Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Bu prosedürün genel amacı, kök hücrelerden ekstra hücresel veziküller ve eksozomlar transfer ederek kök suyu izole etmektir. Ve bu nano parçacıkların sap transfer kabiliyetini değerlendirmek. Meso, kök hücre alanında, trans hücre veya vezikülde türetilen hava durumu kök hücresi ile ilgili temel soruları yanıtlayabilir.

Ya da eksozom kök hücre özelliğini kök olmayan hücreye aktarabilir. Bu tekniğin temel avantajı, indüklenen kök hücrenin trans hücre vezikülünde türetilmesidir. Ve eksozom, kök olmayan hücreyi doğrudan kök hücreye yeniden programlamak için kullanılabilir.

Prosedürü gösteren, hepsi laboratuvarımdan cerrahi asistanı Pei-Ling, Wen-Tin ve Shih-Yin ile posta araştırmacısı LeMonsier olacak. Bir hücre kültürü inkübatöründe dört günlük bir kültür için 15 santimetrelik bir tabak başına 12 mililitre ortamda altıncı yapışmayan / mezenkimal meme epitel hücrelerine veya NAMEC'lere bir nokta iki çarpı on tohumlayarak başlayın. Dördüncü günde, masa üstü santrifüjleme için kültür ortamını hasat edin.

Ardından, ikinci bir masa üstü santrifüjleme için süpernatanı konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, süpernatanı yeni bir ultra santrifüje aktarın ve 30 dakika boyunca ultrasantrifüjleme gerçekleştirin. Dönüşün sonunda, süpernatanı yeni bir ultra santrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı tekrar ultra santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve üçüncü bir ultrasantrifüjleme için hücre dışı vezikül eksozom damağını PBS'de yeniden askıya alın. Ardından, damağı taze PBS'de yeniden askıya alın ve hücre parçacıklarını son bir kez ultra santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve ekstra hücresel vezikül eksozom damağını 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın.

Ardından, bikinkoninik asit tahlili ile ekstra hücresel vezikül süspansiyonunun protein konsantrasyonunu ölçün. Konsantrasyon 100 mikrolitre başına yaklaşık 20 ila 40 mikrogram olmalıdır. Ekstra hücresel veziküllerin ve eksozomların konsantrasyonunu ve boyutunu ölçmek için, hücre parçacıklarını 100 mililitre PBS başına iki mikrogram proteine seyreltin.

Ve parçacıkları nanoparçacık izleme analizi ile analiz edin. Eksozomları yoğunluk gradyanı ile saflaştırmak için, üçüncü ultrasantrifüjlemeden sonra, damağı PBS'de iki mililitre yüzde 40 iyodiksanol içinde yeniden süspanse edin. Ve hücre süspansiyonunu yüzde 30, yüzde 20, yüzde 10 ve yüzde beş iyodiksanol olmak üzere sıralı iki mililitrelik hacimlerle kaplayın.

Santrifüjlemenin sonunda on gradyan katmanının her birini hasat etmek için bir pipet kullanarak hücre fraksiyonunu yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile ayırın. Ardından, standart protokollere göre SDS sayfası ve western blot ile her fraksiyonda eksozom belirteçlerinin varlığını analiz edin. İlgilenilen uygun eksozom belirteçlerine karşı antikorların kullanılması.

Meme epitel hücrelerini önce ekstra hücresel veziküller ve eksozomlarla tedavi etmek için, beşinci akışa iki kez çadır koyun, epcam hi-CD 49F düşük luminal meme epitel hücrelerini plaka başına jelatin kaplı altı kuyucuklu plaka üzerine sıralayın. Daha sonra, her bir hücresel kültüre, NAMEC'den türetilmiş ekstra hücresel veziküller ve ekssomeların mililitresinde iki mikrogram ile muamele edin. Kültürlenmiş ortamı on gün boyunca her iki günde bir taze ekstra hücresel veziküller ve eksozomlarla değiştirmek.

Tedavi süresinin sonunda, üç haftalık bir kadın anestezi uygulanmış 57 BL6 fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve orta karın bölgesindeki kürkü çıkarın. Ameliyat bölgesini yüzde 70 alkol ve povodon iyot içeren üç alternatif döngü ile dezenfekte edin. Ve ventral torasik kasık bölgesi boyunca deriden bir nokta beş santimetre dikey kesi yapın.

