Name: Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Öğrenin Golgi-Cox boyama yöntemiyle yaşlı farelerde hipokampal dendritik karmaşıklığı değerlendirmeyi. Bu protokol sinirbilim araştırmalarında nöron morfolojisini yüksek kalitede incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH P20 GM109005 (ARA) kapsamında bir pilot yardım ve Translational Neuroscience IDeA Programı ödül P30 GM110702 tarafından desteklenmiştir.

Denemeler, UAMS &#39;da Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak yürütülmüştür. 1. Hayvanlar ve 5-Fu Enjeksiyon Paradigması <ol><li> 6 aylık erkek C57Bl6 / J vahşi tipli fareler satın alarak bunları 1 yaşına gelene kadar sabit 12 saat aydınlık / karanlık döngü içinde yerleştirin. </li><li> 5-Fu&#39;yı% 0.9 steril tuzlu suda inceltin. Fare başına gerekli doz olarak 60 mg / kg kullanın. </li><li> 5-Fu&#39;nun intraperitoneal enjeksiyonlarını yapın (haftada bir kez üç hafta boyunca). <ol><li> Her gün aynı periyotta intraperitoneal enjeksiyonları verin. Örneğin, saat 09.00-1200 arasında. </li></ol></li><li> Hayvanları durdurun ve son enjeksiyondan 30 gün sonra beyinlerini alın. </li></ol> 2. Ötenazi Prosedürü ve Beyin Çıkarma <ol><li> Kemirgenleri sıkın ve kuyruk tabanı tutun. Öte yandan başparmak ya da parmağınızıKemirgen hayvanının boynu tabanı. Kemiricinin boynuna hızla baskı uygulayın ve diğer eliniz kuyruk tutarken geriye doğru çekin. </li><li> Kemirganı bir elinizle ve büyük makas makinesini diğeri ile tutun. Kemirgenlerin boynunu iki bıçak arasına yerleştirin ve kafayı çabucak kesin. </li><li> Kopmuş fare kafasını kaldırın ve kafatasının üstündeki kürkü düzeltmek için ince makasları kullanın. Daha sonra, makasın uçlarını her bir göz soketine yerleştirin ve hafifçe kuvvetle makarayı kapatın. </li><li> Serebellumun sağında ve solunda kafatasını kesmek için yaylı makas kullanın. </li><li> Serebellumu çevreleyen kafatasının bir kısmını yukarı kaldırıp kaldırmak için forseps kullanın. </li><li> Kafatasının midsagittal çizgisini kesmek için makas kullan. </li><li> Kafatasının kalan kısmını beyinden kaldırmak için forseps kullanın. </li><li> Beyni istenilen kaba koymak için bir spatula ve bir sonda kullanın. Paslanmaz çeliktenTeel bıçakla, her beyin midsagital düzlem boyunca kes. Sağ hemisferlerde aşağıdaki Golgi-Cox yöntemini uygulayın. </li></ol> 3. Golgi Boyama ve Doku Hazırlama <ol><li> Yeni hasat edilen yarım beyinleri, 10 mL&#39;lik konik bir tüpteki 5 mL cıva klorür esaslı çözeltiye (kitten çözelti A) daldırın. Cıvalı klorür çözeltisi ışığa duyarlıdır; Tüpü folyo ile örtün. Numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta saklayın. NOT: Çözüm A, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmıştır. Dikkat! Çözelti A (ayrıca civalı klorür çözeltisi olarak da adlandırılır), potasyum dikromat, mercurik klorür ve potasyum kromat gibi toksik reaktifler içerir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. </li><li> 1 gün sonra solüsyonu geçici bir kaba (büyük bir tartım botu gibi) yavaşça boşaltın ve bir biyolojik tehlikeli atık kabına atın. Beyinlerini (orijinal 10 mL konik tüplerde hala) 5 mLMercurik klorür solüsyonu ilave edin ve numuneyi oda sıcaklığında 13 gün daha karanlığa döndürün. </li><li> 90 ml damıtılmış veya deiyonize suya (dH20) 30 g emdirme sonrası tampon ekleyin. 6 oyuklu bir tabakın her kuyucuğunu 6.5 ml&#39;lik post-emprenye tamponuyla, beyne göre birer tane doldurun NOT: Emdirme sonrası tampon maddesi, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmaktadır. <ol><li> Cıva klorür solüsyonunda 14 gün sonra (toplamda), dokuyu dH20 ile durulayın, daha sonra emdirme sonrası tamponla birlikte 6 gözlü plakalara aktarın. Tabakları folyo ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. </li></ol></li><li> 1 gün daldırıldıktan sonra emprenye sonrası tampon maddeyi pipetleyin ve yeni emdirme sonrası tampon ile yenileyin; Oda sıcaklığında karanlıkta 1 gün saklayın. Gerekirse, bunu 1 aya kadar 4 ° C&#39;de saklayın 22 . </li></ol> 4. Kesit alma <ol><li> Kapaklardaki 12 yuvalı plakları, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya artan sırayla numaralandırın. </li><li> Beynin her birine bölünürse, beyin başına iki ya da üç 12 plakalı tabak hazırlayın. <ol><li> Her bir 12 bölmeli plakanın üst kısmını, kesit alan beyin tanımlama numarası ile etiketleyin. </li><li> Her plakanın her kuyusuna 2 mL 1x PBS pipetleyin. </li></ol></li><li> Sahneyi kurun ve vibratome&#39;yu açın; Dokuyu kapatacak kadar kapta yeterli 1x PBS bulunduğundan emin olun. <ol><li> İki parça plastik parafin filmi kesin ve iki kat daha katlayın. 