Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yan popülasyon hücrelerini, myc ile indüklenen T hücreli akut lenfoblastik löseminin bir zebra balığı modelinden izole etmektir. Yan popülasyon testi, birçok normal ve kanser dokusunda kök ve progenitör hücre popülasyonlarını tanımlamak için kullanılmıştır. Ancak henüz herhangi bir zebra balığı kanser modeline uygulanmamıştır.

Bu tekniğin ana avantajı, zebra balığı T-ALL'de kanser kök hücre aktivitesi için zenginleştirilebilecek bir hücre popülasyonunun prospektif izolasyonuna izin vermesidir. Burada tanımladığımız yöntem, zebra balığı lösemi araştırmalarında geniş uygulamalara sahip olsa da, diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler, yöntem ince değişikliklere karşı hassas olduğu için mücadele edebilir.

Yöntem basit görünse de, test edilen her hücre tipi için optimizasyon gereklidir. 0,9x PBS'de 20 mililitre yüzde 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS hazırlayın. 300 ünite antikoagülan içeren bir heparin sodyum tuzu şişesine bir mililitre FBS / PBS çözeltisi ekleyin.

Daha sonra, bir epifloresan mikroskobu kullanarak, tümör hücrelerinin vücudun yüzde 50'sini istila ettiği balıkları veya yemek yeme veya yüzmede zorluk çektiği tespit edilen balıkları seçin. Balıkları, balık suyunda mililitre trikain başına bir ila iki miligramlık bir çözeltiye aktararak ötenazi yapın. Ötenaziyi doğrulamak için hayvanı solungaç hareketi ve kalp atışı açısından gözlemleyin.

Balığın kafasını çıkardıktan sonra, fazla kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için bir pipetle 100 mikrolitre heparin solüsyonunu vücut boşluğuna enjekte edin. Dökülen tüm sıvıyı aspire edin ve 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Daha sonra, yeni pipet uçları kullanarak, vücut boşluğunu iki kez daha veya yıkama solüsyonu hiç kan içermeyene kadar yıkayın ve tüm yıkamalardan toplanan sıvıyı atın.

Lösemi hücrelerini toplamak için, önceden yıkanmış vücut boşluğuna 100 mikrolitre FBS / PBS çözeltisi enjekte edin. Diseksiyon mikroskobu altında, tümör hücrelerini dışarı atmak için bir pipet ucuyla balığın vücuduna hafif bir baskı uygulayın. Serbest kalan sıvıyı 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın.

Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar izolasyonu tekrarlayın. Tüm hücreleri aynı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve elde edilen süspansiyonu oda sıcaklığında tutun. Ardından, hücre kümelerini ayırmak için izole edilmiş tümör hücrelerini hafifçe pipetleyerek karıştırın.

Hücre süspansiyonunu 40 mikrometre gözenekli bir filtreden süzün. Ve filtreyi 100 mikrolitre FBS / PBS ile bir ila iki kez yıkayın. Filtrelendikten sonra hücreleri oda sıcaklığında tutun.

Son olarak, yeni bir tüpte, hücre süspansiyonunun iki mikrolitresini 18 mikrolitre yüzde 0.04 steril Tripan Blue çözeltisi ile karıştırın. Elde edilen süspansiyonun 10 mikrolitresini bir hemositometreye yükleyin ve canlı floresan tümör hücrelerini sayın. T-ALL hücrelerinin temiz bir örneğini toplamak önemlidir.

Burada kullanılan Hoechst üç üç dört iki konsantrasyonu, toplanan canlı tümör hücrelerinin sayısına dayanmaktadır. Ek hücresel kalıntılar veya tümör olmayan hücreler teste müdahale edebilir. Hücre boyamadan önce, mililitre çalışma çözeltisi başına bir miligram elde etmek için Hoechst boyasını nükleaz içermeyen bir suda seyreltin.

Hazırlanan çözeltiyi alüminyum folyo ile kaplanmış olarak dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 100 mikromolar inhibitör çözeltisi elde etmek için 49.1 miligram verapamil'i bir mililitre DMSO'da çözün. Daha sonra, FBS / PBS, 2.5 mikrolitre DMSO, mililitre Hoechst boyası başına 15 mikrolitre bir miligram ve altı tümör hücresine 10 ila 10 ekleyerek numuneyi hazırlayın.

