Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

Bu prosedürün genel amacı, epitel hücrelerini sıçan epididiminden izole etmek ve tüm hücre yama-klemp yöntemi kullanarak bu birincil olarak ayrışmış hücreler üzerindeki elektriksel özellikleri ölçmektir. Bu yöntem, sperm olgunlaşması ve baba özelliklerinin kalıtımı için önemli olan epididimin işlevi gibi üreme biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, kullanıcının izole edilmiş epididimal epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini koterize etmesine izin verir, böylece bu hücrelerin bilinmeyen fizyolojik işlevi daha sonra gösterilebilir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Bao Li Zhang olacak. Prosedüre başlamak için, diseksiyon aletlerini %70 etanole batırarak dezenfekte edin. Ardından kurumaya bırakın.

Ardından, tam IMDM'yi hazırlayın. Daha sonra, aseptik koşullarda 50 ml alikotlar oluşturun, Parafilm ile kapatın ve dört santigrat derecede saklayın. Bunu takiben, kollajenaz tip I ve kollajenaz tip II'yi RPMI'de çözerek kollajen bir enzim sindirim solüsyonu hazırlayın, bu da solüsyondaki her kollajenazın mililitresinde bir miligram ile sonuçlanır.

Çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir zardan süzün. Ardından, kollajenaz çözeltisi olarak işaretleyin ve çözeltiyi kullanana kadar oda sıcaklığında tutun. Ardından, enzim çözeltisinin hacmini enzimin ağırlığına göre ayarlayın.

Tek bir sıçandan her iki kauda epididimit için gereken minimum hacim iki mililitredir. Sıçan kauda epididimitlerini incelemek için, hayvanı ya IP enjeksiyonu yoluyla sodyum pentobarbital kullanarak ya da hayvan kuyruk kıstırma stimülasyonuna yanıt vermeyene kadar bir izofluran odası kullanarak ve ardından servikal çıkık yaparak kurban edin. Daha sonra alt karın bölgesini %70 etanol ile silerek dezenfekte edin.

İki testisi yavaşça alt karın bölgesine doğru itin ve ardından alt karın bölgesini skrotumun yakınında açın. Daha sonra, epididimal yağı çıkarın ve tüm üreme organlarını inceleyin. Daha sonra bunları RPMI ile yemeğe aktarın.

Temiz, hava akışı kontrollü bir çalışma istasyonunda, kauda epididimitlerini bağ ve yağ dokularından ve epididimal kapsülden ayırın. 1.5 mililitrelik bir tüpe 0.2 mililitre kollajenaz çözeltisi içeren bir epididim yerleştirin. Tek hücreleri kauda epididimitlerinden ayırmak için, doku macun benzeri bir sıvı haline gelene kadar ince makas kullanarak kollajenaz çözeltisindeki epididimitleri kesin.

Ardından, makası tüpteki enzim çözeltisinin geri kalanıyla nazikçe durulayın. Bunu takiben, tüpü 1.000 rpm çalkalama hızıyla 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca metal bir termo-karıştırıcı üzerine yerleştirin. Daha sonra, enzim doku karışımını oda sıcaklığında üç dakika santrifüjleyin.

Bundan sonra, çoğunlukla spermi içeren yapışkan süpernatanı boşaltın. Daha sonra, tüm enzimatik aktiviteyi söndürmek için peleti bir mililitre tam IMDM'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 49 mililitre RPMI içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücre karışımını santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. Tek hücreleri enzimatik muamele edilmiş epididimal doku karışımından ayırmak için peleti bir mililitre tam IMDM'de en az beş dakika boyunca hafif öğütme ile yeniden süspanse edin. Epitel hücrelerini aseptik koşullar altında diğer hücrelerden ayırın ve hücre süspansiyonunu tam IMDM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabında en az sekiz saat veya gece boyunca 32 santigrat derecede bir inkübatörde kültürleyin.

Ertesi sabah, steril örtü fişlerini %100 alkole batırarak hazırlayın. Havayla kurutun ve ardından az miktarda kültür ortamına batırın. Daha sonra, kapak fişlerini altı santimetrelik kültür kaplarına veya 24 oyuklu bir plakanın tek oyuklarına yerleştirin.

Şimdi, çoğunlukla epitel hücrelerinden oluşan Petri kabından hücre süspansiyonunu nazikçe toplayarak ayrışmış epitel hücrelerini hasat edin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 30 kez G'de beş dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltın. Bunu takiben, hücre peletini iki mililitre tam IMDM'de yeniden süspanse edin.

Hasat edilen hücre süspansiyonunun 0.2 mililitresini her bir steril örtü kaymasının ortasına tohumlayın. Hücrelerin cam kapak kızaklarına gevşek bir şekilde yapışmasını sağlamak için hücre süspansiyonunun sıvı damlacıkta en az 10 dakika oturmasına izin verin. Daha sonra, hücreleri rahatsız etmeden, altı santimetrelik bir tabağın kenarına bir mililitre tam IMDM veya 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0.3 mililitre tam IMDM ekleyin.

İzole edilmiş tek hücreleri, yama kelepçesi deneyleri yapılana kadar inkübatörde 32 santigrat derecede kapak kızakları üzerinde tutun. Yama kelepçesi deneyinin yapıldığı gün, hücre içi çözeltinin bir kısmını buz üzerinde çözdürün ve bozulmayı önlemek için yama kelepçesi deneyi sırasında soğuk tutun. Daha sonra, cam kapak kızağı üzerindeki kültür epitel hücrelerini oda sıcaklığında standart PSS ile doldurulmuş kayıt odasına aktarın.

Herhangi bir yama kelepçesi deneyinden önce banyo PSS'sini bir pipet kullanarak en az iki kez dikkatlice değiştirin. Tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için, pipeti mikromanipülatörün en yüksek hızında banyo solüsyonuna daldırın. Dijital kameraya bağlı ekranda pipet ucunu bulun.

Ardından, mikromanipülatör hızını orta-yüksek moda yavaşlatın. Bilgisayar kontrollü amplifikatörden oluşturulan bir voltaj adımını uygulayarak veri toplama arayüzü komutunu kullanarak mikropipet direncini hızlı bir şekilde kontrol edin. Direnç bu aralığın önemli ölçüde dışındaysa yeni bir mikropipetle değiştirin.

Ve yazılımın kumanda arayüzündeki pipet ofseti komutunu kullanarak pipet ile banyo çözeltisi arasındaki sıvı bağlantı potansiyelini sıfıra ayarlayın. Membran testi ile direnci izleyin. Direnç 500 megaohm'dan büyük, ancak bir gigaohm'dan küçükse, gigaseal'i oluşturmaya yardımcı olmak için negatif bir potansiyel uygulayın.

Bu arada, mikropipetin geçici kapasitif akımını telafi edin. Bu anda, sızdırmazlık direncinin belirlenmesi için sıfır milivoltluk bir tutma potansiyelinden 10 milivoltluk bir hiperpolarizasyon adımı uygulayın. Başarılı bir tam hücre konfigürasyonu elde ettikten hemen sonra, negatif 60 milivoltluk bir tutma potansiyelinden 10 milivoltluk bir hiperpolarizasyon adımı uygulayın.

Voltaj modunu sıfır akım moduna getirin ve hücrenin dinlenme zarı potansiyelini ölçmek için 10 saniyelik boşluksuz bir kayıt gerçekleştirin. Daha sonra, hızlı bir şekilde voltaj moduna geri dönün ve bu modda kalın. Planlanan deneylere göre gerilim protokollerini uygulayın ve akım tepkilerini ölçün.

Burada, yama kelepçesi deneylerinden önce çanak üzerinde gece boyunca kültürün yeniden hasat edilmesinden önce ve sonra sıçan kauda epididimitlerinden izole edilen epitel hücrelerinin örnekleri verilmiştir. Bu şekil, bir nabız ortaya çıkaran protokol kullanılarak tek epididimal epitel hücrelerinden kaydedilen tipik tüm hücre akımlarını göstermektedir. Noktalı çizgi sıfır akım seviyelerini gösterdi.

İşte belirtilen zaman noktalarında ölçülen akım tepkilerinin akım voltajı ilişkisi. Bunlar, ATP'li veya ATP'siz bir pipet çözeltisi ile diyalize edilen ana hücrelerin dinlenme zarı potansiyelinin temsili izlemeleridir. Ve bu çubuk grafik, artı ATP ve eksi ATP'nin ilk dinlenme zarı potansiyeli arasında önemli bir fark göstermemektedir.

Çubukların içindeki parantez içindeki sayılar, en az üç hayvandan test edilen hücrelerin sayısını gösterir. Ve burada, tüm hücrelerin veya sadece ana hücrelerin sızdırmazlık direnci ve giriş direncinin, tüm hücre oluşumundan kısa bir süre sonra sıfır akım kelepçesinde ölçülen dinlenme potansiyellerine ve tutma potansiyelinden negatif 100 milivolta kadar hiperpolarizasyon adımında ölçülen akım büyüklüklerine karşı korelasyon analizleri yer almaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dokuz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hücre izolasyon adımları sırasında enzimatik sindirimi hemen durdurmayı unutmamak önemlidir. Aksi takdirde, gigaohm contasının zor oluşumuna ve yama-kelepçe deneylerinin başarısız olmasına yol açabilecek aşırı sindirim meydana gelebilir. Kültürün sağlığını korumak için, enzimatik olarak ayrışmış hücre karışımını iki ila üç dakika boyunca 30 G'lik düşük hızda döndürmek ve ardından çoğunlukla sperm hücreleri içeren yapışkan süpernatanı boşaltmak önemlidir.

Bu prosedürleri takiben, naif epitel hücrelerindeki dinlenme membran potansiyelinin kontrollü koşullar altında hücre dışı davranışı düzenleyebileceği gibi ek soruları yanıtlamak için canlı hücre görüntüleme ve tek hücre kültürü teknikleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu teknik, üreme biyolojisi alanındaki araştırmacıların, sperm olgunlaşmasının düzenlenmesi ve baba edinilmiş özelliklerin kalıtımının düzenlenmesi için epididimin epitel hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini keşfetmelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, epitel hücrelerinin sıçan epididiminden nasıl izole edileceğini ve bu hücreler üzerindeki elektriksel özelliklerin tam hücre yama-kelepçe yöntemi kullanılarak nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.