Elektrokonvülsif Terapi Sıçan Modelinde Hücre Sayılarını Tahmin Etmek İçin Optik Fraksiyonlama Tekniği

Optik fraksiyonatörü kullanan bu stereolojik çalışmanın genel amacı, tarafsız ilkelere dayalı yöntemler kullanarak belirli bir beyin bölgesindeki toplam hücre sayısı gibi nicel bilgiler elde etmektir. Bu yöntem, kantitatif analiz alanında, ilgilenilen eksiksiz bir yapıdaki toplam hücre sayısının tahmini gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel faydalarından biri, sabit ve önceden belirlenmiş bir hassasiyetle doğru tahminler sağlamasıdır.

Bu prosedürü gösteren, makalenin ortak yazarı olan Esther Kjaer Needham'dır. Sabit ve donmuş bir sıçan beyni ile başlayın. Bir neşter kullanarak, beynin orta hattı boyunca sağ ve sol yarım küreleri ayırın ve ardından ilk beyinde rastgele bir veya diğer yarım küreyi seçin.

Daha sonra sağ ve sol yarımküre arasında sistematik olarak geçiş yapın. Ardından, seçilen yarım küreyi, diske dik uzun bir eksene sahip bir numune diskine monte etmek için montaj ortamını kullanın. Yarım küre diske monte edildiğinde, yarım kürenin etrafına bir tüp yerleştirin ve yarım küreyi tamamen kaplayacak şekilde Tissue-Tek ile doldurun.

Ardından, numaralı çok çanak kapları ön soğutma için kriyostata yerleştirin. Daha sonra numune diskini kriyostata monte edin ve hipokampusun tamamını rastgele başlayarak koronal düzlemde 80 mikron kalınlığında bölümler halinde kesin. Kesim sırasında, bölümlerin kesim sırasında tutulduğundan emin olmak için numune alınan tüm bölümleri art arda soğuk çok tabaklı kaplara yerleştirin.

Tüm hipokampus bölümlere ayrıldığında, bölümleri tamamen kriyoprotektan ile örtün ve kapları daha fazla kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede tutun. İmmün boyamaya başlamaya hazır olduğunuzda, bölümlerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Ardından, her beşinci bölümü bir dizi hipokampal bölümden PBS ile doldurulmuş Petri kaplarına yerleştirilmiş 25 oyuklu boyama ağlarına aktarmak için bir boya fırçası kullanın.

Boyama için hipokampus başına sekiz ila 12 bölüm olmalıdır. Bölümleri içeren boyama ağlarını PBS içeren uygun cam kaplara aktarın ve bölümleri PBS'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra 20 dakika% 3 hidrojen peroksit içinde inkübe edin.

Yıkadıktan sonra, bölümleri üç hidroklorik asit çözeltisine taşıyın. Daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 0.1 sodyum tetraborat içinde nötralize edin. Üç adet 10 dakikalık inkübasyon ve yıkama tamponu değişiminden sonra, bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözeltiye aktarın.

Daha sonra, bölümleri fare anti-BrdU'da inkübe edin, bir ila 100 oranında seyreltilmiş, dört santigrat derecede 48 saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin. Birincil antikor inkübasyonundan sonra, her biri yıkama tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra yaban turpu peroksidaz içinde 48 saat inkübe edin, bir ila 10 yıkama tamponunda seyreltin.

48 saat sonra bölümleri 10 dakika boyunca PBS'ye aktarın ve toplam beş yıkama için tekrarlayın. Yıkadıktan sonra, bölümleri yedi dakika boyunca DAB çözeltisine aktarın. Daha sonra 10 dakika boyunca% 0.02 hidrojen peroksit içeren DAB çözeltisine aktarın.

Bir dizi yıkamadan sonra, bölümleri mikroskop slaytlarına sayısal sırayla monte edin. Yaklaşık 30 dakika kurumaya bırakın. Daha sonra numuneleri bir sürgülü rafa yerleştirerek havayla kurutun.

Daha sonra, numuneleri damıtılmış su içeren bir slayt boyama kabında 10 dakika boyunca yeniden sulandırın. Daha sonra slaytları 15 dakika boyunca %0,02 kresil menekşe ve damıtılmış suya aktarın. Kresil menekşe boyasını tekrarladıktan sonra, bölümleri bir etanol serisinden yeniden sulandırın.

Ardından, her seferinde 15 dakika boyunca ksilen içindeki bölümleri temizleyin. Son olarak, hızlı kuruyan montaj ortamı ekleyin ve kızakları örtün. 24 saat sonra slaytlar mikroskopi için kullanılabilir.

Slaytları önce mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirerek ve ardından stereoloji yazılımını açarak dokunun kalınlığını kontrol ederek başlayın. 100x yağa daldırma hedefine geçmeden önce düşük büyütme hedefi kullanarak ilgilenilen alanı tanımlayın. Ardından, bir sayma çerçevesinde belirli bir noktayı, örneğin bir köşeye bitişik bir alanı seçin ve bölümün bazı özellikleri odakta görünene kadar odak düzlemi boyunca hareket ederek bölümün üst kısmını bulun.

Z konumunu sıfır olarak kaydedin. Ardından, dokunun son Z seviyesi odakta olana kadar odak düzlemini doku boyunca aşağı doğru hareket ettirin, ardından bu konumu işaretleyin. Lokal doku kalınlığı sıfırdan bu son noktaya kadar tanımlanır ve Z ekseninde okunabilir.

Doku kalınlığını kaydedin. Doku kalınlığı, ilgilenilen bölge içinde birkaç yerde ölçülür. Disektör ve koruma bölgelerinin yüksekliği, sayma çerçevesinin boyutu, adım uzunluğu ve son büyütme bir pilot çalışmada belirlenir.

Artık Brd-U pozitif nöronları, genellikle 60x yağ veya 100x yağ objektifi ve yüksek bir sayısal açıklık kullanarak 2000 ila 3000x'lik bir son büyütmede saymaya başlayabilirsiniz. Her sayma çerçevesinde BrdU-pozitif nöronları tanımlayın, ancak kırmızı dışlama çizgisine dokunanları saymayın. Yeşil inklüzyon çizgisine dokunan BrdU-pozitif nöronları ve sayma çerçevesinin sınırları içinde kalanları sayın.

Brd-U pozitif nöronları sadece ilgilenilen özellik disektör yüksekliği içinde açıkça tanındığında sayın. Burada gösterilen yarı görünür nöronlar sayılmaz. Bu görüntü, sıçan hipokampusunun hipokampal granül hücre tabakası ve subgranüler bölgesindeki toplam BrdU-pozitif nöron sayısını göstermektedir.

Yatay çubuklar ortalama değerleri temsil eder. Elektrokonvülsif stimülasyonu takiben, tedavi edilen kontrollere kıyasla yeni BrdU-pozitif nöronların oluşumunda aniden% 260'lık bir artış vardır. Yeni üretilen nöronlardan oluşan bu havuzda, birinci günden üç aya kadar %40 yıpranma olur ve yeni oluşan nöronların yaklaşık %50'si tedaviden 12 ay sonra hayatta kalır.

Bu videoyu izledikten sonra, stereolojik yöntemler kullanarak bir beyin bölgesindeki toplam hücre sayısının nasıl tahmin edileceğini iyi anlamış olmalısınız.