölüm 3). İmmünopresipitasyon için hemen geri kalan hacmi kullanın (bölüm 4) veya -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Kesme Verimliliğinin Doğrulanması <ol><li> Adım 2.16&#39;dan kesilmiş kromatin 50 mcL&#39;ye bölünene, 150 uL nükleazsız dH2O ve 10 uL 5 M NaCl ekleyin. </li><li> Çapraz bağları tersine çevirmek için numuneleri 65 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. </li><li> 2 μL RNase A (10 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. </li><li> 10 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 42 ° C&#39;de 90 dakika inkübe edin. </li><li> DNA&#39;nın saflaştırılması için bir fenol / kloroform ekstraksiyonu yapın 12 . <ol><li> 200 uL&#39;lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen su ekleyin. 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) numuneye ekleyin ve 20 saniye vorteks ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında santrifüjleyin16.000 x g&#39;de 5 dakika süreyle kullanılır. Dikkatle üst sulu fazı çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Pipetleme sırasında herhangi bir fenol taşımamaya dikkat edin. </li><li> 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (NH4OAc), pH 5.2 ilave edin ve tüpü bir parmakla birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. 2.5 hacim buz soğukluğunda% 100 etanol ilave edin ve 5 saniye vorteksleyerek karıştırın. Örnek O / N&#39;yi -20 ° C&#39;de veya en az 1 saat süreyle -80 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> CDNA pelet için 4 ° C ve 16.000 xg&#39;de 30 dakika için numune santrifüjleyin. </li><li> Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. 1 mL RT,% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. </li><li> Numuneyi 4 ° C&#39;de ve 16.000 x g&#39;de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. </li><li> Pelleti oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca kurutun. Pelleti 30 uL dH2O içinde tekrar süspanse edin. </li></ol></li><li> % 1 TAE ile jel elektroforezi için saflaştırılmış DNA&#39;nın 5 ve 10 uL&#39;lik kısımlarını kullanınAgaroz jeli. NOT: Başarılı bir kromatin makaslama, 200-1,500 bp&#39;lik DNA örüntüsü ile sonuçlanır. Kesme başarısız olursa, kesme aşamasının (aşama 2.12) inkübasyon süresini 5, 10 ve 15 dakika olarak değiştirerek, spesifik hücreler için optimum kesme koşullarını belirleyin. </li><li> Numunenin DNA konsantrasyonunu analiz etmek için kalan numuneyi kullanın. Kesilmiş kromatin örneğinde DNA konsantrasyonunu ters hesaplayın (basamak 2.16); Her bir tedavi grubu için immüno çökeltme için aynı DNA miktarlarını kullanın (bölüm 4). </li></ol> 4. İmmunopresipitasyon <ol><li> 25 μL ChIP dereceli protein G manyetik boncuklar, 10 μL immüno-çöktürme seyreltme tamponu (stok çözeltisi:% 0.01 SDS,% 1.1 Triton X-100, 16.7 mM) ile 10-25 μg kesilmiş, çapraz bağlanmış kromatin birleştirin (adım 2.16) Tris-HC1, pH 8.0, 1.2 mM EDTA ve 167 mM NaCl) ve 1 uL PIC. </li><li> 4 saat inkübasyondan sonra, 1-10 μg antikor (antikor konsantratıAntikorun afinitesine bağlı olarak değişecektir; Başlangıçta üretici önerileri uyarınca kullanılmalı ve gerekliyse deneysel olarak optimize edilmelidir) 1.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne uygulandı ve 100 uL&#39;lik bir son hacme dH20 eklendi. NOT: Yukarıda tarif edilen direkt immünopresipitasyon yöntemi yerine dolaylı immüno-çöktürme yöntemi, önce kromatin ile antikorları birleştirip daha sonra protein G manyetik boncuk ekleyerek kullanılabilir. </li><li> 4-12 saat boyunca 4 ° C&#39;de örnekleri uçtan uca bir rotatöre inkübe edin. </li></ol> 5. Elüsyon <ol><li> Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikçe, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Boncukları üç kez 800 μL yıkama tamponu 1 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ve 150 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik aya yerleştirin a.Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Boncukları bir kez 800 μL yıkama tamponu 2 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8, 20 mM Tris-HCI pH 8 ve 500 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> 50 μL elüsyon tamponu (% 1 SDS ve 100 mM NaHCO 3 ) içindeki boncukları tekrar süspansiyon haline getirin ve örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir uçtan uca rotatörde inkübe edin. </li><li> Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yanına bir kere toplandıktan sonra süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. </li><li> Çapraz bağlanmayı tersine çevirmek için 6 μL 5 M NaCl ve 2 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin. Numuneleri karıştırdıktan sonra, numuneleri 2 saat 65 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> DNA&#39;nın saflaştırılması için bir phe gerçekleştirinNol / kloroform ekstraksiyonu 12 (adım 3,5) ve daha sonra peleti 30 uL dH20 ile tekrar süspanse edin. NOT: Numuneler, protein bağlama alanları için doğrudan analiz edilebilir (bölüm 5) veya -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 6. Bağlanma Sahası Analizi <ol><li> PCR veya qRT-PCR kullanarak bilinen bir nükleik asit dizisi içindeki spesifik bağlanma alanları için bir analiz yapın. Primer tasarım için, geleneksel PCR veya qRT-PCR protokollerini uygulayın. İlgilenen protein bağlanma sitesini köprüleyen 150-400 bp&#39;lik bir amplifikatı sentezlemek için primerleri tasarlayın ( Şekil 1 ). </li><li> Spesifikliği sağlamak için dört farklı DNA şablonu kullanarak PCR ayarlayın: i) ilgilenilen antikor ile immüno-çökeltilen immüno-çökelti ChIP&#39;den DNA, ii) spesifik olmayan bir IgG antikoru ile immüno-çöktürülmüş ChIP&#39;den DNA, iii) giriş DNA&#39;sı ve iv) H20 Kontaminasyonu dışarı atmak için PCR için negatif kontrol. Yol uyarma durumunda, Immüno çökeltilmiş proteinin bilinen bir bağlanma bölgesine özgü farklı primerler seti kullanılarak beşinci bir şablon seçin. NOT: c-KIT ligand yükseltici analizi durumunda, c-KIT ligand yükseltici bölgedeki SBE&#39;de TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasını göstermek için klasik PCR kullanın. Pozitif bir kontrol olarak, TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasının bilinen bir hedefi olarak plazminojen aktivatör inhibitörü-1 (PAI-1) üzerinde PCR gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687986300119">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC366919/">Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites%2C+differential+gene+regulation+mechanism%2C+epigenetic+marks+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li>
<li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+human+transcription+factor+targets+by+coupling+chromatin+immunoprecipitation+and+CpG+island+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22GenesDev%22%5BJournal%5D)">Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis.</a> GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Smad transcription factors.</a> Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).</li>
<li>Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Positive+TGF-beta%2Fc-KIT+Feedback+Loop+Drives+Tumor+Progression+in+Advanced+Primary+Liver+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer.</a> Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol%3Achloroform%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA%3A+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li>
<li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+%28signal+transducers+and+activators+of+transcription%29+DNA+binding+and+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202303000902">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li>
<li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754(2010).</li>
</ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Bu raporda SMAD2&#39;nin c-KIT ligand yükselticisindeki bir SBE&#39;ye TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını ve STAT3&#39;ün TGF-β1 ligand geni içindeki tanıma dizisine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme yöntemini kullanarak her iki transkripsiyon faktörünün sitokinle indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme, bir proteinin DNA&#39;ya doğrudan bağlanmasını, protein ile DNA&#39;nın bağlanmasını sağlayan uyarıların karakterize edilmesi v...