1x PBS&#39;nin sayaca sızmasını önlemek için numune tutacağı çıkıntılarının deliklerine yerleştirin. </li><li> Şişeyi örnek tutucunun doku bloğuna koyun ve sonra siyanoakrilat yapışkan tutkalı (malzeme tablolarına bakın) koyun. </li></ol></li><li> Beyni 6 kuyucuklu plakadan çıkarın ve bir plastik veya cam tabak üzerine koyun. Paslanmaz çeliktenSerebellumun yarısını kesmek için çelik iki kanatlı bıçak. <ol><li> Serebellini kaudally kesin. Kalan kalan serebellinin bile eşit olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Geri kalan serebellumun düz yüzeyini tutkal üzerine derhal yerleştirin. NOT: Dokunun dorsal kısmı (serebral korteks) bıçağın sağına veya sağına bakmalıdır. Daha önce koku alma ampulünün bulunduğu rostral uç yukarı bakmalıdır. <ol><li> Tutkalın tamamen kurutulduğundan emin olmak için en az birkaç dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Beyni yerinde tutan yapışkan kuruysa da numune banyosuna 1x PBS dökün. Tutkal kuruduktan sonra numune tutacağını doku ile birlikte numune banyosuna yerleştirin. <ol><li> Doku örneği tam olarak kaplanmamışsa, numune banyosuna 1x PBS daha dökün. </li></ol></li><li> Bıçağı, vibratomun bıçak tutucusuna ve yavaşça l1x PBS&#39;ye tamamen batıncaya kadar bıçağı numune banyosuna geçirin. Bıçağı, dokunun üstünün biraz altına düşene kadar indirmeye devam edin. </li><li> Vibrasyon hızı 7&#39;ye, genliği 6&#39;ya ve kesme açısını 12 °&#39;ye ayarlayın (vibratome model için malzeme tablosuna bakın). Titreşimi başlatın ve 200 μm kesitleri kesin 23 . <ol><li> Doku bölümlerini numune banyosundan 12 oyuklu plakaların belirlenmiş her bir oyuğuna taşımak için büyük bir fırça kullanın. </li></ol></li><li> İstenen sayıda doku kesitine ulaşana kadar dokuyu kesmeye devam edin. </li></ol> 5. Post-boyama <ol><li> Aşağıdaki boyama adımları ve durulamalar için her biri için belirtilen çözeltiden 2 mL kullanın. Çözümleri oyuklara aktarmak için motorlu bir pipet dolgusu kullanın (materyal tablosuna bakın). Çözümleri kuyulardan ve uygun atıklara aktarmak için bir transfer pipeti (bkz. Malzeme tablosu) kullanınkonteynerler. </li><li> Parçaları 0.01 M PBS-T&#39;nin bir 30 dakika yıkamasında durulayın (3.0 mL deterjan ekleyin (materyal tablosuna bakın) 1000 mL 0.01 M PBS&#39;ye ekleyin). </li><li> Amonyum hidroksit solüsyonunu (Dikkat) 3: 5 oranında dH20 ile seyreltin, kullanımdan hemen önce. Seyreltilmiş amonyum hidroksit solüsyonundaki kısımları 19-21 dakika boyunca boyayın. <ol><li> Işık hassas amonyum hidroksit solüsyonunu folyo ile koruyun. NOT: Çözeltideki amonyum hidroksit konsantrasyonu ~% 10&#39;dur ve &quot;tehlikeli&quot; olarak sınıflandırılmıştır. Amonyum hidroksit çözeltisi deriyle temas halinde yanıklara neden olabilir. Solunduğunda solunum borusu tahrişine neden olabilir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. </li></ol></li><li> Bölümleri, boyama sonrası tamponda boyayın (19 dakika boyunca 21 dakika boyunca 500 mL dH20 içinde 90 g reaktif D ekleyin). Boyama sonrası tampon ışığa duyarlıdır; Folyo ile koruyun 22 . </li><li> Kesitleri üç, 0.01 M PBS-T&#39;nin 5-10 dk yıkaması. </li></ol> 6. Montaj, Temizleme ve Kaplama <ol><li> Büyük fırça ile% 1 jelatin kaplı slaytlara bölümleri monte edin. Oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca kurumalarını bekleyin ve sonra gece boyunca bir Coplin kavanozuna koyun. </li><li> Eldivenleri eldivenli ellerle Coplin kavanozundan çıkarın ve plastik bir rafa koyun (materyal tablosuna bakın). Plastik rafı% 100 etanol içeren boyama kabına (bkz. Malzeme tablosu) yerleştirin. Onları üç tane 5 dk yıkayarak kurutun. </li><li> Slaytları, her biri% 99 ksilen içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Sürgüleri bir cam rafa yerleştirin ve rafı, metal saplı ksilen içeren bir cam boyama kabına indirin (bkz. Malzeme tablosu). NOT: Dikkat, ksilen inhale edildiğinde zararlıdır ve deriye dokunursa tahrişe neden olur. Sıvı ve buhar hallerinde son derece yanıcıdır. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. </li><li> Slaytları xyl&#39;den kaldırEne birer birer alın ve dokuyu ~ 0.25 mL montaj medyasıyla hızlıca kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Daha sonra, slayt kapaklarını alın ve onları ortamın üzerine koyun. <ol><li> Kapakların altındaki sıkışmış hava kabarcıklarını, bir fırça sonu gibi kör bir nesneyle kenara itin. </li></ol></li><li> Slaytları güneş ışığından uzak bir alana yerleştirin ve 2-3 gün kurumalarını bekleyin. </li><li> Bir mikroskop kullanarak görüntü elde etmeye ve uygun yazılımla analiz etmeye devam edin. </li></ol> 7. Görüntü Yığını Edinme <ol><li> Görüntüleme programını açın (bkz. Malzeme Tablosu ). Slayt mikroskop sahnesine yerleştirin. Programın