Name: Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, mitokondriyal süperkomplekslerin yerli elektroforez, in-jel testleri ve elektroelüsyon ile ayrıştırılması ve analizi. Bu yöntem, hücresel enerji metabolizması ve hastalık durumlarındaki rolünü anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Kurucu Ortaklığı [12GRNT12060233] ve Rochester Üniversitesi&#39;ndeki Güçlü Çocuk Araştırma Merkezi&#39;nden hibeler tarafından desteklendi.

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
<li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li>
<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026783">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li>
<li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li>
<li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mitokondriyal ATP üretimi için fonksiyonel bir ETC gerekir. ETC kompleksleri, iki tip süper kompleks oluşturabilirler: respirazomlar (Cx-I, -III ve -IV) 1 ve synthasomes (Cx-V) 2 . ETC&#39;nin süper kompleksler halinde düzenlenmesinin, toplam ETC verimliliğini arttırdığı düşünülürken, her bir kompleksin sağlam bir ETC için bir araya getirilmesi gerekiyor 5,22. Bu süper komplekslerin nasıl bir araya gelip parçalarına ayrıldığı iyi anlaşılmamıştır, ancak burada sunulan proto...

ATP formundaki mitokondrial enerji, sadece hücre sağkalımı için değil, aynı zamanda hücre ölümünün düzenlenmesi için de gereklidir. Oksidatif fosforilasyon ile ATP&#39;nin üretilmesi, fonksiyonel bir elektron taşıma zinciri (ETC; Cx-I ila IV) ve mitokondriyal ATP sentaz (Cx-V) gerektirir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu büyük protein komplekslerinin respirazomlar ve synthasomes 1 , 2 olarak adlandırılan süper kompleksler halinde düzenlendiğini göstermiştir. Bu muazzam komplekslerin ve süper komplekslerin montajını, dinamiklerini ve faaliyet düzenlemelerini analiz etmek zor. Bir oksijen elektrodu ile alınan oksijen tüketimi ölçümleri ve bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilen enzim analizleri, ETC karmaşık aktivitesi hakkında değerli bilgiler verebilirken, bu testler, ilgili protein kompleksinin veya süper komplekslerin varlığı, boyutu ve alt birimi kompozisyonu hakkında bilgi sağlayamaz. Bununla birlikte, mavi ve berrak yerli (BN ve CN) SAYFA 3 , fizyolojik ve patolojik koşullar altında karmaşık kompozisyon, montaj / demontaj ve bu hayati solunum komplekslerinin supramoleküler organizasyonunun dinamik düzenlenmesi hakkında önemli bilgileri açığa çıkarmak için güçlü bir araç yarattı. Bu komplekslerin yüksek mertebeli süper komplekslere birleştirilmesi, mitokondriyal yapıyı ve fonksiyonu düzenler gibi gözükmektedir 5 . Örneğin respirasome düzeneği, elektron transferinin verimliliğini ve mitokondriyal iç zar 5 boyunca proton güdü kuvvetinin oluşmasını arttırır. Buna ek olarak, sentazomların bir araya getirilmesi sadece ATP üretiminin etkinliğini ve enerji eşdeğerlerinin sitoplazma 2&#39;ye aktarılmasını arttırmakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal iç zar da boru şekilli cristae 6&#39;ya kalıplar./ Sup&gt; 7 . Fare embriyolarında kardiyak gelişim sırasında süper kompleks birleştirme çalışmaları, kalpteki Cx-I içeren süper kompleks oluşumunun yaklaşık embriyonik gün 13.5 8&#39;de başladığını göstermektedir. Bazıları, yaşlanma veya iskemi / reperfüzyon yaralanmaları 9 , 10 nedeniyle kalpte Cx-I içeren süper kompleks miktarının azaldığını veya nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesinde rol oynayabileceğini göstermiştir. Bu protokol, ETC kompleksleri ve süper komplekslerinin toplanması ve aktivitesini araştırmak için kullanılabilen yerli jel PAGE için yöntemleri açıklamaktadır. Mitokondriyal süper komplekslerin yaklaşık molekül ağırlığı, protein komplekslerinin CN veya BN poliakrilamid jeller ile ayrılmasıyla değerlendirilebilir. CN PAGE ayrıca tüm mitokondriyal komplekslerin enzimatik aktivitesinin jel içinde doğrudan görselleştirilmesini sağlar (in-jel deneyleri;IGA) 12 . Bu çalışma, CX-I&#39;in IGA yoluyla NADH&#39;yi oksitleme kabiliyetini ve IXA tarafından Cx-V&#39;nin ATP-hidrolize edici aktivitesine bağlı olarak sentazomların varlığını vurgulayarak respirasomların aktivitesini gösterir. Cx-I ve Cx-V içeren çoklu kompleksler ve süper kompleksler, proteinlerin nitroselüloz membranlara aktarılması ve imünoblotlama yapılması ile de gösterilebilir. Bu yaklaşımın avantajı, BN veya CN PAGE&#39;nin genellikle protein komplekslerini fizyolojik büyüklükleri ve bileşimine göre ayırmasıdır; Bir