Ökaryotların çekirdeğinde DNA, histon proteinleri ve histolojik olmayan proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Fizyolojik, patofizyolojik ve hücre biyolojik bağlamında, hücresel fonksiyonlar mekansal olarak ve geçici olarak kromatin koordine edilmiş gen ifadesi ile kontrol edilir. DNA-protein etkileşimleri, DNA replikasyonu, rekombinasyon ve tamir gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesinde ve protein ekspresyonunda önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen ekspresyonunun ve hücre fonksiyonunun değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araçtır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve DNase I ayak izi 1 , 2 gibi in vitro DNA-protein etkileşimlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, bu teknikler, kromatin ve hücresel bağlamda protein-DNA etkileşimini analiz etmez. ChIP iSa tekniği, spesifik DNA bağlama alanlarına bağlı proteinleri yakalar ve böylece kromatin bağlamında DNA-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu teknik esas olarak Gimour ve Lis tarafından, Escherichia coli ve Drosophila melanogaster 3 , 4&#39;te spesifik genlere RNA polimeraz II&#39;nin bağlanmasının değerlendirilmesi için geliştirildi. DNA-protein komplekslerinin sabitlenmesiyle, bunu takiben kromatin ekstraksiyonu yapılarak DNA&#39;nın ~ 200 baz çifti (bp) parçalara kesilmesi ile yapılır. Daha sonra, ilgili DNA&#39;ya bağlı protein immüno çökeltme ile izole edilir. DNA-protein çapraz bağlantının tersine çevrilmesinden sonra, DNA arıtılır ve analiz edilir. Protein bağlama bölgelerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve hedef gen 5 içindeki protein bağlama alanının nükleik asit dizisine bağlıdır. DNA dizisinin bilinmesi durumunda, standart PolYmeraz Zincir Reaksiyonları (PCR), bilinen bağlama alanına bitişik spesifik primer çiftleri kullanılarak uygulanabilir. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) de kullanılabilir 6 . Dizinin bilinmediği durumlarda, ChIP, DNA mikrodizileri (ChIP-on-chip), DNA dizilimi (ChIP-seq) veya klonlama teknikleri 7 , 8 , 9 ile birleştirilebilir . TGF-β yolu güçlü tümör baskılayıcı işlevlere sahiptir ve hücre farklılaşmasında önemli bir yol oluşturmaktadır. TGF-β1 ligandının kognat reseptör kompleksine bağlanması yoluyla aktive edilir ve SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonuna neden olur. Ortak mediyatör olan SMAD4 ile olan ilişkisini takiben, SMAD kompleksi çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef genlerin promotörü bölgesi içinde SBE&#39;ye bağlanır ve burada hücre döngüsü, apoptoz ve hücre farklılaşmasını kontrol eden genleri düzenlerüzerinde. TGF-β stimülasyonuna transkripsiyonel yanıt hücre tipi ve bağlam-spesifik 10&#39;dur . Son zamanlarda, TGF-β ve c-KIT yolu arasında olumlu bir geri besleme döngüsü tanımladık 11 . Bu modelde, TGF-β1 ile aktive olan SMAD2, c-KIT ligand yükselticisine bağlanır ve ekspresyonunu ve sekresyonunu indükler. Daha sonra, c-KIT ligandı, c-KIT reseptörünü otomatik ve para-kreynik biçimde aktive eder. C-KIT reseptör aktivasyonu, JAK1 / 2 yoluyla STAT3 Tyr 705 fosforilasyonuna neden olur. STAT3-aktivasyonu ve nükleer translokasyonu takiben STAT3, TGF-β1 ligand genine bağlanır ve ekspresyonunu düzenler. Burada SMAD2&#39;nin c-KIT reseptör ligand yükselticisine bağlanması ve Sinyal Transdüseri (ve) Aktivatörün (Transkripsiyon 3) (STAT3&#39;in TGF-β1&#39;e bağlanması) tanımlanması için ChIP analizinin temel rolünü gösteriyoruz gen).