üst kısmındaki menüde, &quot;Edinme&quot; yi tıklayın ve ardından &quot;Canlı Resim&quot; i tıklayın. </li><li> Mikroskopu 10X yapın. Tercih nöronunu belirleyin ve ardından kırmızı bir X gibi görünen imleci soma&#39;nın merkezine getirin. Referans noktasını ayarlamak için sol tıklayın. </li><li> Mikroskopu 40X yapın. Programın üst kısmındaki menüden &quot;Taşı&quot; yı tıklayın ve ardından &quot;Referans Noktasına&quot; tıklayın. </li><li> Odak dışına gelene kadar dokunun üzerindeki ince objektifi elle kaydırarak görüntü yığını oluşturmaya başlayın. <ol><li> &quot;Image Acquisition&quot; başlığı altındaki programın sağ alt köşesindeki &quot;Üstü Ayarla&quot; yı tıklayın. </li><li> Dokudan biraz dışarı doğru kaydırın ve ardından &quot;Resim Alma&quot; altındaki &quot;Altını Ayarla&quot; yı tıklayın. Ardından, &quot;Görüntü Yığını Al&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> Görüntü yığını edinildikten sonra, görüntülenen pencerede görüntü dosyası için istediğiniz adı yazın. &quot;MBF Ascii dosyası&quot; olarak kaydedin. <ol><li> İstendiğinde, dosya türünü &quot;MBF JPEG2000 yığın dosyası&quot; olarak seçin ve ardından &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li></ol></li></ol> 8. Nöronal İzleme <ol><li> Toolba&#39;daR menüsünün altındaki &quot;Kontur Adı&quot; başlıklı kutuyu tıklayın. Açılır menüden &quot;Soma&quot; yı seçin. </li><li> Elle soma izini almak. Ardından sağ tıklayın ve izleme tamamlandığında &quot;Cell Body&#39;yi Sonlandır&quot; ı seçin. </li><li> &quot;AutoNeuron Workflow&quot; başlıklı başka bir sekme açmak için &quot;AutoNeuron&quot; u seçin. </li><li> &quot;Yapılandırma Türü&quot; nin altında &quot;Yeni&quot; yi seçin. Parametreleri ayarlayın ve &quot;Soma Algılama&quot; alt başlığını getirmek için &quot;Sonraki Adım&quot; ı tıklayın. <ol><li> Parametreleri ayarlamak için &quot;Parlaklık Alanı&quot; nı seçin. Ardından, &quot;Maksimum İşlem Çapı&quot; altında, &quot;Ölçüm Başlat&quot; ı tıklayın. İmleci kullanarak, dendritin tabanına gidin ve elle çapı ayarlayın. </li></ol></li><li> Kullanıcının tüm görüntüyü izlemesini isteyen pencerede &quot;Evet&quot; seçeneğini tıklayın. Elle soma izini almak. &quot;Tohum Yerleşimi&quot; alt başlığını getirmek için Tıklayın ve ardından &quot;Sonraki adım&quot; a tıklayın. </li><li> &quot;Doğrulama Tohumunu&quot; tıklayınS &quot;yazıp&quot; Next Step &quot;e basarak&quot; Neuron Reconstruction &quot;alt başlığını getirin. </li><li> &quot;Neuron&quot; altında, &quot;Etkileşimli&quot; yi tıklayın. Dendritlerin programındaki yönergeleri izleyerek ve program tarafından izlenen vurgulanan alanı tamamlamak için sağ tıklayarak etkileşimli izlemeyi gerçekleştirin. Tüm dendritleri izledikten sonra &quot;Sonraki Adım&quot; ı tıklayın. </li><li> Yeni bir pencere göründükten sonra, yeni konfigürasyonu istediğiniz başlık ile kaydedin. &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li></ol> 9. Analiz <ol><li> Analiz programını açın (materyal tablosuna bakın). </li><li> Üst menüden &quot;Dosya&quot; yı tıklayın ve ardından &quot;Veri Dosyasını Aç&quot; ı tıklayın. İlgilenilen dosyayı seçin. </li><li> Analiz alt başlığı altında, &quot;Sholl Analizi&quot; ni seçin. </li><li> &quot;Sholl Analysis&quot; penceresinde başlangıç ​​yarıçapını 10 μm olarak ayarlayın. &quot;Analiz&quot; altında, &quot;Dendritler&quot; ve &quot;Şube Siparişleri&quot; kutularını tıklayın. </li><li> Sağ clYeni açılan pencereleri tıklayın ve &quot;Excel Dışa Aktar&quot; ı tıklayın. &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Analizde &quot;Dallanmış Yapı Analizleri&quot; ni tıklayın. &quot;Tüm Olası Analizler&quot; i seçin. </li><li> Yeni açılan pencereyi sağ tıklatın ve &quot;Excel Dışa Aktar&quot; ı tıklayın 24 . </li></ol>

<ol><li>Stuart, G. J., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+integration%3A+60+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic integration: 60 years of progress.</a> Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
<li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Dynamics+of+Dendritic+Spines+in+Memory+and+Cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition.</a> Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).</li>
<li>von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+dendritic+spines+within+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure and function of dendritic spines within the hippocampus.</a> Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Bourne, J. N., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+structure+and+function+at+hippocampal+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines.</a> Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).</li>
