Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Bu metodolojinin genel amacı, dendritik morfolojiyi ve karmaşıklığı incelemek ve ölçmek için beyin dokusunu düzgün bir şekilde Golgi boyamaktır. Bu yöntem, sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Golgi boyama sadece küçük bir hücre alt kümesini boyadığından, bu teknik nöronların yapısını izlemek için kullanılabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, beyin bölümlerinin herhangi bir yıkama adımı sırasında kuruma veya düşme riski olmadan kolayca lekelenebilmesidir. Prosedürü gösteren, Dr.Allen'ın laboratuvarındaki yüksek lisans öğrencileri Fred Kiffer, Tyler Alexander ve Julie Anderson olacak. Taze hasat edilmiş, sabitlenmemiş kemirgen yarım beyinlerini beş mililitre veya cıva klorür bazlı çözeltiye batırarak başlayın.

Cıva klorür çözeltisi ışığa duyarlı olduğundan, tüpü folyo ile örtün. Numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. Ertesi gün, biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına uygun şekilde atmadan önce çözeltiyi yavaşça geçici bir kaba boşaltın.

Beş mililitre taze cıva klorür çözeltisi ekleyin ve beyinlerin daldırıldığından emin olun. Numuneleri 13 gün daha oda sıcaklığında karanlığa geri koyun. 14 gün sonra, 90 mililitre damıtılmış veya deiyonize suya, DH2O'ya 30 gram güçlendirilmiş emprenye sonrası tampon ekleyerek emprenye sonrası tamponu hazırlayın.

Altı oyuklu plakanın her bir oyuğunu, beyin başına bir tane olmak üzere 6,5 mililitre emprenye sonrası tamponla doldurun. Ardından, cıva klorür çözeltisini daha önce olduğu gibi beyin dokusundan çıkarın. Dokuyu DH2O ile durulayın, daha sonra dokuyu emprenye sonrası tampon ile altı oyuklu plakalara aktarın.

Plakaları folyo ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. Ertesi gün, emprenye sonrası tamponu aspire edin ve değiştirin. Plakayı tekrar örtün ve dört santigrat derecelik bir buzdolabında saklayın.

Önce kapaklarındaki plakaları soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru artan sırayla etiketleyerek beyin başına iki veya üç adet 12 oyuklu plaka hazırlayın. Bölümlere ayrılan beynin kimlik numarasını ekleyin. Her bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre 1X PBS pipetleyin, ardından sahneyi kurun ve vibratomu açın.

Ardından, numune tutucunun doku bloğuna bant koyun ve üstüne biraz siyanoakrilat yapıştırıcı ekleyin. Altı oyuklu plakadan bir beyin çıkarın ve plastik veya cam bir tabağa koyun. Beyinciğin kaudal olarak kesilmesi için paslanmaz çelik çift kenarlı bir bıçak kullanın ve beyinciğin beyinde kalan kısmının düz olduğundan emin olun.

Ardından, kalan beyinciğin düz yüzeyini tutkalın üzerine yerleştirin. Yapıştırıcı kuruduktan sonra, numune tutucuyu doku ile birlikte numune banyosuna yerleştirin. Numune banyosunu vibratom üzerine yerleştirin ve doku numunesini PBS'de kaplayın.

Ardından, bıçağı vibratomun bıçak tutucusuna takın ve bıçağı tamamen suya batırana ve dokunun üst kısmının biraz altına düşene kadar yavaşça numune banyosuna indirin. Ardından, vibratom hızını yediye, genliği altıya ve kesme açısını 12 dereceye ayarlayın. Titreşimi başlatın ve 200 mikronluk bölümleri kesin.

Doku bölümlerini numune banyosundan 12 oyuklu plakaların belirlenmiş her birine taşımak için büyük bir boya fırçası kullanın. İstenilen doku kesiti sayısına ulaşılana kadar dokuyu kesmeye devam edin. Bölümlere ayrıldıktan sonra, PBS'yi 12 oyuklu plakanın kuyucuklarından aspire etmek için bir transfer pipeti kullanın, ardından iki mililitre PBS-T ekleyin ve çalkalama ile 30 dakika yıkayın.

Yıkama süresinin sonuna doğru, üç kısım amonyum hidroksit çözeltisini beş kısım DH2O ile seyreltin. Ardından, PBS-T'yi çıkardıktan sonra, seyreltilmiş amonyum hidroksit çözeltisini ekleyin. Folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bölümleri 19 ila 21 dakika boyunca boyayın.

Ardından, amonyum hidroksit çözeltisini güvenli bir şekilde çıkardıktan sonra, boyama sonrası tampon ekleyin. Folyo ile koruyun ve 19 ila 21 dakika daha lekeleyin. Son olarak, PBS-T'deki bölümleri her seferinde beş ila 10 dakika boyunca üç kez durulayın.

Bölümleri büyük boya fırçası ile %1 jelatin kaplı slaytlara monte edin. Oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika kurumaya bırakın, ardından bir Coplin Kavanozuna koyun ve bir gece bekletin. Slaytları Coplin Kavanozundan çıkarın ve çeker ocaktaki plastik bir rafa yerleştirin.

Beş dakika boyunca% 100 etanol içeren bir boyama kabına koyun. Bölümleri iki adet beş dakikalık etanol yıkama ile kurutun. Ardından, slaytları bir cam rafa yerleştirin ve rafı %99 ksilen içeren bir cam boyama kabına indirmek için metal bir tutamak kullanın.

Slaytları her biri beş dakika boyunca iki ksilen değişiminde yıkayın. İkinci yıkama süresi geçtikten sonra, slaytları teker teker ksilenden çıkarın ve dokuyu yaklaşık 0.25 mililitre montaj ortamı ile hızlı bir şekilde örtün. Ardından, bir slayt kapağı alın ve ortamın üzerine yerleştirin.

Sürgülü kapakların altında sıkışan hava kabarcıklarını, boya fırçasının ucu gibi keskin olmayan bir nesneyle kenara doğru itin. Slaytları doğrudan güneş ışığı almayan bir alana yerleştirin ve iki ila üç gün kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, mikroskop kullanarak görüntü elde etmeye ve uygun yazılımla analiz etmeye devam edin.

Bu parlak alan görüntüsü, görüntüleme ve daha fazla analiz kriterlerini karşılayan Golgi lekeli bir nöronu göstermektedir. Her üç omurga tipi de rahatlıkla görülebilir. Boyama, dendritin tüm uzunluğu boyunca tutarlıdır ve dendrit diğer nöronlardan izole edilir.

Bu şekil, Dentate Gyrus içindeki Golgi lekeli nöronların, salin ile tedavi edilen gruba kıyasla 5-florourasil tedavisini takiben dördüncü ve altıncı dereceden uzunlukta azalma gösterdiğini göstermektedir. Golgi boyama, omurga yoğunluğundaki önemli farklılıkları tespit etmek için kullanılabilir. CA1 apikal piramidal dendritlerde, canlı farelere 5-florourasil uygulaması omurga yoğunluğunu önemli ölçüde azaltmıştır.

Bazal dendritlerde, omurgaların genel yoğunluğunda önemli bir değişiklik olmamıştır. CA1 apikal piramidal dendritlerin Sholl Analizi, 5-florourasil tedavisinin soma dan 40 ila 160 mikron arasındaki mesafelerde dendritik arborizasyonu önemli ölçüde azalttığını ortaya koydu. Bazal dendritlerde, 5-florourasil tedavisi, dendritik arborizasyonu soma bölgesinden 30 ila 110 mikron uzakta azalttı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hem Golgi boyama işlemini hem de montaj, temizleme ve kaplamayı hesaba katan bu teknik, uygun şekilde yapılırsa beyin başına üç saat içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların bir fare modelinde nöroanatomik bağlantıları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü denerken, nöronları aşırı lekelememek için bölümleri amonyum hidroksit çözeltisinde sadece 19 ila 21 dakika tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, beyin dokusunu nasıl düzgün bir şekilde lekeleyeceğinizi, bölümlere ayıracağınızı ve durulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Cıva klorür bazlı çözelti, amonyum hidroksit çözeltisi ve ksilen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle önlem alın ve bu prosedürü gerçekleştirirken laboratuvar eldivenleri giyin ve çeker ocakta çalışın.