<table><tbody><tr><td>HepG2 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF -&beta; 1</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>101-B1 10</td><td>ng/mL</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 antikoru</td> konsantrasyonunda kullanılır <td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi</td><td>5339</td><td>Kullanılan miktar/IP: 3 &mikro; g</td></tr><tr><td>Anti-STAT3 antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>4904</td><td>Kullanılan miktar / IP: 3 ve mikro; g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Proteini G Manyetik Boncuklar</td><td>Aktif Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Aktif Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokal</td><td>Nükleaz Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR ileri astar: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Dizi: 5'-GGAAGAGGATAAAAGCTG-3'</td></tr><tr><td>PCR ters astar: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Dizisi: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'</td></tr><tr><td>PCR ileri astar: SCF</td><td></td><td></td><td>Dizisi: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR ters astar: SCF</td><td></td><td></td><td>Dizisi: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'</td></tr><tr><td>PCR ileri astar: TGF-&beta; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sıra: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR ters astar: TGF-&beta; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sıra: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR ileri astar: TGF-&beta; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sıra: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR ters astar: TGF-&beta; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sıra: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3' &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

kromatin İmmunopresipitasyon yöntemi kullanılarak c-kit ligand promotör analizi

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA replikasyonu ve onarımı, DNA rekombinasyonu ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçler, proteinler ve DNA arasında etkileşim gerektirir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimleri, hücre farklılaşması, hücre proliferasyonu, hücre döngüsü kontrolü, kromozom stabilitesi, epigenetik gen düzenlenmesi ve hücre dönüşümü gibi çoklu fizyolojik, patofizyolojik ve biyolojik fonksiyonları düzenler. Ökaryotik hücrelerde DNA, histon ve histokonsuz proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Deneyi (EMSA) ve DNase I ayak izi gibi DNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için çeşitli teknik araçlar kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler protein-DNA etkileşimini in vitro olarak analiz eder, hücresel bağlam içinde değil. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), proteinleri belirli DNA bağlama bölgelerinde yakalayan ve böylece DNA-protein etkileşimini tanımlayan bir tekniktirOnların kromatin bağlamı içinde. DNA-protein etkileşiminin sabitlenmesiyle, ardından ilgilenilen proteinin immüno çökmesi ile yapılır. Daha sonra, proteinin bağlı olduğu genomik bölge karakterize edilir. Burada, ÇIP&#39;yi tarif eder ve tartışır ve transkripsiyon faktörü SMAD2&#39;nin Transforma Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β) ile indüklenmiş SMAD2&#39;nin tirozin-bağışıklık sisteminin promotör bölgesi içindeki SMAD Bağlama Elemanları&#39;na (SBE) bağlanmasının tanımlanması için analitik değerini gösteririz Protein kinaz Kiti (c-KIT) reseptör ligandı Kök Hücre Faktörü (SCF).

TGF-β1 ligandının aynı kökenli reseptör kompleksine bağlanması, SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonunu ve bunun ardından ortak mediatör SMAD4&#39;le birleşmesini sağlar. SMAD kompleksi çekirdeğe taşır. TGF-β gen transkripsiyonunu hedef genlerin düzenleyici bölgelerindeki SBE&#39;lere direkt olarak SMAD ile bağlanarak veya dolaylı olarak ilgilenilen genin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyonel aktivatörlerin veya baskılayıcıların SMAD tarafından düzenlenen ekspre...

DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır .

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Bu kromatin immünopresipitasyon prosedürünün genel amacı, TGF beta 1 tarafından indüklenen SMAD2 transkripsiyon faktörünün, C kit promotöründeki SMAD bağlanma elementlerine bağlanmasını değerlendirmektir. Bu yöntem, sitokin tarafından indüklenen gen transkripsiyonu gibi hücresel biyoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, transkripsiyon faktörlerinin ve diğer transkripsiyon düzenleyici proteinlerin DNA bağlanma bölgelerine in vivo doğrudan bağlanmasını gösterme potansiyeline sahip olmasıdır.Hücreleri on santimetrelik doku kültürü plaklarında %70 ile %80 arasında konfluense ulaşana kadar büyütün. Hücreleri deneysel amaçlara göre stimüle edin. Doku kültürü besiyerini uzaklaştırın ve beş mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında, sallama platformu üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon solüsyonunu uzaklaştırın ve hücreleri 10 mL buz gibi soğuk 1X PBS ile iki kez yıkayın. 1X PBS'i uzaklaştırın ve beş mL glisin stop fix solüsyonu ekleyin.Hücreleri bir çalkalama platformu üzerinde oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, glisin durdurma fiksasyon çözeltisini uzaklaştırın ve hücreleri iki kez 10 mill

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Bu video, protein-DNA etkileşimlerini göstermek için klasik bir teknik olan kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi için protokolü açıklar. Bu teknik, insan kronik lenfositik lösemi hücrelerindeki hedef genleri tanımlamak için kullanılır.

Kromatin İmmünopresipitasyon Deneyi: Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Teknik

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

DNA arttırıcılar gibi düzenleyici elemanlarının Gen ifadesinin fiziksel olarak hedef gen rehberleri, sık sık büyük genomik mesafeleri kapsayan uzun menzilli kromozom etkileşimleri aracılığıyla irtibata geçerek kontrol. Organizatörü yakalama Hi-C (PCHi-C) hedef genleri için potansiyel yasal sıralarının atama etkinleştirme rehberleri ve distal bölgeler arasındaki önemli etkileşimler tanımlar.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Öğrenin, kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yöntemiyle TGF-β1'in SMAD2 ve STAT3 transkripsiyon faktörlerinin c-KIT promotörüne bağlanmasını incelemeyi. Bu teknik, insan karaciğer kanseri hücre hatlarında protein-DNA etkileşimlerini canlı hücrelerde çalışmanıza olanak tanır.

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Daha fazla video keşfet