Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, yeni nöritleri başlatmak, onları hızla uzatmak ve hedef hücrelere hassas bir şekilde bağlamaktır. Bu prosedür ancak kontrollü ve tekrarlanabilir bir ortamda yetiştirilen hücreler kullanılarak mümkündür. Bu yöntem, sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamamızı sağlar.

Nöronların büyüme hızını ne sınırlar? Ne kadar hızlı büyüyebilirler? Mekanik ipuçları bir rol oynar mı?

Ayrıca sinapsların nasıl oluştuğunu, nöronların hedef hücreyi nasıl bulduğunu da inceleyebiliriz. Sinapslar nasıl yaşlanır, olgunlaşır? Ve üçüncü olarak, sistematik olarak sinir ağları oluşturmaya başlayabiliriz, nöronların nasıl hesapladığını inceleyebiliriz.

Bu tekniğin temel avantajları, kolay manipülasyon, deneysel tekrarlanabilirlik ve nihayetinde tek hücre düzeyinde yüksek derecede kontrol sağlamasıdır. Bu işleme başlamak için istenen sayıda steril lameti temizleyin ve hazırlayın. Daha sonra, her bir kapak fişini oda sıcaklığında en az iki saat boyunca mililitre PDL başına 0,5 ila 1 mililitre 100 mikrogram ile kaplayın.

Bundan sonra, kapak fişlerini iki kez suyla yıkayın ve tüm sıvıyı çıkarın. Steril bir ortamda 5 ila 10 dakika veya yüzey tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın. Ardından, mikroakışkan cihazları, desenler UV ışığının altına bakacak şekilde 10 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

10 dakika sonra, desen aşağı bakacak ve temiz kapak sürgüsü ile temas edecek şekilde bir mikroakışkan cihaz yerleştirin. Cama yapışması için cihaza yumuşak bir şekilde bastırmak için cımbız kullanın. Tek popülasyonlu cihazı orta ile doldurmak için, sağ üst kuyucuğa 50 mikrolitre tam hücre ortamı ekleyin.

Ve sonra, kuyuya çapraz olarak 50 mikrolitre daha tam hücre ortamı ekleyin. Çoklu popülasyon cihazını ortamla doldurmak için, bir sıra kuyucuğa 30 mikrolitre tam NBM ekleyin. Ortamın kuyular arasında aktığından emin olun.

Ardından, kalan kuyucukların her birine 50 mikrolitre orta ekleyin. Cihazları açık bir otoklavlanmış su kabı ile daha büyük bir tabağa yerleştirin ve hücre kültürünü hazırlarken tabağı bir ila iki saat inkübatöre yerleştirin. Şimdi, kuyuları boşaltmadan ortamı mikroakışkan cihazların üst kuyularından çıkarın.

Daha sonra, mikroakışkan cihazın sağ üst kuyusuna 20 mikrolitre konsantre hücre çözeltisi ekleyin ve mikroskopta hücrelerin tek popülasyonlu mikroakışkan cihaz içinde nasıl aktığını kontrol edin. Çoklu popülasyon cihazındaki hücreleri plakalamak için, üst kuyucukların her birine 20 mikrolitre konsantre hücre çözeltisi ekleyin. Mikroskop altında, hücrelerin odaların içinde olup olmadığını kontrol edin.

Daha sonra, alt tabakaya hücre bağlanmasını teşvik etmek için cihazları 15 ila 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücreler substrata bağlandıktan sonra, tek popülasyon cihazının üst iki kuyusuna 40 mikrolitre NBM ekleyin. Bu, mikro kanallardan hava kabarcıklarının giderilmesine yardımcı olacaktır.

Çoklu popülasyon cihazının üst kuyularına, hücrelerin enjekte edildiği aynı kuyucuklara 20 mikrolitre MBM ekleyin. Medya, pozitif bir menisküs oluşturmak için hafifçe çıkıntı yapmalı ve kuyucuklara bir çörek üst görünümü vermelidir. Mikroakışkan cihazın çıkarılmasından bir ila iki gün önce, her numune kabına iki mililitre önceden ısıtılmış NBM ekleyin ve odaları doldurun.

Ardından, cihazları inkübatörde tutun. Daha sonra, mikroakışkan cihazları kapak fişlerinden çıkarmak için steril cımbız ve bir pipet ucu kullanın ve desenli bir nöron konfigürasyonu bırakın. Bu işlemde hazırlanan PDL kaplı boncuklardan 40 ila 60 mikrolitre ile hücre kültürüne gönderilir.