<li>Lai, K. O., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%3A+the+underlying+mechanisms+and+its+dysregulation+in+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).</li>
<li>Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+development%2C+and+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Op+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure, development, and plasticity of dendritic spines.</a> Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>Harris, K. M., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines%3A+cellular+specializations+imparting+both+stability+and+flexibility+to+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function.</a> Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).</li>
<li>Leuner, B., Shors, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+anxiety%2C+and+dendritic+spines%3A+what+are+the+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections.</a> Neuroscience. 251, 108-119 (2013).</li>
<li>Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+dendritic+spine+synapses+during+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).</li>
<li>Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12850432">Structure-stability-function relationships of dendritic spines.</a> Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Koyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.oapublishinglondon.com/images/article/pdf/1397256114.pdf">The unending fascination with the Golgi method.</a> OA Anat. 1 (3), 24(2013).</li>
<li>Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/46234">On the "selectivity" of the Golgi-Cox method.</a> J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Rosoklija, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Golgi+methods+for+impregnation+of+brain+tissue+from+humans+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys.</a> J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).</li>
<li>de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal%3A+lessons+on+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Cajal: lessons on brain development.</a> Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22single%22+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+staining+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox staining step by step.</a> Front Neuroanat. 10 (38), (2016).</li>
<li>superGolgi Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf">http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf">https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf</a> (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Neurolucida+11.03%22">Neurolucida 11.03</a>. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).</li>
<li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+in+the+neurons+of+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Pillai, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+of+hippocampal+and+amygdalar+neurons+in+adolescent+mice+is+resilient+to+genetic+differences+in+stress+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li>
<li>Morley, B. J., Mervis, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+alterations+in+the+hippocampus+and+parietal+cortex+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice.</a> Neuroscience. 233, 54-63 (2013).</li>
<li>Titus, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypobaric+hypoxia-induced+dendritic+atrophy+of+hippocampal+neurons+is+associated+with+cognitive+impairment+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats.</a> Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).</li>
<li>Groves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluorouracil+chemotherapy+upregulates+cytokines+and+alters+hippocampal+dendritic+complexity+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice.</a> Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).</li>
<li>Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Golgi+analysis+method+for+efficient+and+unbiased+classification+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Daha modern tekniklerle karşılaştırıldığında, Golgi-Cox yöntemi, omurga morfolojisini incelemek için tercih edilen yöntem olan çeşitli avantajlara sahiptir: 1) Boyama esasen herhangi bir doku için kullanılabilir 2) Basit bir ışık mikroskopu kurulumu, 3) Golgi-Cox görüntüleme konfokal görüntülemeden daha hızlıdır ve 4) Golgi lekeli bölümler birkaç ay ila yıllarca floresanla işaretlenmiş örneklerden daha uzun süre yaşayabilir. Bu avantajlarla bile, Golgi-Cox yönteminin hala bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, tüm süreç...