Alternatif olarak sağ ve sol dördüncü meme yağ pedlerini açığa çıkarın. Her bir yağ yastığında lenf düğümünü bulun ve lenf bezinin altındaki tüm bez perancamasını çıkarın. Daha sonra, ekstra hücresel vezikal ve ekssome ile tedavi edilmiş luminal meme epitel hücrelerini ayırmak için prodialitik ve kologenalitik aktiviteye sahip doğal bir enzim kullanın.

On dakika sonra PBS'de yüzde beş FBS ile enzim aktivitesini nötralize etmek. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatenti atın. Saydıktan sonra, hücreleri 15 mikrolitre PBS konsantrasyonu başına bir çarpı on ila ikinci ila on çarpı on ila dördüncü hücrelere seyreltin.

Ve her bir yağ pedine 15 mikrolitre meme epitel hücresi süspansiyonu enjekte etmek için 27 gauge iğne ile donatılmış 100 litrelik bir mikrolitre cam şırınga kullanın. Daha sonra cildi yara klipsleri ile kapatın. Enjeksiyondan sekiz hafta sonra, toraks bölgesinden ingrinal bölgeye kadar deriden dikey bir kesi yapın ve hem sağ hem de sol dördüncü meme yağ yastıkçıklarını ortaya çıkarın.

Dördüncü meme penis başını çıkarın ve yağ yastıkçıklarını ayrı cam mikroskop slaytlarına yayın. Ardından, slaytları kimyasal bir davlumbaza aktarın ve pedleri gece boyunca oda sıcaklığında collies sabitleyicilerle sabitleyin. Ertesi sabah, numuneleri 250 mililitre yüzde 70 etanol içinde 15 dakika yıkayın.

Ardından beş dakika boyunca 250 mililitre damıtılmış su. Damıtılmış suyla yıkandıktan sonra, yağ pedlerini gece boyunca oda sıcaklığında karmin şap ile boyayın. Ardından artan 15 dakikalık etanol inkübasyonlarında dehidrasyon yapılır.

Son dehidrasyondan sonra, yağ yastıkçıkları şeffaf hale gelene kadar numuneleri kimyasal bir başlıkta zilene aktarın. Ardından, slaytları montaj ortamıyla monte edin ve yağ pedlerini inç başına 2.400 noktada görüntülemek için dijital bir slayt tarayıcı kullanın. İzole edilmiş veziküllerin ve ultrasantrifüj damağın boyutu, nano parçacık izleme analizi ile ölçüldüğü gibi tipik olarak yaklaşık 100 nanometredir.

Ayrıca, NAMEC şartlandırılmış ortamın ultrasantrifüj fraksiyonlarının transmisyon elektron mikroskobu analizi, bol miktarda zar veziküllerinin varlığını ortaya koymaktadır. Az önce gösterildiği gibi yoğunluk gradyanı ayrılmasından sonra, yüzde 20 iyodiksonal fraksiyonda eksozom belirteçleri tespit edilebilir. CFSE işaretli namik türevli, ekstra hücresel veziküller ve ekssomelar ile takas edilen insan luminal meme epitel hücrelerinin akış tarafı emetrik analizi, eksozom ile tedavi edilen kültürlerde on kat daha yüksek bir CFSE sinyali ortaya koymaktadır.

Meme epitel hücreleri tarafından CFSE etiketli ekstra hücresel veziküllerin ve eksozomların spesifik alımını gösterir. Ayrıca, negatif kontrol, PBS ile tedavi edilen meme epitel hücreleri bir CFSE tekili sergilemezken, eksozom ile tedavi edilen hücreler tarafından namik kaynaklı ekstra hücresel vezikal ve eksozom tutulumunun kanıtı da konfokal mikroskopi ile gözlemlenebilir. Özellikle, on gün boyunca NAMEC türevi ekstra hücresel veziküller ve eksozomlar ile tedavi edilen akışla sıralanmış epCAMhi / CD49Flo luminal meme epitel hücreleri enjekte edilen farelerin yağ yastıkçıkları, meme bezleri oluşturma yeteneği kazanmıştır.

Bu teknoloji, geliştirildikten sonra kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacımızın önünü açtı. Kök hücre kaynaklı trans hücre ve vezikül ile eksozomun rejenerasyon tıbbında ve doğrudan hücre yeniden programlamasında kullanımını araştırmak.