Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılacak olan neonatal fare koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, uygulanacak tedaviler ve immün boyanmasıdır. Bu yöntem; koklear tüy hücrelerinin, sinapsların, nöritlerin ve nöronların bir ex vivo modelde eş zamanlı olarak incelenmesine olanak tanıyarak ve insan salgılarında bulunan faktörler de dahil olmak üzere kokleaya yeni tanıtılan moleküllerin etki mekanizmalarına dair bilgi sağlayarak, işitme araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aday terapötik bileşiklerin tarama sürecinin, in vivo testlerden önce hızlandırılabilecek olmasıdır.

70% ethanol içeren bir Petri kabı kapağındaki, yeni toplanmış bir neonat başı ile başlayın. Kafatasının ön ucundan arka ucuna kadar deride yüzeysel bir kesi yapmak için bir bistüri ucu kullanın. Ardından her iki dış kulak yolunu kesin ve tüm kranyumu açığa çıkarmak için deriyi öne doğru katlayın.

Ardından, kohleaya baskı yapmamak için skalpel bıçağını anteriordan posteriora doğru nazikçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek kraniyumu sagital sütür boyunca açın. Orbitlerin hemen posteriorundan dikey bir kesi yaparak burnu çıkarın ve atın. Kafatasının posterior kısmı hâlâ beyni ve kohleayı içermelidir.

Ardından, ön beyni, serebellumu ve beyin sapını künt diseksiyonla ayırmak ve uzaklaştırmak için 4 forceps kullanın. Kafatasının iki yarısını soğuk HBSS ile doldurulmuş 60 milimetrelik plastik bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, çevreleyen stapedial arterin bitişiğinde bulunan kokleayı tamamen açığa çıkarmak için 4 forceps kullanın ve organı temporal kemikten künt bir şekilde ayırın.

Kohleayı, HBSS içeren 50 milimetrelik şeffaf duvarlı cam tabanlı bir Petri kabına aktarın ve kabı mikroskobun altına yerleştirin. Kafatasının diğer yarısının bulunduğu 60 milimetrelik plastik Petri kabını buz üzerine koyun. Ardından, kohlear otik kapsülü dikkatlice diseke etmek için 4 adet pens kullanın.

Şimdi, organ of Corti'ye yapışık olan spiral ligamenti, kokleanın geri kalanından ve medialis'ten dikkatlice ayırmak için bir mikro bıçak veya iki adet 55 pens kullanın. Bu işlem, spiral ligamenti en bazal kısmından kavrayıp apikal yöne doğru hareket ederken nazikçe çözerek gerçekleştirilebilir. Spiral ligament çıkarıldıktan sonra, kokleanın boylamsal sagital görünümünü elde etmek için örneği konumlandırın.

Ardından, mikro bıçağı kullanarak kokleayı iki veya üç bölüme ayırın ve bu bölümleri apikal ve bazal kıvrımlar olarak sınıflandırın. Koklear eksplantın Petri kabı üzerinde yatay olarak durabilmesi için, tüy hücreleri ve nöritlerin bulunduğu gerçek katmana kadar, daha apikal parça için üstteki, daha bazal parça için ise alttaki dokuları temizleyin. Sonrasında, Corti organının hemen üzerinde bulunan çok ince, yarı saydam bir tabaka olan tektoryal membranı pensetle nazikçe kavrayıp soyun.

Teknik olarak en zorlayıcı adım, altındaki tüy hücrelerine kolayca zarar verilebileceği için ince, yarı saydam tektoryal membranın çıkarılmasıdır. Dokunun kenarlarından başlanarak, tektoryal membranın soyulmaya başladığı en uç kısım hariç, eksplant boyunca yer alan tüy hücreleri korunur. Son olarak, spiral ganglion nöronlarının hemen üzerinde bulunan Reissner membranına her iki yandan pensle dokunup soyarak onu çıkarın.

Kenarlardaki hasarlı bölgeler temizlendikten sonra koklear örnek kültüre edilmeye hazır hale gelir. Eksplantın pipet ucunun içine yapışmasını önlemek için, bir mililitrelik pipetin ucunu yaklaşık 120 µL DMEM ile ıslatarak kültür prosedürüne başlayın. Ardından, önceden ıslatılmış ucu kullanarak cam tabanlı Petri kabından maksimum 70 µL sıvı çekin ve örneği sıvı ile birlikte dört kuyucuklu Petri kabındaki dört bölmeden birine yerleştirin.

Eksplantın doğru yönlendirilmiş olduğunu mikroskop altında kontrol edin. Tektoryal membranın çıkarıldığı tüy hücreleri bölgesinin yukarıya baktığından ve basilar membran ile medialis'in budanmış bazal kısmının aşağıya baktığından ve lamella ekine yapıştığından emin olun. İnceleme sırasında numune burada gösterildiği gibi ters yönlendirilmişse, pipet ucuyla HBSS ekleyin ve parça doğru yönlendirilene kadar yeniden konumlandırın.

Ekplant doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra, fazla HBSS'yi aspire edin ve 15 saniye bekleyin. Şimdi, pipeti örneğe değdirmemeye dikkat ederek, örneğin üzerine doğrudan 60 µL ılık kültür ortamı pipetleyin. İç ve dış Petri kabı kapaklarını kapatın ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, koklear eksplant içeren Petri kaplarını inkübatörden laminar akışlı ön kabine aktarın. İç kısımdaki FBS içermeyen eski kültür ortamını aspire edin. Her kuyucuğa, hazırlanan sıcak işlem ortamından 60 µL ekleyin.

Kültürlerin boyanması için Petri kabını, en fazla yedi gün boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Bu konfokal görüntüde görüldüğü üzere, bu teknik, spiral ganglion nöronları veya SGN'ler dahil olmak üzere tüm koklear kıvrımın anatomisini koruyarak, Corti organına ek olarak SGN'lerin nöritleri ve somaları üzerindeki tedavi etkilerinin analiz edilmesine olanak tanır. Burada görüldüğü gibi, bu eksplantlar, immünofloresan boyama sonrası tedavinin apikal ve bazal kıvrımlar üzerindeki etkisini eş zamanlı olarak karşılaştırmak için kullanılabilir.

Tüy hücreleri yeşil, nöronal yapılar ise kırmızı olarak gösterilmiştir. Sağlam sinapslar, presinaptik proteinlerin kırmızı, postsinaptik proteinlerin yeşil ve nöronal yapıların mavi ile boyanmasıyla birlikte değerlendirilebilir. Bu şekil, solda %3 FBS veya sağda %1 FBS içeren kültür ortamında yedi gün bekletilen apikal ve bazal koklear eksplantların temsilci görüntülerini göstermektedir.

%3 FBS içeren ortamda inkübe edilen hücreler, tüy hücreleri için açık gri oklar ve nöritler için kırmızı oklar ile gösterildiği üzere, dördüncü ve beşinci günler arasında göç etmeye başlar. %1 FBS içindeki eksplantlar, yedinci güne kadar organizasyonel bütünlüklerini korurlar. Bu prosedür uygulanırken, son kültür medyumu ve ilgili maddeler eklenmeden önce koklea dokusunun yapısal bütünlüğünün ve yöneliminin görsel olarak doğrulanması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, GFP eksprese eden hücrelerin medialis içindeki hücre tipine özgü lokalizasyonunu doğrulamak için 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirilebilir.