Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Native elektroforezin, jel içi analizler, immunoblotlama ve native elektroelüsyon ile kombinasyonunun genel amacı, mitokondriyal süperkomplekslerin birleşimini korumak ve analiz etmektir. Bu yöntem, bioenerjetik ihtiyaçlar ile fizyolojik ve patolojik koşullar da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak, mitokondriyal elektron taşıma zinciri protein komplekslerinin süperkompleksler şeklinde nasıl birleştiği sorusuna yanıt vermeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, doğru uygulandığında, uzun süren izolasyon işlemi boyunca mitokondriyal süperkomplekslerin fizyolojik bütünlüğünün ve işlevselliğinin korunmasıdır.

Bu yöntem, süperkompleks birleşimi dinamiklerini incelemek ve plazma membranındaki protein komplekslerinin yanı sıra diğer hücre içi membranlardaki kompleksleri analiz etmek için de uygulanabilir. Jel içi analizlere hazırlık yaparken, natif elektroforez için kullanılan tüm parçaların deterjanlarla kontamine olmaması kesinlikle kritiktir; çünkü deterjanlar mitokondriyal süperkomplekslerin parçalanmasına neden olur. Şeffaf natif bir jelden bir veya daha fazla şerit kesin ve bunları etiketli bir kaba aktarın.

Complex-1 analizini gerçekleştirmek için, 10 mililitre analiz tamponunu 25 miligram nitro blue tetrazolium ve 100 mikrolitre 10 miligram/mililitre NADH ile birleştirin. Bunu, kesilmiş şeffaf doğal jel şeridine veya ilgilenilen bölgeye ekleyin. Bir sarsıcı üzerinde en az üç dakika boyunca hafifçe karıştırarak mavi bantların gelişimini takip edin.

Ardından, reaksiyonu durdurmak için jeli 10 ila 20 mililitre asetik asit çözeltisi içinde sabitleyin veya beş milimolar Tris pH 7.4 ile yıkayın. Belgeleme için fotoğraflar çekin. Kompleks-5 analizini gerçekleştirmek için, mavi doğal (blue native) veya berrak doğal (clear native) bir jelden bir jel, bir şerit veya ilgili bir alan elde edin.

Örneği, oda sıcaklığında 10 ila 20 mililitre analiz tamponu ve mililitre başına artı veya eksi beş mikrogram oligomycin ile hafif ajitasyon eşliğinde iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tamponu 14 mililitre taze analiz tamponu ile değiştirin. Daha sonra sırasıyla 190 mikrolitre bir molar magnezyum sülfat, 27,28 miligram kurşun nitrat, 60 miligram ATP ve 75 mikrolitre oligomycin ekleyin.

Hafif ajitasyonla inkübe edin ve beyaz bir çökelek oluşumunu gözlemleyin; çünkü oligomisinle işlem görmüş jellerdeki bantlar, kompleks-5'ten bağımsız bantlar verecektir. Asidik çözeltiler kurşun çökeleğini çözebileceği için jeli metanol bazlı bir fiksatif ile sabitleyin. Sonuçları fotoğraflayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde protein transferi ve immunoblotting işlemlerini gerçekleştirin.

Elektrolüsyon gününde, kullanılacak olan her cam tüpün altına bir frit yerleştirin. Gerekirse, cam tüpü elüsyon tamponuna yerleştirin ve friti içeriden tüpün dibine doğru itin. Fritli cam tüpü Electro-Eluter modülüne yerleştirin.

Kuşkayı elüsyon tamponu ile ıslatın ve cam tüpü yerine kaydırın. Cam tüplerin üst kısımlarının kuşkay ile aynı hizada olduğundan emin olun. Boş kuşkayları tıpalarla kapatın.

Ardından, silikon adaptörün altına ıslak bir membran kapak yerleştirin ve adaptörü elüsyon tamponu ile doldurun. Diyaliz membranı etrafındaki hava kabarcıklarını gidermek için tamponu ve adaptörü yavaşça aşağı yukarı pipetleyin. Tamponla dolu adaptörü cam tüpün tabanına doğru kaydırın.

