Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, myc ile indüklenmiş T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrafish modelinden yan popülasyon hücrelerini izole etmektir. Yan popülasyon analizi, birçok normal ve kanserli dokudaki kök ve progenitör hücre popülasyonlarını tanımlamak için kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem henüz herhangi bir zebrafish kanser modeline uygulanmamıştır.

Bu tekniğin temel avantajı, zebra balığı T-ALL'de kanser kök hücre aktivitesi açısından zenginleştirilmiş olabilecek bir hücre popülasyonunun prospektif izolasyonuna izin vermesidir. Burada tarif ettiğimiz yöntem zebra balığı lösemi araştırmalarında geniş uygulama alanlarına sahip olsa da, diğer malign ve non-malign zebra balığı hücre tipleri için de uygulanabilir olabilir. Bu yönteme yeni başlayan kişiler, yöntemin küçük değişikliklere karşı hassas olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler.

Yöntem basit görünse de, test edilen her hücre tipi için optimizasyon gereklidir. 0.9x PBS içinde %10'luk 20 mililitre ısı ile inaktive edilmiş FBS hazırlayın. 300 ünite antikoagülan içeren bir heparin sodyum tuzu flakonuna bir mililitre FBS/PBS çözeltisi ekleyin.

Ardından, epifloresan mikroskop kullanarak, tümör hücrelerinin vücudun yüzde 50'sini istila ettiği balıkları veya yemek yeme ya da yüzme konusunda güçlük çektiği belirlenen balıkları seçin. Balığı, balık suyunda mililitre başına bir ila iki miligram tricaine içeren bir çözeltiye aktararak ötanazi yapın. Ötanaziyi doğrulamak için hayvanın solungaç hareketlerini ve kalp atışını gözlemleyin.

Balığın başı çıkarıldıktan sonra, fazla kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için vücut boşluğuna bir pipetle 100 µL heparin çözeltisi enjekte edin. Dışarı akan tüm sıvıyı aspire edin ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, yeni pipet uçları kullanarak vücut boşluğunu iki kez daha veya yıkama çözeltisi artık kan içermeyene kadar yıkayın ve tüm yıkamalardan elde edilen sıvıları atın.

Lösemi hücrelerini toplamak için, önceden yıkanmış vücut boşluğuna 100 µL FBS/PBS çözeltisi enjekte edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, tümör hücrelerini dışarı itmek için bir pipet ucuyla balığın gövdesine hafifçe baskı uygulayın. Açığa çıkan sıvıyı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın.

Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar izolasyonu tekrarlayın. Tüm hücreleri aynı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve elde edilen süspansiyonu oda sıcaklığında tutun. Ardından, hücre kümelerini ayırmak için izole edilen tümör hücrelerini nazikçe pipetleyerek karıştırın.

Hücre süspansiyonunu 40 mikrometre gözenekli bir filtre ile süzün. Ardından filtreyi bir veya iki kez 100 µL FBS/PBS ile yıkayın. Süzme işlemi tamamlandıktan sonra hücreleri oda sıcaklığında tutun.

Son olarak, yeni bir tüpte, iki µL hücre süspansiyonunu 18 µL %0,04'lük steril Trypan Blue çözeltisi ile karıştırın. Elde edilen süspansiyondan 10 µL'yi bir hemositometreye yükleyin ve canlı floresan tümör hücrelerini sayın. T-ALL hücrelerinden temiz bir örnek toplamak önemlidir.

Burada kullanılan Hoechst 33342 konsantrasyonu, toplanan canlı tümör hücresi sayısına dayanmaktadır. Ek hücresel döküntüler veya tümör dışı hücreler analizi etkileyebilir. Hücre boyamasından önce, 1 mg/mL çalışma çözeltisi elde etmek için Hoechst boyasını nükleaz içermeyen su ile seyreltin.

Hazırlanan çözeltiyi alüminyum folyo ile kapalı olarak dört santigrat derecede saklayın. Ardından, 100 mikromolar inhibitör çözeltisi elde etmek için 49,1 miligram verapamili bir mililitre DMSO içinde çözün. Daha sonra, FBS/PBS, 2,5 mikrolitre DMSO, bir miligram/mililitre Hoechst boyasının 15 mikrolitresi ve 10⁶ tümör hücresini, final hacmi bir mililitre olacak şekilde bir faks tüpüne ekleyerek numuneyi hazırlayın.

Kontrolü hazırlamak için, FBS/PBS ekleyerek, 2,5 µL 100 mM verapamil ve 15 µL 1 mg/mL Hoechst boyası ekleyip, toplam hacim 1 mL olacak şekilde 10^6 tümör hücresine ilave edin. Örneği ve kontrolü 28 °C'lik bir su banyosunda, karanlıkta 120 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri derhal buz üzerine yerleştirin ve karanlıkta muhafaza edin.

Hücreleri 4 °C'de 300 ×g'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri 1 mL FBS/PBS ile yıkayın. Hücreleri 4 °C'de 300 ×g'de bir kez daha altı dakika boyunca döndürün.

Hücreler çöktürüldükten sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre FBS/PBS içinde yeniden süspande edin. Örnekleri hücre ayırmaya kadar dört derece Celsius'ta saklayın. Hücre ayırmadan 15 dakika önce, her bir mililitre hücre süspansiyonu başına iki mikrolitre bir miligram per mililitre propidyum iyodür stok çözeltisi ekleyin.

Ardından, örnekleri iyice vorteksleyin. Boyanmış zebrafish T-ALL hücre süspansiyonlarını bir floresan aktive hücre ayıklayıcı ile analiz edin. Hoechst boya analizi için örnekleri bir UV lazerle ve propidyum iyodür veya GFP pozitif T-ALL hücrelerinin tespiti için 488 nanometre lazerle uyarın.

Hücre sayısı, boya konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve inkübasyon süresinin, kullanılan her farklı hücre tipi için optimize edilmesi gerekebilir. Bu koşulların her birindeki değişiklikler, assay sonuçlarını önemli ölçüde değiştirebilir. Zebrafish'ten izole edilen T-ALL hücreleri arasından yan popülasyonu belirlemek için, öncelikle hücresel debris ve hücre kümeleri dışlanır.

Canlı tümör hücrelerini belirlemek için tek bir hücre popülasyonundaki propidyum iyodür alımı ve GFP ekspresyonu analiz edilir. Yan popülasyonu (side population) görselleştirmek için Hoechst boyasının mavi ve kırmızı emisyonları karşılaştırılır. Yan popülasyon, ana hücre popülasyonunun sol tarafından mavi floresan eksenine doğru uzanan sönük bir hücre kuyruğu şeklinde görülür.

Burada, iki farklı tümör hücresi örneği için gerçekleştirilen yan popülasyon analizinin sonuçları sunulmuştur. Her iki örnekte de bir yan popülasyon tanımlanmıştır. Ancak, farklı tümör örnekleri farklı sayılarda yan popülasyon hücreleri içermektedir.

Analiz edilen tümör örneğine bakılmaksızın, örneğin verapamil eflluks inhibitörü ilele tedavi edilmesi, önceden tanımlanan hücreler için gözlemlenen sinyalin ortadan kalkmasıyla sonuçlanmış ve yan popülasyon fenotipi daha da doğrulanmıştır. Uzmanlaşıldığında, zebrafish T-ALL üzerindeki yan popülasyon tekniği, burada sunduğumuz şekilde ve uygun olarak gerçekleştirilirse dört saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, inkübasyon sıcaklığı ve süresi, boya konsantrasyonu ve eflluks inhibitörü gibi zebrafish T-ALL için optimize edilmiş adımları hatırlamak önemlidir.

Bunların farklı deneysel sistemler için değiştirilmesi gerekebilir. Bu prosedürün ardından, yan popülasyon hücrelerinin işlevselliği ve gen düzenlemesiyle ilgili soruları yanıtlamak için, ayrıştırılmış yan popülasyon hücreleri ile RNA izolasyonu veya in vivo transplantasyon analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebrafish T-hücreli akut lenfoblastik lösemiyle yan popülasyon hücrelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.