<html> Dendritler, presinaptik girdi 1&#39;i alan ve işleyen nöronların en büyük kısmıdır. Dendritik süreçleri, proksimal dalların distal dallardan daha büyük bir çapa sahip olduğu karmaşık bir geometriye sahiptir. Dendritler geliştikçe, dendritik arborizasyon olarak adlandırılan bir süreçte diğer nöronlarla birkaç bağlantı oluştururlar. Bu dallanma miktarı ve paterni, bir dendrite&#39;nin 2&#39;yi yeterince işleyebildiği sinaptik girdilerin miktarını belirler. Dendritik koordinasyon, aktiviteye bağlı plastisite ve nöronal devrelerin düzgün gelişimi için gerekli bir süreçtir. Uzatma, geri çekme, dallanma ve sinaptojenez intrensek genetik programlar ve ekstrensek faktörlerden etkilenen karmaşık süreçlerdir. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilirF &quot;&gt; 3 , 4. Dendritik karmaşıklıktaki değişiklikler patofizyolojik ve davranışsal değişikliklerle ilişkilidir 5. Anormallikler Kırılgan X Sendromu ve Down Sendromu 6 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Dendritik omurgalar, merkezi sinir sistemi içinde heyecan verici girdiler alan dendritik arbelerin uzmanlaşmış subselüler bölmeleridir. Dendritik dikenlerin üç morfolojik sınıfı vardır, her sınıfa boyutları ve şekilleri temel alınarak adı verilmiştir: 1) diğer dikenlere göre daha fazla glutamat reseptörü ile kompleks postsinaptik yoğunluklara sahip olan mantar dikenleri; 2) kökten yoksun sağlam dikenler; Ve 3) uzunlamasına dar bir gövdeden ve küresel bir baştan oluşan ince dikenler. Dendritik omurga hacmi, onları kısmen tanımlamak için kullanılır; genellikle küçük ince dikenler (0.01 μm3 </sup&gt;) Mantar omurgalarına kıyasla (0.8 μm 3 ) 9 , 10 . Omurgalar olgunlaşma ile dengelenir. Örneğin, ince dikenler birkaç gün sonra geri çekilir veya mantar omurgalarına dönüşür. Alternatif olarak, mantar dikenleri nispeten kararlıdır ve uzun süre hayatta kalabilir. Nöronal bağlantıların kuvvetinin dikenlerin sayısına ve / veya hacmine 11 , 12 , 13 dayalı olduğu düşünülmektedir. Klasik Golgi boyama yöntemi ve daha modern varyasyonları, dendritik omurga morfolojisi ve yoğunluğunu incelemek için kullanışlıdır. Golgi boyamasının benzersiz bir özelliği, rasgele toplam nöronların% 5&#39;ini lekelediğidir, bu da bireysel nöronların izini sağlar 14,15. Golgi metasının tam mekanizması olsa daOd lekeleri bireysel nöronlar hala bilinmemektedir, yöntemin prensibi, gümüş kromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17&#39;nin kristalleşmesine dayanmaktadır. Golgi yönteminin üç ana türü vardır: hızlı Golgi, Golgi-Cox ve Golgi-Kopsch 18 , 19 . Her üç yöntem de birkaç gün ila aylarca krom tuzlarında ilk inkübasyon evresi ile başlar ancak aralarında bazı önemli farklar vardır. Hızlı Golgi, ilk aşamada osmiyum tetroksit kullanırken, Golgi-Kopsch paraformaldehid içerir. Hem hızlı Golgi hem de Golgi-Kopsch boyama sonrasında, yaklaşık% 7 oranında,% 1-2 gümüş nitrat solüsyonunda inkübe edilir. Golgi-Cox yöntemi gümüş nitrat yerine mercurik klorür ve potasyum dikromat kullanır ve 2-4 hafta süreyle emprenyasyon süresine sahiptir. Dokular daha sonra kesitlendirilir ve seyreltilmiş amonyakÇözeltiyi, ardından tuzları gidermek için bir fotoğrafik düzeltici uygulayın. Üç tipten Golgi-Cox yönteminin, kısmen arka plana müdahale etmeden dendritik aplikleri boyamakta en iyi olduğu düşünülmektedir, çünkü kısmen kristal yapılar doku yüzeyinde oluşmaz (hızlı Golgi yönteminde olduğu gibi) 17 , 20 , 21 . Mevcut yöntem, ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün hafif bir varyasyonudur ve nispeten düşük bir dozda 5-Fu&#39;nın dendritik morfolojik özellikleri ve omurganın yoğunluğunu nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır. Elde edilen veriler, kemoterapötik tedavinin nöronal devreleri nasıl etkilediği konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>superGolgi Kiti&nbsp;</td><td>Bioenno Yaşam Bilimleri</td><td>30100</td><td>&nbsp; Tehlikeli maddeler içerir.