Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Bu kromatin immünopresipitasyon prosedürünün genel amacı, transkripsiyon faktörü SMAD2'nin C kit promotöründeki SMAD bağlanma elemanlarına TGF beta 1 ile indüklenen bağlanmasını değerlendirmektir. Bu yöntem, sitokin kaynaklı gen transkripsiyonu gibi hücresel biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, transkripsiyon faktörlerinin ve diğer transkripsiyon düzenleyici proteinlerin in vivo olarak DNA bağlanma bölgelerine doğrudan bağlandığını gösterme potansiyeline sahip olmasıdır.

Hücreleri, on santimetrelik doku kültürü plakaları üzerinde% 70 ila% 80 arasında birleşecek şekilde büyütün. Hücreleri deneysel amaçlara göre uyarın. Doku kültürü ortamını çıkarın ve beş mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin.

Ardından, hücreleri çalkalanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk bir X PBS ile iki kez yıkayın. Bir X PBS'yi çıkarın ve beş mililitre glisin durdurma düzeltme çözeltisi ekleyin.

Hücreleri çalkalayan bir platform üzerinde oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, glisin durdurma sabitleme solüsyonunu çıkarın ve hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk bir X PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, iki mililitre hücre kazıma çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak hasat edin. Ardından, hasat edilen hücreleri buz üzerindeki konik bir tüpe aktarın.

Numuneleri 600 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, peleti bir mililitre bir X hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Pelet, hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edildikten sonra, hücre süspansiyonunu buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın ve hücre bozulması için B tipi bir havaneli kullanarak 10 vuruş boyunca Dounce.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi 2, 400 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 350 mikrolitre çekirdek sindirim tamponunda yeniden askıya alın. Numuneleri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe ettikten sonra, mikrokok nükleaz ekleyin ve girdaplama ile karıştırın.

Numuneleri 37 santigrat derecede beş ila 20 dakika inkübe edin, numuneleri her iki dakikada bir ters çevirerek karıştırın. Bazı konsantrasyonlardaki süre, hücre hatları arasındaysanız, optimal olmayan enzimatik kesme durumunda optimizasyon gerektirebilir. Piyasada bulunan sonicare'i kullanan alternatif bir kesme prosedürü metin protokolünde bulunabilir.

Mikrokokal nükleaz ile inkübasyonun ardından, reaksiyonu durdurmak için yedi mikrolitre buz gibi soğuk 0.5 molar EDTA ekleyin. Numuneleri kesilmiş DNA ile 16, 200 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatan içeren kesilmiş DNA'yı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi DNA'nın başarılı bir şekilde kesildiğini doğrulamak için 50 mikrolitreyi ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne koyun. Kalan hacmi hemen immünopresipitasyon için kullanın veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. 10 ila 25 mikrogram kesilmiş çapraz bağlı kromatini, 25 mikrolitre kromatin immünopresipitasyon dereceli protein G manyetik boncuklarla birleştirin.

Ardından, 10 mikrolitre immünopresipitasyon seyreltme tamponu ve bir mikrolitre proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Dört saatlik inkübasyondan sonra, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne bir ila 10 mikrogram antikor ekleyin. Ve 100 mikrolitrelik son hacme damıtılmış su ekleyin.

Numuneleri uçtan uca bir döndürücüde dört santigrat derecede dört ila 12 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik boncuklar tüpün yan tarafına toplandıktan sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.

Boncukları 800 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Her yıkama için, tüpü birkaç kez ters çevirerek boncukları karıştırın. Ardından, tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yan tarafında toplandıktan sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, aynı prosedürü kullanarak boncukları 800 mikrolitre yıkama tamponu ile bir kez yıkayın. Yıkamalardan sonra, boncukları 50 mikrolitre elüsyon tamponunda tekrar süspanse edin ve numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca uçtan uca bir döndürücüde inkübe edin. Ardından, süpernatanı manyetik stand yardımıyla yeni bir tüpe aktarın.

Çapraz bağlanmayı tersine çevirmek için altı mikrolitre beş molar sodyum klorür ve ardından iki mikrolitre proteinaz K ekleyin. Numuneleri karıştırdıktan sonra, 65 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Bu noktada, numuneler metin protokolünde açıklandığı gibi protein bağlanma bölgeleri için doğrudan analiz edilebilir veya eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. SMAD2'nin SCF promotörüne TGF beta 1 ile indüklenen bağlanmasını doğrulamak için kromatin immünopresipitasyon testi gerçekleştirildi.

TGF beta 1 tedavisi, SMAD2'nin insan karaciğer kanseri hatlarında, HepG2 ve Hep3B'de SCF promotörüne bağlanmasıyla sonuçlandı. TGF beta 1 stimülasyonunun yokluğunda, SMAD bağlanması kaydedilmedi. Pozitif bir kontrol olarak, TGF beta 1 ile indüklenen SMAD aktivasyonu için, PAI-1 için kromatin immünopresipitasyonu gerçekleştirildi.

PAI-1 promotörü, TGF beta ve SMAD'ın bilinen bir hedefidir. SMAD2 immünopresipitasyonunun özgüllüğü, spesifik olmayan IgG antikorlarının kullanılmasıyla doğrulandı. IgG ile immünopresipitasyondan sonra SBE'ye SMAD2 bağlanması kaydedilmemiştir.

STAT3'ün TGF beta ligand genine TGF Beta 1 ile indüklenen bağlanmasını doğrulamak için, TGF beta 1 ile muamele edilen HepG2 ve Hep3B hücreleri kullanılarak kromatin immünopresipitasyon testleri gerçekleştirildi. TGF beta 1 tedavisi, TGF beta geninin ikinci varsayılan STAT3 bağlanma bölgesine STAT3 bağlanması ile sonuçlandı, ancak birincisine değil. Bu örnekte, STB-2'ye pozitif STAT3 bağlanması, dahili bir pozitif kontrol görevi görür.

Diğer kromatin immünopresipitasyon deneyine benzer şekilde, IgG kullanılarak immünopresipitasyondan sonra ST-2'ye STAT3 bağlanması görülmedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa antikora bağlı olarak bir veya iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, laboratuvar güvenlik yönergelerine uymak ve protokolün her adımında son derece doğru olmak önemlidir.

Bu işlem yapılırken MSDS'nin kontrol edilmesi ve eldiven, beyaz önlük ve koruyucu gözlük gibi koruyucu giysilerin giyilmesi gibi önlemler alınmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, spesifik DNA bağlanma dizilerine protein bağlanmasının nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu protokolü takiben, kromatin immünopresipitasyonu ile gösterilen protein DNA bağlanmasının fonksiyonel uygunluğunu doğrulamak için promotör testleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.