Ardından, sinaptik temasların oluşumunu teşvik etmek için numuneyi bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. Daha sonra, numuneyi, hücrelerin iki mikropipet ile yukarıdan değerlendirilebileceği ve ayrıca optik olarak erişilebileceği şekilde bir deney düzeneğine yerleştirin. Bu konfigürasyonda, görüntü yakalama için mikroskobun yan portunda bir CCD kamera bulunur.

Tuzlu su ile doldurulmuş her pipeti bir mililitrelik şırıngaya bağlayın, ardından numuneyi fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile perfüze edin. Daha sonra, mikroskop altında, iki popülasyonun doğal olarak bağlantılı olmadığından emin olmak için izole edilmiş iki nöronal popülasyon arasındaki boşluğu kontrol edin. Görüş alanındaki nörona bağlı olmayan bir PDL boncuğu seçin.

Boncuğa ve ardından mikropipete odaklanarak boncuğu bir mikropipet ucuyla hizalayın. Daha sonra, ucu mikroskopta izleyerek boncuğa mümkün olduğunca yaklaştırın. Ardından, boncuğu almak için pipete negatif basınç uygulayın ve deney boyunca negatif basıncı koruyun.

Şimdi, görüş alanındaki bir nörona bağlı bir PDL boncuğu seçin ve emme kullanarak ikinci mikropipete takın. Mikromanipülatörü veya numune aşamasını 1 mikrometre için dakikada 0,5 mikrometre hızla yavaşça hareket ettirerek PDL boncuk nöron kompleksini çekin ve nörit başlamasına izin vermek için beş dakika bekleyin. PDL boncuk nöron kompleksini, iki mikrometre üzerinde dakikada 0,5 mikrometre hızla yavaşça yanal olarak hareket ettirerek çekin, ardından nörit uzamasına izin vermek için beş dakika bekleyin.

İlk beş mikrometre için başarılı başlatma ve nörit uzatma işleminden sonra, nöriti sürekli olarak dakikada 20 mikrometre hızla çekin. Nöronları bağlamak için nörit açısından zengin bir bölge seçin. Kapak kaymasının üzerindeki pipet ucu yüksekliğini ölçmek için başka boncuklar kullanın ve PDL boncuk nörit kompleksini nöritlerle fiziksel olarak temas edecek şekilde indirin.

İkinci mikropipeti manipüle ederken PDL boncuk nörit kompleksini hedef nörit ile temas halinde bırakın. Ardından, ikinci PDL boncuğu ile ikinci pipeti, yeni oluşturulan nöritin üzerine birinci boncuktan yaklaşık 20 mikrometre uzağa indirin ve yeni nörit filamentini hedef hücreye doğru itmek için ikinci PDL boncuğunu kullanın. Ardından, her iki boncuğu da en az bir saat yerinde tutun.

Mikroskopla boncukla temas eden nöritlerin kalınlaşması olan fokal şişmenin olmadığını doğrulayın. Bu süre zarfında, numunenin ortamını fizyolojik tuzlu sudan önceden ısıtılmış karbondioksit dengelenmiş NBM'ye yavaşça değiştirin. Emmeyi serbest bırakarak boncuğu ikinci pipetten serbest bırakın.

Yeni nörit takılı kalırsa, ilk boncuğu da serbest bırakın. Daha sonra, gelecekteki deneyler için nöronal bağlantıyı güçlendirmek için numuneyi dikkatlice inkübatöre geri yerleştirin. Mikromanipüle edilmiş bağlantının elektriksel işlevselliğini araştırmak için tüm hücre yaması kelepçe kayıtlarını kullanabilirsiniz.

Burada, PDMS mikro cihazlarında 100 mikrometrelik bir boşlukla ayrılan izole nöronal popülasyonlar gösterilmektedir. Çiftten yamaya kelepçe kayıtları tüm hücre konfigürasyonunda gerçekleştirildi ve mekanik olarak indüklenen bağlantılar analiz edildi ve doğal olarak bağlı nöronal popülasyonlar ve bağlı olmayan popülasyonlardaki kayıtlarla karşılaştırıldı. Doğal olarak ve mikromanipülasyon ile bağlanan nöronlardan kaydedilen pre-sinaptik aksiyon potansiyeli sonrası elektriksel tepkiler önemli ölçüde daha yüksektir ve geçici olarak pre-sinaptik aktivite ile ilişkilidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir ve bu prosedürü denerken, hızlı ve tekrarlanabilir sonuçları garanti etmek için sağlıklı ve iyi modellenmiş uzun süreli hücre kültürlerine sahip olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, mikromanipüle edilmiş bağlantının elektriksel işlevselliğini doğrulamak için farklı yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan odalarda hücre popülasyonlarının nasıl büyütüleceğini iyi anlamalı ve nöritleri başlatmak, genişletmek ve bağlamak için pipet manipülasyonlarını kullanmalısınız.