membrana transfer bu bant modelini korur. Bir BN veya CN PAGE&#39;deki protein komplekslerinin analizi, 2D-PAGE (bir gösteri için bkz. Fiala ve diğerleri 13 ) veya sakkaroz yoğunluğu santrifüjleme 14 , 15 ile de yapılabilir. Belirli bir bandı daha ayrıntılı olarak analiz etmek için, BN PAGE&#39;den çıkarılabilir ve bu protein kompleksinden alınan proteinler saflaştırılabilirD onları doğal koşullar altında elektro-eriterek. Doğal elektroelüsyon, birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir, bu da bir jelden proteinlerin çevresindeki tampona pasif difüzyona (Referans 16&#39;da kullanıldığı gibi) önemli bir fark yaratabilir. Özetle, bu yöntemler, yüksek molekül ağırlıklı süper komplekslerin mitokondriyal membranlardan daha fazla karakterize edilmesini sağlayan birkaç yaklaşımı açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Protean II mini jel haznesi</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>Mini jel elektroforezini dökmek ve çalıştırmak için komple set</td></tr><tr><td>Protean XL maxi-jel</td><td>Biorad</td><td>1653189</td><td>Maxi-jel elektroforezini dökmek ve çalıştırmak için komple set</td></tr><tr><td>Gradyan yapıcı, Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>Dökme mini jel gradyanları</td></tr><tr><td>Degrade yapıcı, maxi-jel</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>Dökme maxi-jel gradyanlar</td></tr><tr><td>Transfer kiti</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>Proteinlerin membranlara ıslak transferi için komple set</td></tr><tr><td>Electroeluter model 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>Doğal veya SDS'den proteinlerin elektroelüsyonu SAYFALAR</td></tr><tr><td>Cam plakalar</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>Kısa plakalar</td></tr><tr><td>Cam plakalar</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>Ara plakalar</td></tr><tr><td>Cam plakalar</td><td>Biorad</td><td>1651823</td><td>İç plakalar</td></tr><tr><td>Cam plakalar</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>Dış Plakalar</td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>Doğal elektroforez için uygun güç kaynağı</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Chemolumniscense substrat</td></tr><tr><td>SuperSignal-West Dura</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Geliştirilmiş chemolumniscense substrat</td></tr><tr><td>Film/otoradyografi filmi</td><td>GE Sağlık hizmetleri</td><td>28906845</td><td>Western lekelerinin dokümantasyonu</td></tr><tr><td>Film işlemcisi CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>NA</td><td>Jelfleri, zarları ve lekeleri belgelemek için fotoğraf çekme.</td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640 Fotoğraf makinesi siperliği&nbsp;</td><td>Işıklı bir masada çekilen fotoğraflar için</td> <td>Canon</td><td></td> koruyucu kamera</tr><tr><td>Akrilamid/bisakrilamid</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>%40 önceden karıştırılmış çözelti</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS (sodyum dodesil sülfat)</td><td>İnvitrojen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksişelat</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Lauril maltosid</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Aminoheksanoik asit</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Yerli&nbsp; moleküler ağırlık kiti</td><td>GE Sağlık&nbsp;</td><td>17-0445-01</td><td>Doğal elektroforez için yüksek moleküler ağırlıklı kalibrasyon kiti.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>İsim</strong</td><td>>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Kurşun(II) nitrat (Pb(NO3)2):</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td> İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>anti-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>antikoru ATP sentaz alt birimi ATP5A</td></tr><tr><td>anti-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>antikoru Cx-1 alt birimi NDUFB6 anti-VDAC'a karşı antikor</td></tr><tr><td></td><td>VDAC'a Calbiochem</td><td>529534</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>ECL HRP'ye bağlı antikor</td><td>GE Health Care</td><td>NA931V</td><td>, ATP5A, NDUFB6 ve VDAC'ye ikincil antikor</td></tr><tr><td>Bloke edici reaktif</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Silver boyama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondriyal elektron nakil zincirinin süper komplekslerinin yerli elektroforez, in-jel testleri ve elektroelüsyon ile İncelenmesi

