Name: Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin fare embriyonik böbreklerinin diseksiyonu ve kültürü yöntemini. Metanefrik rudimanları izole ederek üreterik tomurcuk dallanma morfolojisini inceleyin. Bu teknik böbrek organogenezinde doğuşan malformasyonların kökenini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Leif Oxburgh&#39;a ve Derek Adams&#39;a, teknik destekleri için Stefan Wölfl ve Ulrike Müller ve teknik destekleri için Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer ve Viola Mayer&#39;e yardım etmek için el yazmalarına yararlı yorumlar için Leif Oxburgh&#39;u cömertçe paylaşmaktan dolayı teşekkür ederler. laboratuvarı. Bu çalışma Biyologlar Şirketi Geliştirme (CP) tarafından desteklendi .

Fareler, İsveç yönetmeliklerine ve Avrupa Birliği mevzuatına (2010/63 / AB) göre korunmuştur. Bütün prosedürler İsveç Etik Komitesinin talimatlarına (C79 / 9, C248 / 11 ve C135 / 14 izinlerine) uygun olarak gerçekleştirildi. Heidelberg Üniversitesi&#39;ndeki hayvan konularını içeren prosedürler Regierungspräsidium Karlsruhe ve Heidelberg Üniversitesi&#39;nden Hayvan Refahı Memurları tarafından onaylanmıştır. 1. Kültür için Reaktiflerin ve Materyallerin Hazırlanması NOT: Kirliliği en aza indirgemek için laminer bir akış kaputu kullanın. <ol><li> Diseksiyon günü, insana ait Fc&#39;yi tek başına veya insan Fc&#39;ye kaynaştırılmış rekombinant kimerik efrin proteini, anti-insan Fc keçi antikorları ile steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 5&#39;lik bir molar oranda karıştırarak önceden kümeleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin 5 . </li><li> Kültür ortamını, Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Ortamını tamamlayarak hazırlayın: Besleyici% 1 penisilin / streptomisin (h / h),% 1 glutamin (h / h),% 1 insülin-transferrin-selenyum (h / h), 50 ug / mL insan holo- lanyum karışımı ile F-12 karışımı (DMEM / F12) Transferrin ve 1.5 ug / mL amfoterisin. NOT: 16 embriyo için 10 mL ortam yeterlidir. </li><li> Kültür ortamına 20 μg / mL son konsantrasyonda kümelenmiş rekombinant efrin çözeltisi ekleyin. Kümelenmiş insan Fc&#39;sini kontrol olarak kullanın. </li><li> Steril, kaplanmamış, düz dipli polistiren 4 yuvalı plakanın her bir kuyusuna 500 μL kültür ortamı ilave ederek kültür plakaları hazırlayın. </li><li> Steril forseps kullanarak dikkatli bir şekilde 5 μm / gözenek büyüklüğünde bir polikarbonat membran filtreyi ortamın üzerine yerleştirin. Hazırlanan plakayı kuluçka makinesine aktarın (37 ° C /% 5 CO 2 ). Filtrenin üst yüzeyde kuru kalmasını ve yüzmesini sağlayın. NOT: İki böbrek anlagen için bir filtre yeterlidir. </li><li> Bir traş bıçağı kullanarak, yaklaşık 30 pipet ipucu (hacim: 100 uL) yaklaşıkY 1 mm daha geniş bir açılma ile sonuçlanacak şekilde. Uçları bir pipet uçlu rafa geri yerleştirin. </li></ol> 2. Metanfrik Temellerin E11.5&#39;te Diseksiyonu <ol><li> E11.5&#39;te servikal dislokasyon ile (veya yerel etik komitesince onaylanmış bir yöntemi kullanarak) zamana bağlı hamile bir fareyi kurban edin. </li><li> Brown ve ark . Tarafından açıklandığı üzere uterus ve embriyoları çıkarın 6 . Bu noktadan itibaren diseksiyon mikroskopu altında çalışın. </li><li> 5 nolu saatçi forseps kullanarak, forellerin altında doğrudan embriyo kesin. Her bir embriyo için taze bir petri kullanın. Bacakları ve embriyonun kuyruğunu çıkarın. Bunu yapmak için, bir çift No.5 saatçilik forsepsiyle çıkarılacak dokuyu alın ve kesmek için ikinci bir çiftin uçlarını kullanın. </li><li> Ventral organ kütlesini çıkarmak için, embriyonun vücut duvarını bir burun deliğinden kaudal yönde yana doğru açmak için bir çift forsepsin uçlarını kullanın. <ol><li> Yüzeyel olarak, paralel olarak kesO dorsal aorta. Yöneltmek için kan dolu ve bu nedenle görünür dorsal aort kullanın. Kapalı forseps ipuçlarını kullanarak vücut duvarının ventral kısmını dorsal kısımdan dikkatlice ayırın ve embriyo üzerine çevirin. Vücut duvarı bir rostral-kaudal yönde lateral olarak kesin ve önceki yan için olduğu gibi yönlendirme için dorsal aortu kullanın. </li></ol></li><li> Ventral vücut duvarı dorsal vücuttan ayrıldıktan sonra, bir çift forsepsle tutun ve organ kütlesi ile birlikte dikkatle çekerek çıkarın. NOT: Metanefrik anlagen genellikle dorsal vücut duvarına yapışır. Bunlar, oval, ~ 200 μm uzunluğunda yapıların arka bacaklar seviyesinde bulunur. </li><li> Dorsal vücut duvarını, ventral yüz yukarı bakacak şekilde bir çift forsepsle tutun. Diğer forseps çiftini kullanarak, dorsal aortayı rostral ucundan tutun ve dorsal aortayı dorsal vücut duvarından dikkatlice soyun. NOT: Her iki metanefrik böbrek genellikle ekte kalırDorsal aorta yapıştırılmış. </li><li> Bir çift forseps kullanarak, aortu çıkarmak için rostral olarak böbrek anlagenine kestik. Daha sonra forseps ipuçlarını kullanarak iki böbrek anlagen dikkatlice ayırın. </li><li> Forsep ipuçlarını kullanarak böbrek anlagenindeki istenmeyen dokuları dikkatlice soyun. Hasar kötü büyümeye ve eksplantın ek analizden çıkarılmasına neden olabileceğinden mezenşime zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> Böbrek anlagenini, bir mikrolitrre pipet ve 4 plaka içindeki polikarbon membran filtreye 10 μL PBS içinde geniş açık pipet kullanarak ayrı olarak aktarın. NOT: Yüzey gerilimi nedeniyle, eksplant ince bir ortam tabakası ile örtülür. İki böbrek anlagen için bir filtre yeterlidir. <ol><li> İki böbrek anlageninin her birini filtrenin ilgili yarısının ortasına yerleştirin. Plakayı 37 ° C /% 5 CO 2&#39;de inkübatöre geri aktarın. Metanetrik rud gelinceye kadar plakayı inkübatöre bırakınBir sonraki embriyo örnekleri filtreye konmaya hazırdır. </li></ol></li><li> Her embriyo için 2.3-2.9.1 adımlarını tekrarlayın. NOT: Bazı uygulamalarda, diseksiyon prosedürü, embriyo başına yaklaşık 5 dakika sürecektir. </li><li> 37 ° C /% 5 CO 2&#39;de 3 gün boyunca böbrek anlagen inkübe edin. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Boyama için Reaktiflerin Hazırlanması <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum (w / v) olmadan PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlamak için, PFA 60 ° C&#39;de çözülür, sürekli karıştırılır. Oda sıcaklığına soğutun ve kalan parçacıkları çıkarmak için bir kağıt filtre kullanın. Derhal çalkalamak için 4 ° C&#39;de tutun veya uzun süreli depolamada dondurun. DİKKAT: PFA toksiktir. Yerel güvenlik standartlarında belirtilen kişisel koruyucu donanım kullanın ve bir davlumbazda çalışın. Kurumsal talimatları takip edip atık atın ve atık konteynırlarını kullanın. </li><li> Geçirgen hale getirme çözeltisi hazırlamak için, Triton X-100&#39;ü seyreltinPBS içinde kalsiyum ve magnezyum olmadan% 0.3 (h / h). </li><li> Bloklama çözeltisi hazırlamak için, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS&#39;ye% 5 (v / v) keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 ekleyin. % 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona sodyum azid ekleyin. 4 ° C&#39;de saklayın. DİKKAT: Sodyum azid toksiktir. Sodyum azidi yerel güvenlik ve çevre koruma yönetmeliklerine uygun olarak kullanın. NOT: Boyama için antikor kullanırken, ikincil antikorun bloke edici solüsyon yapmak için türetildiği türlerden% 5 serum kullanın. </li><li> Bloke edici çözeltide, biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin 1: 200 seyreltin. Bloke edici çözeltide Alexa488-konjüge streptavidin 1: 200 seyreltin. </li><li> 0.1 M Tris-HC1 (pH 8.5) içinde 0.1 g suda çözünür polivinil alkol bazlı muko yapışkan / mL ila% 25 (w / v) gliserol ilave etmek üzere, kullanıma hazır gömme ortamı yapmak için (materyal tablosuna bakın) . Sürekli çalkantı altında 50 ° C&#39;ye 1 saat boyunca ısıtın, soğutun ve pH&#39;ı 1 ile 8.0-8.5&#39;e ayarlayınNaOH. Daha yüksek NaOH konsantrasyonlarından kaçının. % 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona kadar 100 μg / mL N-propilgalat ve timerosal ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın. DİKKAT: Thimerosal toksiktir. Yerel güvenlik ve çevre koruma yönetmeliklerine uygun olarak tutun. <ol><li> Gömülü ortamı 50 mL&#39;lik tüplere doldurun, rotoru dengeye getirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 3.200 xg&#39;de santrifüjleyin. 15 mL&#39;lik tüplere temiz bir solüsyon dökün ve pelleti atın. Birkaç hafta süreyle -20 ° C&#39;de miktar ve depolar. Çözündükten sonra çözeltiyi 4 ° C&#39;de tutun. Kullanımdan hemen önce ~ 30 ° C&#39;ye kadar ısıtın. </li></ol></li><li> Eksplantlara sahip filtreler monte edilecek kadar çok cam slayt hazırlayın. Bunun için, anında yapışkan kullanarak cam sürgünün her iki yanında 18 x 18 mm&#39;lik iki adet küçük lamelleri tutkal edin. Aralarında filtre için ~ 15 mm boşluk bırakın. </li></ol> 4. Fiksasyon ve boyama <ol><li> 3 kültür periyodundan sonraIn vitro (div) günler, kuluçka makinesinden plakaları çıkartın ve bir mikropipet kullanarak kültür ortamını her kuyucuktan dikkatle aspire edin. Filtreye dokunmamaya dikkat edin ve ucu açma kuyusunun duvarına doğru tutun. </li><li> Her göze 500 uL% 4 PFA / PBS ekleyin. Filtreler fiksatif üzerine yüzer. Bir mikropipet kullanarak, filtreleri batırmak için PFA sabitleyiciyi damla damla dikkatle ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. NOT: Takip eden tüm adımlar için, eksplantları filtreden yıkamamaya özen gösterilmelidir. Pipet ucunun ağzına doğru açılmasını sağlayın. </li><li> PFA&#39;yı çıkarın ve 500 ul PBS ile yıkayın, filtreyi suya batırın. Her göze 500 μL permeabilizasyon solüsyonu ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 500 μL PBS ile iki kez durulayın ve her oyuğa 500 μL engelleyici çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Bloklama çözeltisini şu şekilde değiştirin:Bloke edici çözeltide 1: 200 oranında seyreltilmiş 250 uL biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin ve 4 ° C&#39;de 24 saat inkübe edin. </li><li> Dolichorus biflorus aglutinin solüsyonunu çıkarın ve her göz başına 500 μL PBS ile iki kez durulayın. </li><li> Bloke edici çözelti 1: 200 seyreltilmiş 250 uL Alexa488-konjuge streptavidin ekleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Alternatif olarak, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. NOT: 4 ° C&#39;de inkübe edildiğinde daha iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilir. </li><li> Kuyu başına iki kez 500 μL PBS ile durulayın. Forseps kullanarak, filtreleri hazırlanan cam slaytlara, eksplantlar yukarı bakacak şekilde nakletin. ~ 50-100 μL embedding aracı ile monte edin. 60 mm uzunluğunda No. 1.5 lamelleri ile kaplayın. Gömülü orta solüsyonun karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle katılaşmasına izin verin. Resim hazır oluncaya kadar 4 ° C&#39;de folyoya sarılmış slaytları görüntülemeye veya saklamaya devam edin. </li><li> Geniş alan epifluoresan mikroskopu ile görüntü 7 &lt;/ Sup&gt; bir Hg lambasına bağlanmış ve mavi uyarılma için bir ayna ünitesi (uyarma bandı geçişi, 460 - 495 nm, çift renk ayna, 505 nm ve emisyon bandı geçişi, 510 - 550 nm) ve 20X Plan-Apokrom lensleri, 0.75 sayısal açıklık. </li></ol>