</td></tr><tr><td>PBS 10x toz konsantresi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&nbsp;</td><td>Balıkçı&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü kapak&nbsp;</td><td>Balıkçı&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Transfer pipeti&nbsp;</td><td>Küre Bilimsel&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Falcon tüpleri&nbsp;</td><td>BD Biyobilimler & nbsp;</td><td></td><td></td>352099</tr><tr><td>Folyo&nbsp;</td><td>Balıkçı&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>BD Biyobilimler & nbsp;</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>200 geçirmez Etanol &</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen&nbsp;</td><td>Acros Organik&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>Tehlikeli.</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serolojik pipet Sigma</td><td></td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom ve nbsp;</td><td>Dünya Hassas Aletler&nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Erkek Fare&nbsp;</td><td>Jackson Laboratuvarı&nbsp;</td><td></td><td></td>000664</tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>Multiple bileşenleri, ayrıntılar için web sitesine bakın.</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc Kamera</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Kabı, Yeşil</td><td>Mendil-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Kabı Seti&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu Pipet Doldurucu&nbsp;</td><td>Balıkçı&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>Nörolucida&nbsp;</td><td>mbf Biyobilim&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Kaşifi&nbsp;</td><td>mbf Biyobilim&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prizma&nbsp;</td><td>Grafik Defteri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yaşlı bir farede hipokampal dendritik karmaşıklığın golgi-cox yöntemi ile değerlendirilmesi

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritik dikenler, eksitatör sinapslar içeren nöronal dendritik millerin çıkıntılarıdır. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilir. Golgi boyama için çeşitli yaklaşımlar vardır, bunların hepsi dendritik alandların morfolojik özelliklerini belirlemek ve belirgin bir arka plan oluşturmak için kullanışlıdır. Mevcut Golgi-Cox yöntemi (ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün ufak bir varyasyonu), kemoterapötik ilaç olan 5-flurouracil&#39;in (5-Fu) nispeten düşük dozunun dendritik morfolojiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır , Omurganın sayısı ve hipokampüs içindeki işlenmesi karmaşıklığı. 5-Fu, dendritik karmaşıklığı önemli derecede modüle etti ve bölgeye özel bir şekilde, hipokampustaki omurga yoğunluğunu azalttı. Sunulan veriler, Golgi boyama yönteminin efOlgun nöronları, CA1, CA3 ve hipokampus diş açısı (DG) lekelemiştir. Bu protokol, diğer araştırmacıların beyne dokuları yüksek kaliteli sonuçlar ve minimum sorun giderme ile güvenilir şekilde boyayabilmesi için her adımın ayrıntılarını bildirir.

5-Fu işleminin, Golgi ile boyanmış beyin bölümlerinin hipokampusundaki dendritik taşlama ve kompleksite üzerindeki etkileri, ticari olarak mevcut bir görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirildi ve izlendi. İzlemeden sonra, dendritik kabarcıklanma, omurga yoğunluğu ve omurga morfolojisi Sholl analizi ve dendritik karmaşıklık indeksi (DCI) kullanılarak analiz edildi. Sholl analizi, dendritik çember morfolojisini belirlemek için kullanılan nicel bir analitik yöntemdir25. Soma&#39;dan ...