Ardından, cam tüp içindeki frit üzerinde oluşan tüm hava kabarcıklarını giderin. Her bir cam tüpü elüsyon tamponu ile doldurun. BN-PAGE'den kesilen bantları cam tüplerin içine yerleştirin.

Büyük parçaları daha küçük parçalara bölün. Cam tüp içindeki dolum yüksekliğinin yaklaşık bir santimetre olduğundan emin olun. Ardından, modülün tamamını tanka yerleştirin.

Tankın içine yaklaşık 600 mililitre soğuk elüsyon tamponu ekleyin. Silikon adaptör kapaklarının tamponun içine daldığından emin olun. Proteinleri soğuk odada, 350 volt gerilimde dört saat boyunca elüye etmeden önce tankın altına bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin.

Elüsyon tamamlandıktan sonra, Electro-Eluter modülünü tampon tankından çıkarın ve bir lavaboya veya kaba yerleştirin. Eğer bir tıp kullanılmışsa, üst tampon haznesini boşaltmak için tıpı çıkarın. Her bir cam tüpteki tamponu boşaltın ve atın.

Silikon adaptörün yerinde kaldığından ve fritin altındaki sıvının rahatsız edilmediğinden veya çalkalanmadığından emin olun. Ardından, silikon adaptörü ve membran kapağı cam tüpün altından dikkatlice çıkarın. Silikon kapağın içeriğini bir mikrotüpe pipetleyin.

Diğer 200 µL elüsyon tamponu ile silikon kapağı durulayıp mikrotübe ekleyin. Bu işlemi tüm cam tüpler için tekrarlayın. Yeniden kullanılabilir membran kapaklarını, 0.5 mg/mL sodyum azid içeren elüsyon tamponu içine yerleştirerek muhafaza edin ve soğutun.

Kalp mitokondrilerinden elde edilen süperkompleksler burada jel içi analizler ile görselleştirilmiştir. Berrak doğal (clear native) jel şeritleri, kompleks-1 ve kompleks-5 için jel içi analizlerde kullanılmıştır. Sinyalin özgüllüğü, ATP-sentaz için oligomisin gibi inhibitörler kullanılarak değerlendirilebilir.

Jel içi analizler, kompleks-1 veya kompleks-5 aktivitesine sahip bir protein kompleksinin boyutuna ilişkin bilgi sağlar ancak bileşimleri hakkında bilgi vermez. Mavi yerli (blue native) jel, elektroelüsyonla kesilip çıkarılabilecek protein kompleksi bantlarını gösterir. Elektroelüsyondan sonra, elüat; jel içi analizler, elüye edilen proteinlerin yerli veya denatüre elektroforez sonrası gümüş boyaması ve Western blotting gibi ileri analizler için kullanılır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu üç günlük süreç; mitokondri izolasyonunu, gece boyunca süren mavi doğal (blue native) maksi elektroforezi ve immünoblotlamayı kapsar. Bu videoyu izledikten sonra, doğal elektroforez, jel içi (in-gel) analizler ve elektroelüsyon kullanarak mitokondriyal süperkomplekslerin nasıl izole edileceği ve tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedür uygulanırken, mitokondriyal süperkomplekslerin kırılgan olduğunun unutulmaması önemlidir. Numunelerin dondurulup çözdürülmesi minimum düzeyde tutulmalıdır. Natif elektroforez ve elektroelüsyon işlemleri buz üzerinde veya soğuk odada gerçekleştirilmelidir.

Bu tekniklerin etkileri, her bir süperkompleksin fiziksel bileşimini tanımlamanın ötesine uzanmaktadır. Süperkompleksler doğal formlarında yakalandığı için fonksiyonel analizler gerçekleştirilebilmektedir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mitokondriyal biyoloji alanındaki araştırmacıların, mitokondriyal elektron taşıma aktivitesine dair anlayışlarını ve bunun mitokondriyal hastalığı olan hastalar üzerindeki sonuçlarını yeniden değerlendirmelerinin önünü açmıştır.

Bu prosedürün ardından, izole edilen protein komplekslerinin moleküler bileşimi, yapısı veya elektrofizyolojik özellikleri gibi ek soruları yanıtlamak için HPLC, kütle spektroskopisi, elektron mikroskopisi veya patch clamping gibi diğer yöntemler uygulanabilir.