<ol><li>Saxén, L. <a target="_blank" href="http://admin.cambridge.org/fk/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/organogenesis-kidney">Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series</a>. 19, Cambridge University Press. (1987).</li>
<li>Lindström, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+%CE%B2-catenin%2C+BMP%2C+PTEN%2C+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000(2015).</li>
<li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Eph%2FEphrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li>
<li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555(2011).</li>
<li>Olympus Support. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817">http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817</a> (2016).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401300207/abstract">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li>
<li>Saxén, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/38101">Primary Embryonic Induction</a>. , Academic Press. London. (1962).</li>
<li>Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Morphog%22%5BJournal%5D)">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li>
<li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li>
<li>Perälä, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+exp+Morph%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
<li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel%2C+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550(2010).</li>
<li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li>
<li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li>
<li>Saxén, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3328727">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li>
<li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li>
<li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu el yazması, fare embriyosundan gelişen metanefrik anlagen&#39;in izole edilmesi ve organ öncüllerinin kültürlenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu yöntem, Grobstein 8 ve Saxén 9 , 10 tarafından geliştirilen standart bir tekniktir ve diğerleri 11 , 12 tarafından uyarlanmış ve değiştirilmiştir. Yöntemin başarısı, eksplantların sağkalımı ve endüktif potansiyelin, uzamış diseks...

Memeli böbreği, mezodermal kökenli iki ilkel yapıdan türetilmiştir: tübüler epitelyal üreter tomurcuğu ve metanefrik mezenşim. Nefrogenez sırasında, üreter tomurcuğu metanefrik mezenşimi istila eder ve toplama sistemini oluşturmak için dallanır. Metanefrik mezenşim, nefronların epitel elemanlarına yol açar. Bu süreçler kesin olarak zamanlanmış ve mekansal olarak koordineli bir şekilde gerçekleşir ve karşılıklı tümevarım mekanizmaları tarafından başlatılır. Her iki doku bileşeni de iletişim kurar ve diğerinin hücre morfogenezini etkiler. 
1920'lerde, tavukta mezonefrik kanalın in vivo tıkanıklığını gerçekleştiren Boyden'dı ve ayrılmış nefrik blastema farklılaşmada başarısız olduğu için indüktif etkileşimlerin ilk belirtisini sağladı1. Aynı zamanda, asılı bir damlada tavuk nefrik ilkelerini kültürlemek için ilk başarılı girişimler yayınlandı. Daha sonra, memeli organogenezindeki doku etkileşimlerini incelemek için organ kültürü geliştirildi. 1950'lerde Grobstein, metanefrik temellerin bir filtre üzerinde kültürlenebileceği bir teknik geliştirdi. Bu teknik, filtreyi bir kültür kabında Trowell tipi bir ekrana yerleştiren Saxén tarafından değiştirildi1. Yıllar geçtikçe, organ kültürü için birçok modifikasyon ve uygulama ortaya çıkmıştır. Burada açıklanan yöntem Saxén'in tekniğine dayanmaktadır, ancak filtreler ortam üzerinde serbestçe yüzdüğü ve kültürün çapı filtrenin çapını çok az aştığı için basitleştirilmiştir, bu da filtrenin istenmeyen hareketini sınırlar.
Tüm organ kültürü, organogenez sırasında hücresel süreçleri ve hücreler arası iletişimi araştırmak için klasik, ucuz ve basit ama güçlü bir araçtır. Organ kültürü, büyüme faktörleri, antikorlar, antisens oligonükleotidler, virüsler ve peptitler gibi biyolojik ajanların yanı sıra farmasötik bileşikler ve diğer kimyasallarla tedaviye izin verir. Ayrıca, gen fonksiyonu, genetik olarak modifiye edilmiş farelerden türetilen eksplantlar kullanılarak veya Cre-loxP sistemi gibi indüklenebilir gen inaktivasyon teknolojisi kullanılarak incelenebilir. Bu, böbreğin gelişmesinden önce embriyonik ölümcüllüğe neden olan genetik mutasyonların incelenmesine izin verir. Organ kültürü, gen fonksiyonu veya soy takibi için floresan etiketleme ve hücre davranışının gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan modern görüntüleme teknikleriyle de birleştirilebilir2.
Burada verilen spesifik örnekte, EphrinB2 ile aktive olan Efh reseptörü sinyalinin üreter tomurcuğunun dallanma morfolojisi üzerindeki etkisi araştırıldı. EphA4 / EphB2 çift nakavt farelerin morfolojisi, böbrek gelişiminde, embriyonik gün 11 (E11) kadar erken tespit edilebilen ve üreter tomurcuğu, üreter ve ortak nefrik kanalı3'ü içeren birkaç ciddi kusur önerdi. Eph reseptörleri aracılığıyla sinyalleşme, ligand-reseptör dimer4'ün kümelenmesini gerektirir. Eph sinyalini aşırı aktive etmek için, E11.5 fare embriyolarından elde edilen böbrek temelleri, kümelenmiş rekombinant EphrinB2-Fc varlığında kültürlendi. EphrinB2, üreter tomurcuk uçları3 ile ifade edilen EphA4 reseptörü için bilinen bir liganddır.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum, magnezyum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>diseksiyon</td></tr><tr><td>holo-Transferrin insan</td> kullanımı için<td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS -G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Propil gallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile Dolichorus Biflorus Aglütinin</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 konjuge Streptavidin</td><td>Jackson İmmüno Araştırma</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare Efrin-B2 Fc Chimera Proteini, CF</td><td>R& D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IgG1 Fc, CF</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-İnsan IgG Fc Antikor</td><td>R& D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>fiksasyon ve immün boyama için kullanım</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie uçları, INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>2 çift forseps gereklidir</td></tr><tr><td>İris makası, düz, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Pansuman Forseps, düz, narin, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları Nunclo Delta ile muamele edilmiş</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 İzopor Membran Filtre, polikarbonat, Hidrofilik, 5.0 ve mikro; m, 13 mm, beyaz, düz</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes 4 kuyulu, düz tabanlı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı 24 x 50 mm kalınlığında. No.1.5H 0.17 +/- 0.005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camları No.1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar ~ 76 x 26 x 1, 1/2-w. Zemin düz</td><td>NordicbioLabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR Tıraş Bıçakları</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman önceden hazırlanmış kalitatif filtre kağıdı, Sınıf 113V, kreplenmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Sabit aşama araştırma mirkoskopu</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Siyah 6 akraba fare, erkek, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Siyah 6 akraba fare, dişi, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereo Mikroskop</td><td>Leica Leica</td><td>S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

fare embriyonik böbreklerinin diseksiyonu ve kültürü

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Bu protokolün amacı, fare metanfrizik temellerinin diseksiyonu, izolasyonu ve kültürü için bir yöntem tanımlamaktır. Memeli böbrek gelişimi sırasında iki progenitör doku, üreterik tomurcuk ve metanefrik mezenşim, hücrenin mekanizmalarını birbirleriyle iletişim kurar ve karşılıklı olarak toplayıcı sistemi ve böbreğin nefronlarını oluştururlar. Memeli embriyolar intrauterin olarak büyür ve bu nedenle gözlemci tarafından erişilemez olduğundan, bir organ kültürü geliştirilmiştir. Bu yöntemle böbrek organogenezi sırasında epitelial mezenkimal etkileşimler ve hücresel davranışları incelemek mümkündür. Ayrıca konjenital böbrek ve ürogenital sistem malformasyonlarının kökeni de araştırılabilir. Dikkatle diseksiyon yapıldıktan sonra, metanfrrik temeller, kültür ortamında yüzen ve birkaç gün süreyle bir hücre kültürü inkübatöründe tutulabilen bir filtreye aktarılır. Bununla birlikte, koşullarınYapay ve dokudaki metabolizmayı etkileyebilir. Ayrıca, eksplantda bulunan ekstrasellüler matriks ve bazal membran nedeniyle test maddelerinin penetrasyonu sınırlı olabilir. Organ kültürünün en önemli avantajlarından biri, deneycinin organa doğrudan erişebilmesidir. Bu teknoloji ucuz, basittir ve biyolojik açıdan aktif maddelerin eklenmesi, genetik varyantların incelenmesi ve gelişmiş görüntüleme teknikleri gibi çok sayıda değişikliğe izin verir.

