Kemirgen nöromusküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant Adeno ilişkili virüs serotip 9 kullanarak mikroRNA sistemik teslim

Bu yöntemin genel amacı, rekombinant Adeno ile ilişkili bir virüs vektörü kullanarak bir mikroRNA seçmek ve iletmektir. Daha sonra farelerin iskelet kası ve motor nöronlarına verin ve hastalık fenotiplerini iyileştirmedeki etkinliklerini değerlendirin. Bu yöntem, nöromüsküler durumları tedavi etmek için mikroRNA tabanlı bir susturma stratejisinin kullanılıp kullanılamayacağına dair önemli soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, bir hedef hastalık genini doğrudan susturmak için farelerin omurilik ve iskelet kasına sistemik dolaşım yoluyla bir mikroRNA iletmek için Adeno ile ilişkili serotip 9 virüsünün kullanılmasıdır. AAV-mikroRNA plazmit stoğunu, mililitre başına on ila yüz trilyon genomluk bir viral yük içeren 100 ila 200 mikrolitrelik alikotlara bölün. Daha sonra, bir şırıngaya bir alikot yükleyin ve 27 ila 30 gauge bir iğne takın.

Şimdi, standart bir fare tutucu kullanarak, kuyruğu açıkta kalacak şekilde bir fareyi sabitleyin. Ardından kuyruğu %70 alkolle temizleyin ve vazodilatasyonu artırmak için kuyruğun altına yaklaşık 30 saniye ılık bir ped yerleştirin. Şimdi, kuyruğun distal kısmında, iğneyi eğim yukarı ve sığ bir açıyla, yaklaşık 15 derece olacak şekilde kuyruk damarına sokun.

Ardından virüsü enjekte edin ve iğneyi çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin. İğneyi çıkardıktan sonra, herhangi bir kanamayı durdurmak için iki parmağınızı kullanarak orta derecede basınç uygulayın. Ardından, hayvanı ev kafesine geri koyun.

Kuyruk damarı enjeksiyonu sırasında, iğnenin göbeğinde bir kan parlaması görmek nadir değildir. Enjeksiyon yapılırken herhangi bir direnç olmamalıdır. Kuyruk ağarmaya ve şişmeye başlarsa, iğneyi çıkarın ve önceki giriş konumuna yakın bir yerde tekrar deneyin.

Bu testler için fareler dört haftadan daha eski olmalı ve tedaviden önce bir temel ölçü aldığınızdan emin olunmalıdır. Sınav odası sessiz ve karanlık olmalı, rahatsız edici olmamalıdır. Herhangi bir test yapmadan en az 30 dakika önce fareleri odaya getirin.

Bu iklimlendirme döneminde hayvanları rahatsız etmeyin. Asılı tel testi ile başlayın. Fareyi kuyruğundan alın ve tel ızgaranın ortasına yerleştirin.

Ardından, ızgarayı 15 ila 20 inç yükseltin ve farenin tutuşunu ayarlaması için zaman tanımak için ekranı yavaşça ters çevirin. Izgara tamamen ters çevrildiğinde, zamanlayıcıyı başlatın ve düşme zamanını kaydedin. Farenin 60 saniye beklemesine izin verin, daha erken düşerse, ızgaraya geri koyun ve işlemi tekrarlayın.

Fare tam 60 saniye askıda kalırsa, skor için 60 saniye kaydedin ve fareyi kafesine geri koyun. Her farenin 60 saniye boyunca üç kez denemesine izin verin. Aksi takdirde, en uzun askıda kalma süresini puanlayın.

Fareye ötenazi yaptıktan sonra, omuriliği hasat edin ve ardından kuadriseps iskelet kasını çıkarın. Hasat edilen dokuları dondurmak için, paslanmaz çelik bir kaseyi yarıya kadar 2-metilbütan ile doldurun ve kasenin alt çeyreğini sıvı nitrojene batırın. Devam etmeden önce iki dakika bekleyin.

Birkaç dakika sonra, numuneyi 2-metilbütan içine aktarın. Numune beyaza döndüğünde hemen kuru buza gömülü bir kaba aktarın. Daha sonra numuneyi 80 santigrat derecede saklayın.

Biyokimyasal analiz ve mikroRNA miktar tayini için, hasat edilen dokuyu bir kriyoviyal içine yerleştirin ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Ardından, 80 santigrat derece saklayın. SBMA farelerine beş haftalıkken yüz trilyon AAV microR-298 genomu enjekte edildi.

SBMA fareleri, anormal şekilde genişlemiş bir poliglutamin yolu ile insan androjen reseptörü transgenini taşır. On haftaya kadar normalde nöromüsküler hastalık belirtileri geliştirirler. Lomber omurilik ve kuadriseps kası, tedaviden sonra analiz için birkaç zaman noktasında toplandı.

Kantitatif RT-PCR, mikro-R298 ekspresyonunun sekiz hafta sonra iskelet kasında zirve yaptığını ve ekspresyonun 12 haftada omurilikte zirve yaptığını gösterdi. Enjeksiyondan on hafta sonra, her iki dokuda da GFP tespit edildi. Ve GFP ekspresyonu motor nöron markörü kolin asetiltransferaz ile birlikte lokalizedir.

Bir takip deneyinde, farelere yedi haftalıkken rastgele virüs veya araç enjekte edildi ve daha sonra 40 haftalık olana kadar haftalık olarak tartıldı ve test edildi. Enjeksiyondan on hafta sonra, tedavi edilen fareler kilo almaya başladı ve gelişmiş motor performansı göstermeye başladı. Kantitatif gerçek zamanlı PCR, tedavinin etkilenen dokulardaki AR transkript seviyelerini azalttığını ortaya koydu.

Bu videoyu izledikten sonra, kuyruk vain enjeksiyonu yoluyla rekombinant Adeno ile ilişkili bir virüs vektörü kullanarak bir mikroRNA'nın nasıl verileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ve farelerde alt ekstremite atrofisi ve zayıflığını iyileştirmede verilen mikroRNA'nın etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olabilecek davranışsal tahlillerin nasıl yapılacağı. Bu tekniğin anlamı, gen terapisi yaklaşımlarına kadar uzanır, çünkü güvenli ve etkili bir gen terapisi, terapötik transgenin hedeflenen dokulara özgü transferini gerektirir.

Bu yöntem için ilk olarak, SBMA gibi toksik fonksiyon kazanımı mekanizmalarının neden olduğu hastalığın, özellikle hastalık transkriptinin üç asal onarımını hedefleyen, doğal olarak oluşan mikroRNA'ların aşırı ekspresyonundan fayda sağlayacağını fark ettiğimizde aklımıza geldi.