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Bu metodolojinin genel amacı, dendritik morfolojiyi ve karmaşıklığı incelemek ve nicelleştirmek amacıyla beyin dokusunu uygun şekilde Golgi ile boyamaktır. Bu yöntem, nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Golgi boyama yalnızca küçük bir hücre alt kümesini boyadığı için, bu teknik nöronların yapısını izlemek için kullanılabilir.Bu tekniğin temel avantajı, beyin kesitlerinin yıkama basamakları sırasında kuruma veya yerinden çıkma riski olmadan kolayca boyanabilmesidir. Prosedür, Dr. Allen'ın laboratuvarındaki lisansüstü öğrenciler Fred Kiffer, Tyler Alexander ve Julie Anderson tarafından gösterilecektir. Taze olarak alınan, fikse edilmemiş kemirgen yarım beyinlerin beş mililitre cıva klorür bazlı çözeltiye daldırılmasıyla başlayın.Cıva(II) klorür çözeltisi ışığa duyarlı olduğundan, tüpü folyo ile kaplayın. Numuneleri oda sıcaklığında, karanlıkta saklayın. Ertesi gün, çözeltiyi biyotehlikeli atık konteynerine uygun şekilde atmadan önce yavaşça geçici bir kaba boşaltın.Beş mililitre taze cıva klorür çözeltisi ekleyin ve beyinlerin tamamen daldığından emin olun. Numuneleri oda sıcaklığında, karanlık ortamda 13 gün daha bekletin. 14 gün sonra, 30 gram toz halindeki emprenye sonrası tamponunu 90 mililitre distile veya deiyonize suya (DH2O) ekleyerek emprenye sonrası tamponunu hazırlayın.Altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna, her beyin için bir kuyucuk olacak şekilde 6,5 milliliters post-impregnasyon tamponu doldurun. Ardından, cıva klorür çözeltisini daha önce yapıldığı gibi beyin dokusundan uzaklaştırın. Dokuyu DH2O ile durulayın ve ardından dokuyu post-impregnasyon tamponu içeren altı kuyucuklu plakalara aktarın.Plakların üzerini folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında, karanlıkta saklayın. Ertesi gün, impregnasyon sonrası tamponu aspire edin ve yenisiyle değiştirin. Plağın üzerini tekrar kapatın ve dört derece Celsius sıcaklığındaki buzdolabında saklayın.Plakaların kapaklarını soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru artan sayılarla etiketleyerek, beyin başına iki veya üç adet 12 kuyucuklu plaka hazırlayın. Dilimlenen beynin tanımlama numarasını ekleyin. Her plakanın her bir kuyucuğuna iki mililitre 1X PBS pipetleyin, ardından sahneyi kurun ve vibratomu açın.Ardından, numune tutucunun doku bloğuna bant yapıştırın ve üzerine az miktarda siyanoakrilat tutkal ekleyin. Altı kuyucuklu plakadan bir beyin çıkarın ve plastik veya cam bir kaba yerleştirin. Beyin üzerinde kalan serebellum kısmının düz olduğundan emin olarak, serebellumu kaudal yönde kesmek için paslanmaz çelikten çift ağızlı bir bıçak kullanın.Ardından, kalan serebellumun düz yüzeyini yapıştırıcının üzerine yerleştirin. Yapıştırıcı kuruduktan sonra, dokunun bulunduğu numune tutucuyu numune banyosuna yerleştirin. Numune banyosunu vibratoma yerleştirin ve doku örneğinin üzerini PBS ile kapatın.Ardından, bıçağı vibratomun bıçak tutucusuna takın ve bıçağı, tamamen suya gömülene ve dokunun üst kısmının hafifçe altına inene kadar numune banyosuna yavaşça indirin. Sonra, vibratom hızını yediye, genliği altıya ve kesme açısını 12 dereceye ayarlayın. Titreşimi başlatın ve 200-micron kalınlığında kesitler alın.Doku kesitlerini örnek banyosundan 12 kuyucuklu plakaların belirlenmiş her bir kuyucuğuna taşımak için büyük bir boya fırçası kullanın. İstenen doku kesiti sayısına ulaşana kadar dokuyu kesmeye devam edin. Kesme işlemi tamamlandıktan sonra, transfer pipeti kullanarak 12 kuyucuklu plakanın kuyucuklarındaki PBS'yi aspire edin, ardından iki mililitre PBS-T ekleyin ve ajitasyon eşliğinde 30 dakika boyunca yıkayın.Yıkama süresinin sonuna doğru, üç ölçek amonyum hidroksit çözeltisini beş ölçek DH2O ile seyreltin. Ardından, PBS-T'yi uzaklaştırıp seyreltilmiş amonyum hidroksit çözeltisini ekleyin. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve kesitleri 19 ila 21 dakika boyunca boyayın.Ardından, amonyum hidroksit çözeltisini güvenli bir şekilde uzaklaştırdıktan sonra, boyama sonrası tamponu ekleyin. Alüminyum folyo ile koruyun ve 19 ila 21 dakika daha boyamaya bırakın. Son olarak, kesitleri PBS-T ile her seferinde beş ila 10 dakika olacak şekilde üç kez durulayın.Kesitleri, geniş boya fırçası kullanarak %1 jelatin kaplı lamlara monte edin. Oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika boyunca kurumaya bırakın, ardından bir Coplin kavanozuna yerleştirip gece boyunca bekletin. Lamları Coplin kavanozundan çıkarın ve çeker ocak içindeki plastik bir rafa yerleştirin.