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC), çeşitli yakıtların parçalanmasından elde edilen enerjiyi hücre ATP&#39;nin biyoenerjetik para birimine dönüştürür. ETC, elektron taşıma ve ATP üretiminin verimliliğini arttıran respirasom (CI, C-III ve C-IV) ve synthasomes (CV) süper komplekslerine de dahil olan 5 büyük protein kompleksinden oluşur. ETC fonksiyonunu ölçmek için 50 yılı aşkın süredir çeşitli yöntemler kullanılmıştır, ancak bu protokoller bireysel komplekslerin ve süper komplekslerin montajı hakkında bilgi sağlamamaktadır. Bu protokol, yerli jel poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE), ETC karmaşık yapısını incelemek için 20 yıldan daha önce modifiye edilmiş bir yöntemi açıklar. Doğal elektroforez, ETC komplekslerinin aktif formlarına ayrılmasına izin verir ve bu kompleksler daha sonra immünoblotlama, jel içi deneyler (IGA) ve elektroliz ile saflaştırma kullanılarak incelenebilir. BirleştirerekDoğal jel PAGE&#39;in diğer mitokondriyal deneylerle elde edildiği durumlarda, ETC aktivitesinin kompleman resmini, dinamik birleştirme ve demonte parçasını ve bunun mitokondriyal yapı ve işlevi nasıl düzenlediğini görmek mümkündür. Bu çalışma aynı zamanda bu tekniklerle ilgili sınırlamaları tartışacaktır. Özetle, aşağıda sunulan immünoblotlama, IGA ve elektroelüsyon takip eden yerli PAGE tekniği mitokondrial ETC süper komplekslerinin işlevselliğini ve kompozisyonunu araştırmanın güçlü bir yoludur.

Mitokondriyal süper kompleksleri görselleştirmek için, farelerden yeni izole edilen mitokondri 17 , 18&#39;de kullanıldı. Mitokondriyal süper kompleksler, bazı araştırmacılar için tolere edilebilir olmasına rağmen tekrar tekrar donma ve çözülme döngülerine duyarlıdır ve parçalanmalarına neden olur. Depolama için dondurma gerekiyorsa, en iyi sonuçların elde edilmesi için numunelerin birden fazla donma ve çözülme döngüsünden geçmem...

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Native elektroforezin, jel içi analizler, immunoblotlama ve native elektroelüsyon ile kombinasyonunun genel amacı, mitokondriyal süperkomplekslerin birleşimini korumak ve analiz etmektir. Bu yöntem, bioenerjetik ihtiyaçlar ile fizyolojik ve patolojik koşullar da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak, mitokondriyal elektron taşıma zinciri protein komplekslerinin süperkompleksler şeklinde nasıl birleştiği sorusuna yanıt vermeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, doğru uygulandığında, uzun süren izolasyon işlemi boyunca mitokondriyal süperkomplekslerin fizyolojik bütünlüğünün ve işlevselliğinin korunmasıdır.Bu yöntem, süperkompleks birleşimi dinamiklerini incelemek ve plazma membranındaki protein komplekslerinin yanı sıra diğer hücre içi membranlardaki kompleksleri analiz etmek için de uygulanabilir. Jel içi analizlere hazırlık yaparken, natif elektroforez için kullanılan tüm parçaların deterjanlarla kontamine olmaması kesinlikle kritiktir; çünkü deterjanlar mitokondriyal süperkomplekslerin parçalanmasına neden olur. Şeffaf natif bir jelden bir veya daha fazla şerit kesin ve bunları etiketli bir kaba aktarın.Complex-1 analizini gerçekleştirmek için, 10 mililitre analiz tamponunu 25 miligram nitro blue tetrazolium ve 100 mikrolitre 10 miligram/mililitre NADH ile birleştirin. Bunu, kesilmiş şeffaf doğal jel şeridine veya ilgilenilen bölgeye ekleyin. Bir sarsıcı üzerinde en az üç dakika boyunca hafifçe karıştırarak mavi bantların gelişimini takip edin.Ardından, reaksiyonu durdurmak için jeli 10 ila 20 mililitre asetik asit çözeltisi içinde sabitleyin veya beş milimolar Tris pH 7.4 ile yıkayın. Belgeleme için fotoğraflar çekin. Kompleks-5 analizini gerçekleştirmek için, mavi doğal (blue native) veya berrak doğal (clear native) bir jelden bir jel, bir şerit veya ilgili bir alan elde edin.Örneği, oda sıcaklığında 10 ila 20 mililitre analiz tamponu ve mililitre başına artı veya eksi beş mikrogram oligomycin ile hafif ajitasyon eşliğinde iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tamponu 14 mililitre taze analiz tamponu ile değiştirin. Daha sonra sırasıyla 190 mikrolitre bir molar magnezyum sülfat, 27,28 miligram kurşun nitrat, 60 miligram ATP ve 75 mikrolitre oligomycin ekleyin.Hafif ajitasyonla inkübe edin ve beyaz bir çökelek oluşumunu gözlemleyin; çünkü oligomisinle işlem görmüş jellerdeki bantlar, kompleks-5'ten bağımsız bantlar verecektir. Asidik çözeltiler kurşun çökeleğini çözebileceği için jeli metanol bazlı bir fiksatif ile sabitleyin. Sonuçları fotoğraflayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde protein transferi ve immunoblotting işlemlerini gerçekleştirin.Elektrolüsyon gününde, kullanılacak olan her cam tüpün altına bir frit yerleştirin. Gerekirse, cam tüpü elüsyon tamponuna yerleştirin ve friti içeriden tüpün dibine doğru itin. Fritli cam tüpü Electro-Eluter modülüne yerleştirin.Kuşkayı elüsyon tamponu ile ıslatın ve cam tüpü yerine kaydırın. Cam tüplerin üst kısımlarının kuşkay ile aynı hizada olduğundan emin olun. Boş kuşkayları tıpalarla kapatın.Ardından, silikon adaptörün altına ıslak bir membran kapak yerleştirin ve adaptörü elüsyon tamponu ile doldurun. Diyaliz membranı etrafındaki hava kabarcıklarını gidermek için tamponu ve adaptörü yavaşça aşağı yukarı pipetleyin. Tamponla dolu adaptörü cam tüpün tabanına doğru kaydırın.Ardından, cam tüp içindeki frit üzerinde oluşan tüm hava kabarcıklarını giderin. Her bir cam tüpü elüsyon tamponu ile doldurun. BN-PAGE'den kesilen bantları cam tüplerin içine yerleştirin.Büyük parçaları daha küçük parçalara bölün. Cam tüp içindeki dolum yüksekliğinin yaklaşık bir santimetre olduğundan emin olun. Ardından, modülün tamamını tanka yerleştirin.Tankın içine yaklaşık 600 mililitre soğuk elüsyon tamponu ekleyin. Silikon adaptör kapaklarının tamponun içine daldığından emin olun. Proteinleri soğuk odada, 350 volt gerilimde dört saat boyunca elüye etmeden önce tankın altına bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin.Elüsyon tamamlandıktan sonra, Electro-Eluter modülünü tampon tankından çıkarın ve bir lavaboya veya kaba yerleştirin. Eğer bir tıp kullanılmışsa, üst tampon haznesini boşaltmak için tıpı çıkarın. Her bir cam tüpteki tamponu boşaltın ve atın.Silikon adaptörün yerinde kaldığından ve fritin altındaki sıvının rahatsız edilmediğinden veya çalkalanmadığından emin olun. Ardından, silikon adaptörü ve membran kapağı cam tüpün altından dikkatlice çıkarın. Silikon kapağın içeriğini bir mikrotüpe pipetleyin.Diğer 200 µL elüsyon tamponu ile silikon kapağı durulayıp mikrotübe ekleyin. Bu işlemi tüm cam tüpler için tekrarlayın. Yeniden kullanılabilir membran kapaklarını, 0.5 mg/mL sodyum azid içeren elüsyon tamponu içine yerleştirerek muhafaza edin ve soğutun.Kalp mitokondrilerinden elde edilen süperkompleksler burada jel içi analizler ile görselleştirilmiştir. Berrak doğal (clear native) jel şeritleri, kompleks-1 ve kompleks-5 için jel içi analizlerde kullanılmıştır. Sinyalin özgüllüğü, ATP-sentaz için oligomisin gibi inhibitörler kullanılarak değerlendirilebilir.Jel içi analizler, kompleks-1 veya kompleks-5 aktivitesine sahip bir protein kompleksinin boyutuna ilişkin bilgi sağlar ancak bileşimleri hakkında bilgi vermez. Mavi yerli (blue native) jel, elektroelüsyonla kesilip çıkarılabilecek protein kompleksi bantlarını gösterir. Elektroelüsyondan sonra, elüat; jel içi analizler, elüye edilen proteinlerin yerli veya denatüre elektroforez sonrası gümüş boyaması ve Western blotting gibi ileri analizler için kullanılır.Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu üç günlük süreç; mitokondri izolasyonunu, gece boyunca süren mavi doğal (blue native) maksi elektroforezi ve immünoblotlamayı kapsar. Bu videoyu izledikten sonra, doğal elektroforez, jel içi (in-gel) analizler ve elektroelüsyon kullanarak mitokondriyal süperkomplekslerin nasıl izole edileceği ve tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedür uygulanırken, mitokondriyal süperkomplekslerin kırılgan olduğunun unutulmaması önemlidir. Numunelerin dondurulup çözdürülmesi minimum düzeyde tutulmalıdır. Natif elektroforez ve elektroelüsyon işlemleri buz üzerinde veya soğuk odada gerçekleştirilmelidir.Bu tekniklerin etkileri, her bir süperkompleksin fiziksel bileşimini tanımlamanın ötesine uzanmaktadır. Süperkompleksler doğal formlarında yakalandığı için fonksiyonel analizler gerçekleştirilebilmektedir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mitokondriyal biyoloji alanındaki araştırmacıların, mitokondriyal elektron taşıma aktivitesine dair anlayışlarını ve bunun mitokondriyal hastalığı olan hastalar üzerindeki sonuçlarını yeniden değerlendirmelerinin önünü açmıştır.Bu prosedürün ardından, izole edilen protein komplekslerinin moleküler bileşimi, yapısı veya elektrofizyolojik özellikleri gibi ek soruları yanıtlamak için HPLC, kütle spektroskopisi, elektron mikroskopisi veya patch clamping gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

analyzing-supercomplexes-mitochondrial-electron-transport-chain-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, insan embriyonik kök hücreleri mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri jel faaliyet deneyleri kullanarak nasıl analiz edilebilir size gösterecektir.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Bu videoda, mitokondriyal solunum protein komplekslerinin doğal olarak katlanmış ve işlevsel olarak aktif durumlarında analizi için mavi yerel PAGE adı verilen bir elektroforetik tekniği gösteriyoruz. Anyonik Coomassie mavisi boyası, protein komplekslerinin negatif yüklü hale gelmesine neden olarak boyut ve yapıya göre ayırmaya izin verir.

Mavi Doğal Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Bozulmamış Mitokondriyal Solunum Zinciri Komplekslerinin Analizi için Denatüre Olmayan Bir Ayırma Tekniği

Bu iletişim kuralı tarafından mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez mitokondrial solunum zinciri kompleksleri analizini gösterir. Burada kültürlü insan hücrelerine uygulanan yöntem açıklanmıştır.

Mitokondrial solunum zinciri kompleksleri kültürlü insan hücrelerinde mavi yerli Polyacrylamide Jel Elektroforez ve Immunoblotting kullanarak Analizi

Burada, deterjanlara ve Coomassie Blue 'ya maruz kalmayı en aza indiren mitokondrial süperkompleksleri ayıklamak, çözmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, çözünürlük ve enzim faaliyetlerinin korunması arasında optimum bir denge sunarken, labil protein-protein etkileşimlerini kaybetme riskini en aza indirir.

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Öğrenin, mitokondriyal süperkomplekslerin yerli elektroforez, in-jel testleri ve elektroelüsyon ile ayrıştırılması ve analizi. Bu yöntem, hücresel enerji metabolizması ve hastalık durumlarındaki rolünü anlamak için değerlidir.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi (Video) | JoVE Journal

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Daha fazla video keşfet