Kontrolü hazırlamak için, FBS / PBS, 2.5 mikrolitre 100 milyon molar verapamil, mililitre başına 15 mikrolitre bir miligram Hoechst boyası ekleyerek, son hacmi bir mililitre olan altı tümör hücresine 10 ekleyin. Numuneyi ve kontrolü karanlıkta 28 santigrat derece su banyosunda 120 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri hemen buzun üzerine yerleştirin ve karanlıkta tutun.

Hücreleri altı dakika boyunca 300 kez G'de dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, süpernatinti çıkarın ve hücreleri bir mililitre FBS / PBS ile yıkayın. Hücreleri bir kez daha altı dakika boyunca 300 kez G'de dört santigrat derecede döndürün.

Hücreler peletlendikten sonra, süpernatinti çıkarın ve hücreleri bir mililitre FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre sıralanana kadar numuneleri dört santigrat derecede tutun. Hücre sıralamasından 15 dakika önce, hücre süspansiyonunun her bir mililitresi için mililitre propidyum iyot stok çözeltisi başına iki mikrolitre bir miligram ekleyin.

Ardından, numuneleri iyice girdaplayın. Floresanla aktive edilmiş bir hücre sıralayıcı kullanarak lekeli zebra balığı T-ALL hücre süspansiyonlarını analiz edin. Hoechst boya analizi için bir UV lazeri ve propidyum iyodür veya GFP pozitif T-ALL hücrelerinin tespiti için 488 nanometre lazeri ile numuneleri uyarın.

Hücre sayısı, boya konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve inkübasyon uzunluğunun, kullanılan her farklı hücre tipi için optimize edilmesi gerekebilir. Ve bu koşulların her birinde yapılan değişiklikler, testin sonuçlarını büyük ölçüde değiştirebilir. Zebra balığından izole edilen T-ALL hücreleri arasındaki yan popülasyonu tanımlamak için, önce hücresel kalıntılar ve hücre kümeleri hariç tutulur.

Tek bir hücre popülasyonunda propidyum iyodür alımı ve GFP ekspresyonu daha sonra canlı tümör hücrelerini tanımlamak için analiz edilir. Yan popülasyonu görselleştirmek için, Hoechst boyasının mavi ve kırmızı emisyonları daha sonra karşılaştırılır. Yan popülasyon, ana hücre popülasyonunun sol tarafından mavi floresan eksenine doğru uzanan loş bir hücre kuyruğu olarak görünür.

Burada, iki farklı tümör hücresi örneği için gerçekleştirilen yan popülasyon analizinin sonuçları sunulmaktadır. Her iki örnekte de bir yan popülasyon tanımlandı. Bununla birlikte, farklı tümör örnekleri, çeşitli sayıda yan popülasyon hücresi içeriyordu.

Analiz edilen tümör örneğinden bağımsız olarak, örneğin bir verapamil akıntı inhibitörü ile muamelesi, daha önce tanımlanmış hücreler için gözlenen sinyalin kaybolmasına neden oldu ve yan popülasyon fenotipini daha da doğruladı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bir zebra balığı T-ALL'deki yan popülasyon tekniği, düzgün bir şekilde ve burada sunduğumuz gibi gerçekleştirilirse dört saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kuluçka sıcaklığı ve süresi, boya konsantrasyonu ve akış inhibitörü gibi zebra balığı T-ALL için optimize edilmiş adımları hatırlamak önemlidir.

Bunların farklı deney sistemleri için değiştirilmesi gerekebilir. Bu prosedürü takiben, RNA izolasyonu veya in vivo transplantasyon tahlilleri gibi diğer yöntemler, yan popülasyon hücrelerinin işlevselliği ve gen regülasyonu ile ilgili soruları ele almak için sıralanmış yan popülasyon hücreleri ile gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı T hücreli akut lenfoblastik lösemiden hücrelerin yan popülasyonunu nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.