%100 etanol içeren bir boyama kabına beş dakika boyunca yerleştirin. Kesitleri iki adet daha beşer dakikalık etanol yıkaması ile dehidre edin. Ardından, lamları bir cam rafa yerleştirin ve rafı %99 ksilen içeren bir cam boyama kabına indirmek için metal bir sap kullanın.Slaytları, her biri beş dakika sürecek şekilde iki kez ksilenle yıkayın. İkinci yıkama süresi dolduktan sonra, slaytları ksilen içerisinden tek tek çıkarın ve dokunun üzerini hızlıca yaklaşık 0,25 mililitre kapatma medyası ile örtün. Ardından, bir lam kestireci alıp medyanın üzerine yerleştirin.Slayt lam örtelerinin altında hapsolmuş hava kabarcıklarını, boya fırçası sapı gibi küt bir nesneyle kenarlara doğru itin. Lamları doğrudan güneş ışığı almayan bir alana yerleştirin ve iki ila üç gün boyunca kurumaya bırakın. Kurutma işleminin ardından, bir mikroskop kullanarak görüntüleme yapın ve uygun yazılımla analiz aşamasına geçin.Bu aydınlık alan görüntüsü, görüntüleme ve ileri analiz kriterlerini karşılayan Golgi boyalı bir nöronu göstermektedir. Üç spine türünün tamamı kolayca görülebilmektedir. Boyama, dendritin tüm uzunluğu boyunca tutarlıdır ve dendrit diğer nöronlardan izole durumdadır.Bu şekil, 5-fluorouracil tedavisi sonrası Dentate Gyrus içindeki Golgi boyalı nöronların, salin tedavisi gören gruba kıyasla dördüncü ve altıncı derecelerde kısalma gösterdiğini ortaya koymaktadır. Golgi boyama, diken yoğunluğundaki anlamlı farklılıkları tespit etmek için kullanılabilir. Canlı farelere uygulanan 5-fluorouracil, CA1 apikal piramidal dendritlerde diken yoğunluğunu anlamlı ölçüde azaltmıştır.Bazal dendritlerde, dikenlerin genel yoğunluğunda anlamlı bir değişiklik görülmemiştir. CA1 apikal piramidal dendritlerin Sholl Analizi, 5-florürasil tedavisinin soma'dan 40 ila 160 mikron uzaklıktaki dendritik dallanmayı anlamlı şekilde azalttığını ortaya koymuştur. Bazal dendritlerde ise 5-florürasil tedavisi, soma'dan 30 ila 110 mikron uzaklıktaki dendritik dallanmayı azaltmıştır.Golgi boyama sürecinin yanı sıra montaj, temizleme ve kapatma işlemlerini kapsayan bu teknik, yeterince uzmanlaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında beyn başına üç saat içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların bir fare modelinde nöroanatomik bağlantıları keşfetmesinin önünü açmıştır. Bu prosedür uygulanırken, nöronların aşırı boyanmasını önlemek için kesitlerin amonyum hidroksit çözeltisinde yalnızca 19 ila 21 dakika tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, beyin dokusunun nasıl doğru şekilde boyanacağı, kesileceği ve durulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Cıva klorür bazlı çözelti, amonyum hidroksit çözeltisi ve ksilen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle önlem alın, laboratuvar eldivenleri giyin ve bu prosedürü gerçekleştirirken bir çeker ocak içinde çalışın.

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoya kaydedilmiş protokol stereomicroscope altında erişkin fareden dentat girus kaldırılması için diseksiyon tekniği gösterildi.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

Bu makale, sıçan ve transgenik farelerin hipokampal dilimler sinaptik değişiklikler, beynin yaşlanma ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı ile ilgili çalışma için hazırlamak için prosedürler sıralanıyor.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

Bu kağıt sıçan yavrularının dokunsal uyarım ve nöronal morfoloji sonraki Golgi-Cox boyama işlemleri anlatılmaktadır. Dokunsal uyarım bir ev silgi ile yavrular okşayarak tarafından perinatal dönemde uygulanır olumlu bir deneyim olduğunu. Golgi-cox boyama tüm nöronların görüntülenmesine olanak güvenilir bir işlemdir.

Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.

Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Öğrenin Golgi-Cox boyama yöntemiyle yaşlı farelerde hipokampal dendritik karmaşıklığı değerlendirmeyi. Bu protokol sinirbilim araştırmalarında nöron morfolojisini yüksek kalitede incelemeyi sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet