Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Bu tekniğin genel amacı, donör hücre aracılı miyogenezi teşvik etmek amacıyla, küçük bir donör kas dokusu segmentini konakçı bir kasa implante etmektir. Bu yöntem, ölüm sonrası toplanan kas dokusunun konakçı bir kasta donör hücre aracılı miyogenezi teşvik edip edemeyeceği gibi, rejeneratif kas biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, minimum invaziv olmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, kas gömme, egzersiz ve immünoterapinin kombinasyonu belirli etkilenmiş kasların rejeneratif potansiyelini gençleştirebileceği için ölümcül olmayan kas distrofilerinin tedavisine kadar uzanmaktadır. Bir fizik tedavi uzmanı ve biyomedikal mühendisi olarak, MIME prosedürünün minimal invaziv doğasının, konak kas yapısını ve fonksiyonunu aşırı bozmadan doğal bir doku iskelesiyle birlikte miyojenik hücre kaynağı sağlaması nedeniyle kilit rol oynadığına inanıyorum. Prosedürü, laboratuvarımdaki bir araştırma görevlisi olan Bayan Morium Begam demonstre edecektir.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde 12 ila 16 haftalık C57 black six donör fareleri ötanize edin. Arka bacağın ön yüzeyindeki deriyi açmak için bir adet cerrahi makas kullanın. TA kasını bulduktan sonra, TA kasının arkasında yer alan EDL kasını görüntülemek için onu çıkarın.

Kasın arkasına bir pens ucunu kaydırın ve ayak parmaklarının ekstansiyona uğrayıp uğramadığını görmek için hafifçe çekerek kasın EDL olduğunu doğrulayın. EDL kasını tanımladıktan sonra, distal ve proksimal tendonlara yönlendirici süturlar bağlamak için yaklaşık 10 cm uzunluğunda 4-0 ipek segmentler kullanın. Kasın proksimal ve distal tendonlarındaki süturlara ikişer çift düğüm atın.

Distal EDL tendonunu kesin ve kası yansıtın. Ardından, kası serbest bırakmak için proksimal tendonu kesin. Toplanan EDL kaslarını fare ringer solüsyonu ile doldurulmuş bir petri kabına yerleştirin.

Sekiz ila 10 haftalık erkek NSG-GFP konak fareyi, metin protokolüne uygun olarak anestezi altına alın. Kurumayı önlemek için gözlere vazelin uygulayın. Cildi hazırlamak için sol arka bacağın ön kısmına epilasyon kremi uygulayın ve iki dakika bekletin.

PBS emdirilmiş mendiller kullanarak, depilatuar kremi tüylerle birlikte temizleyin. Cildi temizlemek için, üçer mendil ile povidon iyot solüsyonu ve %70 etanol ile sırayla ovalama işlemi yapın. Konak TA kasında bir iğne yolu oluşturmak için, cerrahi bir iğneyi kasın merkezinden, kasın uzun ekseni boyunca geçirin.

İğnenin, TA kası boyunca ve kas gövdesinin merkezinden geçerek sefalo-kaudal yönde ilerlediğinden emin olun. İğne yerleşiminden sonra, yönlendirici sütürleri donör dokunun bir ucundan, cerrahi iğnenin lümeninden kaudo-sefalik yönde geçirin. Donör dokuyu iğne yolundan geçirmek için iğneyi, konak kastan kaudo-sefalik yönde geri çekin.

Donör EDL kas dokusunu, donör kasın kaudal ve sefalik uçlarındaki yönlendirici süturları kullanarak konak TA kası içerisine uygun şekilde yerleştirin. Donör dokunun gömülmesinin ardından, yönlendirici süturları kesin ve ince uçlu pensetle gerekli ayarlamaları yapın. Son olarak, yara boşluğunu pensetle kapatıp 27 gauge cerrahi iğne ucuyla veteriner doku yapıştırıcısı uygulayarak kas dokusundaki iğne yaralarını mühürleyin.

MIME işleminden sonra, konakçı TA kasının uzunluğu boyunca üç bölgeye (kas karnının proksimal, orta ve distal üçte birlerine) 50 ila 60 µL %1,2 Baryum Klorür enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, konakçı farenin bacağını etanol ile temizleyin ve cildi ince bir tabaka vazelin uygulayarak koruyun. Fareyi, içinde altlık bulunmayan tekli bir iyileşme kafesine yerleştirin.

Konak fareye termal destek sağlamak ve aynı zamanda farenin ısıtılmayan yarıya geçmesine izin vermek için, kafesin yarısının altına izotermal bir jel ısıtma pedi yerleştirilmelidir. İyileşme tamamlandıktan sonra, fareyi orijinal kafesine geri koyun. Bacağın ön yüzeyindeki deriyi açmak için bir adet cerrahi makas kullanın.

TA kası konumlandırıldıktan sonra, distal tendonu kesin ve kası sıyırın. TA kasını serbest bırakmak için proksimal kas tendonunu kesin. Hem sol veya işlem görmüş hem de sağ veya kontrol TA kaslarını toplayın.

Hasat edilen kasları tartım kağıdı üzerine yerleştirip teraziyle tartın. Kriyokoruma için kasları kısa süreliğine mineral yağına batırın ve ardından fazla yağı kurulama kağıdıyla alın. Kasları hızlıca dondurmak için alüminyum folyo üzerine yerleştirin ve hızla sıvı azot dolu bir çift cidarlı flask içine daldırın.

Dondurulmuş örnekleri etiketli kriyojenik tüplere aktarın. Donör dokusunun konak kası içerisine hassas bir şekilde gömülmesi, MIME'nin başarısı için kritiktir. Üç gün sonra, donör EDL kası, konak TA kası içerisinde implante halde kalır ve konak kası üzerindeki iğne izleri hâlâ görünür durumdadır.

Ek olarak, donör kaslarının kesitleri yeşil floresans göstermemektedir. Buna karşın, konakçı kaslarının kesitleri göstermektedir. İmplant edilen kasların kesitlerinde, GFP pozitif husk kas lifleri ile GFP negatif donör kas lifleri arasında belirgin bir sınır bulunmaktadır.

Tedaviden 14 gün sonra, tüm kas lifleri ve tedavi edilmemiş kaslar GFP pozitiftir. Ancak tedavi edilen konak kaslarında durum böyle değildir. Bu GFP negatif liflerin çoğunun, kırmızı desmin markalaması ile canlı olduğu gösterilmiştir.

Bu durum, MIME'nin donör hücre kaynaklı miyogeneze yol açtığını göstermektedir. TA kasında kimerik kas lifleri mevcuttur. Konakçı ve donör miyojenik hücrelerin füzyonundan kaynaklandığı düşünülen düşük ila orta düzeydeki floresanları ile tespit edilmişlerdir.

Konak kasının tüm çapı boyunca mevcut olmaları, donör miyojenik hücrelerin kas içerisinde birkaç yüz mikron göç edebileceğini göstermektedir. Uygun şekilde uygulandığında, bu tekniğe hakim olunduktan sonra işlem 15 ila 20 dakika içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, donör hücre aracılı miyogenezi kolaylaştırmak amacıyla, donör kasın bir segmentini konak kasa yerleştirmek için MIME tekniğinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

MIME tekniği, kadavra insan kasının bir konak farede donör hücre aracılı miyogenezi teşvik edip edemeyeceğini incelememize olanak sağlar. Ayrıca, nöromusküler elektriksel stimülasyonun donör hücre aracılı miyogenezi artırma kapasitesine sahip olup olmadığını değerlendirmeye yardımcı olur. Bu yöntem; biyopsi insan kasının konak hayvanlara yerleştirilmesiyle insan hastalıklarının hayvan modellerinin oluşturulması ve miyojenik hücreler içeren kas dokusu mimetiklerinin miyogenezi teşvik edip edemeyeceğinin test edilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.