Çevresel İpuçlarının Eklem Davranışı Üzerine Etkisini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Bu davranışsal analizinin genel amacı, kur ve çiftleşme gibi üreme davranışları üzerindeki çevresel ipuçlarının etkisini nicelleştirmektir. Bu yöntem, davranış biyolojisi ve nörogenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, üreme davranışları üzerindeki genetik ve çevresel faktörlerin çıkarımı ve bu davranışları modüle eden mekanizmalar gibi.

Bu teknik, üremeyi etkileyen geniş bir çevresel ipucu yelpazesinin test edilmesinde hız ve esneklik sunmaktadır. Üstelik bunu oldukça yüksek sayıda tekrar ile gerçekleştirmektedir. Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Jenke Gorter uygulamalı olarak gösterecektir.

Deneye bir litre zengin sinek besiyeri hazırlayarak başlayın. İki litrelik cam bir behere, içinde manyetik karıştırma çubuğu olacak şekilde bir litre musluk suyu boşaltın. Beheri manyetik ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin.

Karıştırmayı kapalı tutun ve kaynama sıcaklığına ulaşılana kadar ısıyı 300 °C'ye yükseltin. Karıştırmayı 500 rpm hızında açın ve malzemeleri kaynayan suya ekleyin. Mayanın güçlü bir şekilde köpürmesini bekleyin.

Ardından ısıtıcı tabla sıcaklığını 120 °C'ye düşürün. 10 dakika sonra ısıtıcı tablayı 30 °C'ye indirin. Karışım 48 °C'ye soğuyana kadar karıştırmaya devam edin.

Bir termometreyi doğrudan gıdanın içine yerleştirerek sıcaklığı izleyin. İki gram Tegosept'i 10 mililitre %96 ethanol içinde çözün. Karışımı ve beş mililitre bir molar propiyonik asidi beheri ekleyin.

Üç dakika boyunca karıştırın. Bir iğneyi bunzen beki üzerinde kızarana kadar ısıtın. Ve 3,5 santimetreye 1,0 santimetre boyutlarındaki plastik bir Petri kabının üst kısmına 0,3 santimetre çapında bir delik açın.

Kokuya sahip bileşikler içeren besiyeri hazırlanırken, önce deneysel kapların yarısına istenen bileşikten 30 µL pipetle ekleyin. Karşılaştırma yapabilmek için kapların diğer yarısını boş bırakın. Beş ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, kabın tabanını kaplayacak şekilde üç ml besiyeri dökün.

Kontaminasyonu önlemek için üzerine bir tülbent örtün ve besiyerinin oda sıcaklığında bir saat boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından, kapların üzerine kapak kapatın ve kapakları iki yanından bantla sabitleyin. Parafin film parçalarını 0,2 cm kalınlığında rulo haline getirerek kaplardaki delikleri kapatmak için küçük parafin film tıkaçları hazırlayın.

Ardından bunları 0,5 cm'lik segmentler halinde kesin. Septumda, tırtıllı bulkhead bağlantı parçalarının sıkıca oturması için iki küçük delik açın. 4,5 cm'lik açık şişe kapaklarını 0,32 cm kalınlığında bir silikon septum ile donatın.

Küçük PVC tüpü, şişeden çıkan her iki çıkışa ve şişeye giren girişlerden yalnızca birine takın. Ardından, küçük tüpler kullanarak her bir YPD kültür şişesinin çıkışına bir cam tüp takın. Tüpü cam elyaf ile doldurun.

Kullanmadan önce otoklavlayın. Uygun kapakları ve tüpleri alüminyum folyoya sarın. Ardından bunları 120 °C sıcaklıkta ve bir bar basınçta 25 dakika boyunca otoklavlayın.

Steril 100 µL'lik bir pipet ucunu YPD Agar plakasındaki maya kolonilerinden birine daldırın ve ardından Autoclaved YPD sıvı besiyeri şişesinin içine bırakın. Mayalı ve inoküle edilmiş bu YPD sıvı besiyeri şişesini ve maya içermeyen bir YPD besiyeri kontrol şişesini, bir çıkışa monte edilmiş Autoclaved kapaklarla kapatın. YPD besiyerinin mikroorganizmalarla kontamine olmasını önlemek için, plastik geçirmeli gövde boru konnektörü aracılığıyla küçük boruyu, filtreye doğru yönlendirilmiş 0.45 µm'lik steril bir şırınga filtresine bağlayın.

Ardından, filtreden çıkan plastik toplu konnektördeki vidayı sıkın. Sonra hortumu YPD kültür şişesinin girişine bağlayın. Şişeleri ayrı manyetik plakalara yerleştirin.

Deney başlangıcından önce çözeltiyi oda sıcaklığında, 100 rpm hızında 24 saat boyunca karıştırın. Her iki şişenin girişlerini basınçlı havaya bağlı bir tüpe bağlayın. Deneye müdahale edilmesini önlemek için, deney maya şişesinin çıkışını maya kokusunu deney odasının dışına tahliye eden bir tüpe bağladığınızdan emin olun.

PVC tüpü cam tüpün çıkış tarafına takın ve bunu deney kutusunun alt deliklerine doğru yönlendirin. Dış çapı 0,5 cm'ye eşit veya daha büyük olan bir T-konnektör ve kısa küçük PVC tüp parçaları kullanarak, her iki taraftaki iki çıkışın her birine iki serolojik pipet takın. Pipetleri çelik kutu içindeki kameraların altındaki beyaz kağıt tabakasına düz bir şekilde bantlayın.

ZT altı saatinde, bir ağız pipeti kullanarak bir deney dişisini küçük bir Petri kabına yerleştirin. Sineğin çiftleşme alanına bir saat boyunca alışmasına izin verin. Bir saat sonra, ZT yedi saatinde, petri kabına vahşi tip bir erkek aktarın.

Ardından 24 saat boyunca izleme yapmak için Start Monitoring'e tıklayın. Hava pompası deneyi için, petri kabını bir pipet ucunun çiftleşme alanının giriş deliğine bağlanacağı şekilde yerleştirin. Çiftin çiftleşme davranışını analiz etmek için, bir görüntü görüntüleme yazılımında tüm resimleri aç seçeneğini belirleyin.

Ve bunları kronolojik sırayla sayfalarına bakın. Tarihi, deney numarasını, kap numarasını ve başlangıç saatini aynı satır içinde bir hesap çizelgesine kaydedin. Her bir arenanın başlangıç saatini, web kamerası altına yerleştirildiği andan itibaren alın.

Resimlerdeki zaman damgasını kaydedin. Her bir kopülasyonun başlangıç zamanını aynı satıra, hesap çizelgesine işaretleyin. Erkeğin dişek üzerine çıktığı ve çiftin en az beş ardışık kare boyunca orta derecede hareketsiz ve aynı pozisyonda kaldığı durumları tek bir çiftleşme olayı olarak sayın.

Gıda ortamından ayrılmış maya havasının analizi, gıda ortamında maya bulunmadığında çiftleşme çiftinin maya kokularına yanıt vermediğini göstermektedir. Ancak, gıda ortamına maya da eklendiğinde, maya havasındaki çiftleşme sıklıkları artmaktadır. Dişi alıcılığı, Asetik Asit varlığında artmaktadır.

Ancak bu durum sadece ortamda Peptone bulunduğunda gerçekleşmekte, bu da sineklerin çiftleşme sıklıklarını artırmak için Amino Asitleri ve Asetik Asidi aynı anda algılamaları gerektiğini göstermektedir. Bu teknik bir kez öğrenildiğinde, kurulumu altı saatte tamamlanabilir. Davranışsal analiz ise düzgün bir şekilde yapıldığında beş saat içinde gerçekleştirilebilir.