Metanefrik böbrek anlagen E11.5 gebe Black-6 yakın cinsinden farelerden türetilmiş ve kültürlenmiştir. Üç gün sonra üreter tomurcuğu 5 kez dallandı ve başlangıçta T şeklindeki üreter tomurcuğunun dalgalanmasına neden oldu. Her eksplant fotoğraflandı ve dallanma nesillerini belirlemek ve dal başına bitiş noktalarının sayısını hesaplamak için bölümlerin ve uç noktaların sayıları nicelleştirildi ( Şekil 1 ). Image 4. nesil, kontrol eksplantlarının% 35&#39;ine kıy...

Bu protokol, fare embriyolarından metanefrik temelleri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem açıklamaktadır.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Bu prosedürün genel amaçları, fare embriyolarından metanefrik rudimentleri izole edip kültüre etmek ve spesifik uygulamaların üreter tomurcuk dallanma morfolojisi üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. Bu yöntem; tübüler dallanma morfogenezinin kontrolü, epitel-mezenşim etkileşimleri ve konjenital malformasyonların kökeni hakkında böbrek organogenezine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, organa doğrudan erişimi kolaylaştırması; basit, düşük maliyetli ve kolayca modifiye edilebilir olmasıdır.Diseksiyona başlamadan önce, steril pensler kullanarak, 500 microliters taze kültür ortamı içeren dört kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna beş-micrometer gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat membran filtreyi dikkatlice yerleştirin. Plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Ardından, uç açıklıklarını genişletmek için bir jilet kullanarak yaklaşık 30 adet 100-microliter mikropipet ucunu uçtan yaklaşık bir millimeter uzaklıktan kesin ve uçları pipet ucu rafına geri koyun.Uçlar hazır olduğunda, embriyonik 11 1/2. gün embriyosunu bir diseksiyon mikroskobu altında PBS içine yerleştirin. Her embriyo için yeni bir kap kullanın. Ardından, be

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu yazıda, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücreleri düzenleyen sinyalizasyon yolaklar çalışma için kullanılabilir embriyonik fare böbrek progenitör hücre niş izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür hücreleri küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi için son derece erişilebilir ve önemlisi de aday yollarının etkin bir şekilde müdahale etmenizi sağlar viral iletimi,.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Anne metabolizma atlar neurulation sırasında, fare embriyo doğrudan farmakolojik manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, zaman noktası ve farmakolojik ajan değişen neurulation farklı yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Nöral Tüp Kapatma Fare Tüm Embriyo Kültürü

Bu videoda, fare böbreklerinden sağlam glomerülleri izole etme yöntemi açıklanmaktadır. Bu şekilde elde edilen kapsüllenmiş ve kapsüllenmiş glomerüller, murin böbreğinden parietal epitel hücre büyümelerini kültürlemek için de kullanılabilir.

Glomerül İzolasyonu: Murin Böbrek'ten Sağlam Glomerül Elde Etme Tekniği

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Böbrek yapıları doku Mühendisliği zararlı etkileri diyaliz ve organ sıkıntısı için bir çözüm sağlar. Burada, bir protokol mikro tarif yalıtım kortiko-medüller segmentleri için fare böbrekler incelemek. Bu segmentler oluşturan böbrek organoids iskele-Alerjik Hücresel yapıları implante edilir.

Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli glomeruli glomerual hücre outgrowths kültürve analiz için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem parietal epitel hücre çoğalması ve göç ile ilgili yolları incelemek için kullanılabilir.

Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme

Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Öğrenin fare embriyonik böbreklerinin diseksiyonu ve kültürü yöntemini. Metanefrik rudimanları izole ederek üreterik tomurcuk dallanma morfolojisini inceleyin. Bu teknik böbrek organogenezinde doğuşan malformasyonların kökenini anlamaya yardımcı olur.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet