Name: Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu Ambystoma mexicanum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Öğrenin Ambystoma mexicanum damar yapısını DiI boyama ve perfüzyon yöntemiyle görselleştirmeyi. Bu teknik rejeneratif tıpta doku yenilenmesi ve revaskülarizasyon çalışmalarına ışık tutar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Brigham &amp; Kadın Hastanesi ve Dimes Mart ayı tarafından desteklendi. Yazarlar, Whited Lab&#39;ın tüm üyelerine, destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür etmek istiyorlar.

Tüm axolotl deneyleri Brigham ve Kadın Hastanesi (BWH) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;ne uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Perfüzyon Deneyi oluşturun <ol><li> Yetişkin bir aksolotu% 15 tricaine solüsyonu (MS222) ile dolu plastik bir kapta 15-20 dakika boyunca veya tamamen anestezi edilinceye kadar yerleştirin. Kabın, aksolotl tamamen suya batırılmış olacak şekilde yeterli tricaine solüsyonu ile doldurulduğundan emin olun. Not: Bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmelidir. BWH&#39;de, bir ayak-sıkışması testinde başarısız olduğunda bir aksolot&#39;un tamamen anestezi altına alındığı düşünülür; yani, ayak hafifçe sıkıldığında refleksive bir hareket yoktur. Dikkat: Tricaine, suda yaşayan organizmalar için özel olarak kullanılan anestezik olmasına rağmen, tricaine solüsyonuyla doğrudan cilt temasından kaçınılmalıdır. </li><li> Axolotl perfüzyon istasyonunu kurun. <ol><li> YerleştirinEmici ped, emici taraf yukarı bakacak şekilde düz, düz bir yüzeye yerleştirilir. </li><li> Polystyrene foam çerçevesinde, anestezi uygulanmış axolotl&#39;un sırtüpe yerleştirilmesi için uygun boyut ve şekle sahip bir delik açın. Çerçeveyi emici ped üzerine yerleştirin. Not: İlave emici olması için bazı ilave kağıt havluları çerçevenin hemen altına yerleştirilebilir. </li><li> Peristaltik pompayı perfüzyon hortumu ile yükleyin. Pompayı, saat yönünde akan 0,7 ml / dakika akış hızına ayarlayın. </li><li> 1: 4 oranında 0.7x PBS ve% 5 glukoz ile seyreltici solüsyon yapın. </li><li> 10 mL seyreltici solüsyonu 50 mL&#39;lik konik bir tüp içerisinde 200 μL DiI stok solüsyonuyla karıştırın. Kap ve karıştırarak karıştırın. Işık solüsyonunu ışığa maruz kalmamak için alüminyum folyo kağıdıyla tüpü kapatın. Not: Ciltler orantılı olarak axolotl boyutuna göre değiştirilmelidir. Bu değerler, yaklaşık 15 cm&#39;lik bir aksolot (burun-kuyruk uzunluğu) içindir. birBu büyüklükteki nimals tam cinsel olgunluğa ulaşmamış olabilir, bu nedenle hayvan cinsiyeti şu anda belirlenemeyebilir. </li><li> 0.7x PBS ile 50 mL konik tüpe doldurun. Not: PBS döngü ve axolotl salınmasını önlemek için kullanılacaktır. </li><li> Perfüzyon borusunun çıkış ucuna 27 ayarlı kelebek iğne takın. Kelime kanatlarını birbirine katlayın ve kelepçe standına yerleştirin. </li><li> 0.7x PBS ile dolu 50 mL konik tüp içine perfüzyon tüpünün serbest ucunu yerleştirin ve tüm tüp çözelti dolana kadar perfüzyon pompası çalıştırın. Tüm hortum PBS ile doldurulduktan sonra pompayı duraklatın. Not: Tüpün daima hava kabarcığı olmadığından emin olun, aksi takdirde bunlar aksolotlun içindeki hava embolisine neden olur ve tam perfüzyonu önler. </li><li> Polistren köpük çerçevesindeki aksolot şeklindeki kalıba bir kağıt havlu yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak havluyu tricaine solüsyonuyla ıslatın. Not: Kağıt çekirken ortasında küçük bir kareyi kesinPerfüzyon prosedürü sırasında sıvıların drenajına izin vermek için. </li><li> Polestiren köpük çerçevenin içindeki kağıt havlu üzerine anestezi altındaki axolotl yatağını yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Axolotl Göğüsün Açılması <ol><li> Cerrahi forseps kullanarak cildi, omuzların çizgisinin hemen altındaki aksolot göğsünün merkez ekseni boyunca tutturun. Çekilin. </li><li> Derinin çekildiği küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. </li><li> İki kıkırdak tablası ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde bir kare deri parçasını çıkarın. <ol><li> Kalbi açıkça görebilmek için yeterince büyük olan ve kalpten ayrılan yaklaşık 5 mm aorta göğüs boşluğunun üzerinde bir pencere açmak için cildi çıkarın. </li></ol></li><li> Büyük kan damarlarının kesilmesini önlemek için bağ dokusunu forseps veya kapalı makas kullanarak dikkatlice yırtın. </li><li> Her bir kıkırdak tablasını forseps kullanarak tek tek kaldırın ve onlarıCerrahi makasla </li><li> Dikkatle forseps ile perikard tutun, çekin ve cerrahi makas kullanarak delin; Bu kesik çok ince perikardı delmek için yeterince derin olmalıdır ve perikardın çıkarılmasına izin verecek kadar büyük olmalıdır. Kalbi kesmemeye özen gösterin. </li><li> Kalbi ve aortu ortaya çıkarmak için dikkatlice perikardı çıkarın. Not: Bir transfer pipeti kullanarak, periyodik olarak bölgeyi açık tutmak ve aksolotu anestezi altında tutmak için göğüs boşluğunu ve solungaçları tricaine solüsyonuyla yıkayın. </li></ol> 3. Axolotl&#39;ın perfüzyonu <ol><li> Yüklü kelebek iğne ile kelepçe standını polistiren köpük çerçevesinin yanına yerleştirin, böylece kelepçenin kolu iğneyi aksolotlu aortaya sokmak için kolaylıkla manipüle edilebilir. Ekleme esnasında iğnenin ucunu hayvanın rostral yönüne doğru tutun ve iğne boyunca delmeden kaçınmak için iğneyi aorta paralel tutunPosite tarafı. </li><li> Peristaltik pompayı açın. 0.7x PBS borudan akmaya devam etmelidir. </li><li> İğneyi aorta yerleştirin. <ol><li> Forsepsi aortik kemerin altına kaydırın ve kolay erişmek için hafifçe yukarı çekin. </li><li> İğne kelepçesi kombinasyonunu, iğnenin aortun uzunluğu boyunca kafaya doğru ilerlediği şekilde manevra edin. Aortun arkasındaki destek için forseps kullanırken iğneyi yerleştirin. Not: İğne, perfüzyon sırasında kaymayacağından emin olmak için aortun içine yeterince derin yerleştirilmelidir. Bu, 15 cm&#39;lik bir aksolot için yaklaşık 5 mm olabilir. Geminin tam delinmesini önlemek için iğnenin aort ile tam uyumlu olduğundan emin olun. Through-and-through delikleri büyük kanamalara neden olabilir ve perfüzyon başarı oranlarını düşürebilir. Başarılı yerleştirme, kalbin atriyumunun görünür biçimde genişlemesi ile teyit edilebilir. </li></ol></li><li> Bilimlerle bir atriyumu çabucak yaralayınSsors ve kan tahliye etmesine izin ver. <ol><li> Göğüs boşluğunda kan birikimi ve pıhtı oluşumunu önlemek için tricaine solüsyonu ile yıkayın. </li></ol></li><li> Aksolotiyi yaklaşık 20-30 mL PBS ile boşaltın. Hayvan, başarılı bir perfüzyonda açık pembeden beyaza beyaza dönüşmelidir. </li><li> Peristaltik pompayı duraklatın ve borunun serbest ucunu 15 mL DiI çözeltisindeki tüpün içine alın. Pompayı yeniden başlatın, hortumda hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin. </li><li> Aksolot&#39;u DiI&#39;nin tüm çalışma stokuyla arıtın. Not: Başarılı bir perfüzyonda, aksolotl DiI&#39;nin parlak pembe renge dönüşür. Solungaçlarda bu en belirgin olacaktır. </li><li> DiI ile perfüzyon tamamlandıktan sonra pompayı duraklatın ve dokuyu düzeltmek için hortumun serbest ucunu% 4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi içine yerleştirin. Pompayı yeniden başlatın ve en az 10 mL PFA&#39;yı perfüze edin. Dikkat: PFA toksiktir ve ele alınmalı ve kullanılmamalıdır.Uygun bir şekilde sed. Eldiven ve koruyucu gözlük takılmalı ve çözümler bir davlumbazın içinde yapılmalıdır. Doku düzeltmek için aksolotlun PFA ile perfüzyonu hayvanın ölümüyle sonuçlanır. </li></ol> 4. Perfüzyonun ve Görselleştirme Hazırlığının Sona Erdirilmesi <ol><li> Peristaltik pompayı durdurun ve iğneyi aksolotlu aortadan çıkarın. </li><li> Aksolot&#39;u plastik bir plakaya yerleştirin. Not: Büyük bir Petri kabının yarısını kullanmanız iyi bir sonuçtur ve cildini ıslak tutmak ve görselleştirme kalitesini iyileştirmek için küçük miktarda Tricaine veya PBS&#39;yi axolotl üzerine dökmeye izin verir. </li><li> Kullanılmış tüm malzemeleri uygun çöp bidonlarına atın. % 70 etanol ile cerrahi aletleri temizleyin, hayvanlar arasında cam boncuk sterilizatör kullanarak dezenfekte edin ve prosedürü izleyen otoklavla sterilize edin. Boruyu PBS çözeltisiyle yıkayın ve daha sonra boşaltın, tamamen kurutun ve daha ileri bir kullanım için saklayın. </li></ol> 5. Perfused Axolotl&#39;ın görselleştirilmesi <ol&gt; <li> Aksolotl&#39;u floresan bir konfokal mikroskop altında yerleştirin. </li><li> Işıkla DiI lekeli kapların görselleştirilmesi engellendiği için ışıkları kapatın. </li><li> Aksolotlun vaskülatürünü görselleştirmek için konfokal mikroskop ile yeşil bir fluoresans emisyon filtresi küpü ( örn. ET-CY3) kullanın. 545 nm dalga boyundaki uyarılma ışığını kullanın. Not: Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için aşağıdaki parametreler kullanılabilir: 1.1 s için pozlama, 1 kat artışı, 1.0 doygunluk, 2X büyütme. </li></ol>

<ol><li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryo%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374(2013).</li>
<li>Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23328838"> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li>
<li>Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.formatex.info/microscopy4/29-39.pdf"> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li>
<li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4895330/">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li>
<li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li>
<li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Aksolotlun vaskülatürünün görselleştirilmesi lipofilik karbosiyanin boyası DiI ile perfüzyon yoluyla başarıyla başarılabilir. Bu çalışmada, bir peristaltik pompa kullanarak diolotl&#39;in diI ile perfüzyonu için yeni bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca bir floresan konfokal mikroskop kullanarak axolotl damar sisteminin daha sonraki görselleştirmesini gösteririz. Bu protokol, Li ve ark.&#39;ında görülen kemirgen DiI perfüzyon protokolünün bir uyarlamasıydı . 7 , ancak kemirgen i...

Vaskülatürün görselleştirilmesi, birçok canlıda organizmaların yapı ve işlevlerinin anlaşılmasında hayati bir rol oynamaktadır. 16. yüzyılda Leonardo da Vinci ile başlayan dolaşım modelleri ve grafik gösterimleri incelenmiştir. Balmumları ve kauçuk kalıpları kullanarak dokular, organogenez ve patogenez 1 , 2 çalışmasına izin veren vaskülatürün üç boyutlu modellerini oluşturmak için perfüze edildi. Reçineler ve mumlar Hindistan Mürekkebi veya karmin kırmızısı gibi boyalarla renklendirildi ve 1 , 2 kolay görselleştirmelerine izin verdi. Bununla birlikte, bu teknikler yüksek viskozite nedeniyle ilgi dokularının tam perfüzyonunu engellediğinden pek çok soruna neden olmuştur. Alan daha sofistike hale geldiğinde, konfokal ve elektron mikroskoplarının kullanımı, perfüzyon tekniğini<html> Döküm kalıplarından ve vaskülatürün sıvı perfüzyonlarına doğru uzanır, bazıları ilk dokuyu yok etmeden kan damarlarının perfüzyon ve görüntülemesine izin verir 3 . DiI, flüoresan bir karbosiyanin boyası, hayvanların vasküler dokuya zarar vermeden perfüzyonuna izin veren böyle bir leke oluşturmaktadır. Karbosiyanin boyaları, temas üzerine hücre zarlarına dahil edilen lipofilik boyalardır. Bu boyalar vasküler endotel hücrelerinin kolay ve anında lekelenmesine izin verir, bu da floresan bir konfokal mikroskop altında izlenebilir. Nöronların etiketlenmesinde ve izlenmesinde gösterildiği gibi DiI, yanal difüzyon yoluyla hücrelerin lipid zarında hareket eder 4 . Kimyasal olarak, DiI&#39;nin iki alkil zinciri boya hücre zarları için yüksek afiniteye sahipken, yeşil flüoresan ışık filtreleri tarafından uyarıldığında kırmızı bir dalga boyu yaymaktan sorumlu bir florokromdan iki eşlenik halka&gt; 4. DiI, plazma membranının başarılı bir şekilde etiketlenmesi ve nöronlarda anterograde ve retrograd etiketleme de dahil olmak üzere birçok kapasitede kullanılmıştır 5,6. DiI, daha önce, farelerin vaskülatürünü görselleştirirken perfüzyon protokollerinde kullanılmıştır 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ), Mexico City, Meksika yakınlarındaki hafif tuzlu gölde yaşayan tezahüratçılardır. Bu hayvanlar, tam ekstremiteler, kuyruk (sinir kablosu dahil), kalp ve diğer iç organların bölümlerini ve yetişkinler 8 , 9 gibi göz kısımlarını yenileyebildikleri için rejeneratif işlemleri anlamak için önemli bir model haline gelmiştir. Ayrıca, son zamanlarda aksolotlarda genetik araçların uygulanmasıyla, bu süreçleri yönlendiren moleküllere ve hücrelere benzeri görülmemiş bir fikir verilmesi artık mümkündür. Başarılı rejimTüm ekstremitenin rasyonunda, oksijen ve besin sağlanmasındaki kan damarlarının sadece geleneksel işlevlerinin ötesinde yenilemede önemli bir rol oynayabilecek kapsamlı bir revaskülarizasyon süreci gereklidir. Doku rejenerasyonu bağlamında revaskülarizasyonu anlamak zorunludur. Axolotl kan damarları daha önce Hindistan Mürekkebi kullanılarak görselleştirildi ve sonuç ilginç iken, sonraki süreçte bu süreç tekrar gözden geçirilmedi 10 . Memelilerde kullanılmak üzere geliştirilmiş bir DiI perfüzyon protokolünü tam bir perfüzyona ve axolotl vaskülatürünün görselleştirilmesine izin vermek için uyarlamaya çalıştık. Bu protokol, DiI boyama tekniği ile başarılı bir şekilde perfüzyon yapmak ve ardından aksolotil dolaşımı görselleştirmek için atılan adımları açıklar. Bu prosedür, homeostatik dokularda patent kan damarlarının hassas şekilde görüntülenmesine ve dokuların yenilenmesine olanak tanır ve görselleştirme için yeni bir yöntem sunarN ve axolotl&#39;deki revaskülarizasyon sürecinin analizi.

<table><tbody><tr><td>Peristaltik Pompa&nbsp;</td><td>Marshall Bilimsel&nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon tüpü</td><td>Excelon Laboratuvarı & Vakum Boru</td><td>436901705</td><td>boyutu S1A</td></tr><tr><td>27g kelebek iğne</td><td>EXELint Tıbbi Ürünler</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<>4&nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioktadesil-3,3,3&prime;,3&prime;- tetrametilindokarbosiyanin perklorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (% 100 hacim / hacim)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi foreceps ve nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren köpük çerçeve</td><td></td><td></td><td>aksolotl şeklinde&nbsp; kesilmiş herhangi bir polistiren köpük karesi</td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Neşter&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Emici alt ped</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standart tek kullanımlık transfer pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Kelepçe standı</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Trikain toz</td></tr><tr><td>Yetişkin aksolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tanklar</td><td></td><td></td><td>Aksolotl için uygun değişen boyut</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Mikroskop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Floresan Filtre</td><td>Leica</td><td>M205FA / M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasküler görselleştirme İçin bir yöntem olarak dii perfüzyonu<em&gt; ambystoma mexicanum</em

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfüzyon teknikleri dokuların dolaşımını görselleştirmek için yüzyıllar boyunca kullanılmıştır. Axolotl (Ambystoma mexicanum), rejenerasyon çalışmaları için önemli bir model olarak ortaya çıkan bir semender çeşididir. Bu hayvanlarda rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyonun nasıl gerçekleştiği hakkında pek az şey bilinmektedir. Burada 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) perfüzyonu ile axolotl vaskülatürün görselleştirilmesi için basit bir metodu sunuyoruz. DiI, endotel hücrelerinin plazma membranına anlık olarak giren bir lipofilik karbosiyanin boyadır. Perfüzyon, periyodik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir; böylece DiI, aort üzerinden dolaşıma girer. Perfüzyon sırasında, boya, aksolot&#39;un kan damarları boyunca akar ve temas üzerine vasküler endotel hücrelerin lipid iki katmanına dahil edilir. Perfüzyon işlemi sekiz inçlik bir aksolot için yaklaşık bir saat sürer. Perfüzyon sonrası hemenDiolotl, konfokal flüoresan mikroskop ile görselleştirilebilir. DiI, yeşil-floresan filtresi ile heyecanlandığında kırmızı-turuncu renkte ışık yayar. Bu DiI perfüzyon prosedürü aksolotların vasküler yapısını görselleştirmek veya rejenere dokularda revaskülarizasyon modelleri göstermek için kullanılabilir.

<html> DiI boyama ile, aksolotlu damar sistemi kolaylıkla görselleştirilebilir. Lipofilik boya ile perfüze edilen hayvanların kan damarları flüoresan konfokal mikroskop altında hemen görülebilir. Şekil 1..1-1.5 , perfüzyon protokolünün şematik bir temsilidir. Parlak pembe boya ile perfüzyon yapıldıktan sonra, başarılı bir şekilde akıtılmış bir aksolotl pembe görünür. Konfokal mikroskopta yeşil bir fluoresan filtre kullanarak vasküler ağın kır...

Bir lipofilik 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir.

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Bu prosedürün genel amacı, aksolotl'un damar sistemini görselleştirmektir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanında, aksolotllarda rejenerasyon geçiren dokuların revaskülarizasyonunun karmaşıklığına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu vasküler görselleştirme tekniğinin temel avantajı, hayvanın tüm kan damarlarının standart bir floresan mikroskobu altında kolayca görüntülenebilmesidir.Bu yöntem aksolotl uzuv rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de; kuyruk, kalp, gözler, solungaçlar veya diğer organlar gibi diğer dokulara da uygulanabilir. Aksolotl göğüs kafesini açmadan önce, ayak parmağını sıkıştırarak sedasyonun uygun düzeyde olduğunu onaylayın. Ardından, cerrahi pens kullanarak göğsün orta aksı boyunca, omuz hattının hemen altındaki deriyi sıkıştırın.Bir skalpel kullanarak, derinin yukarı çekildiği noktadan bir insizyon yapın ve iki kıkırdak plakayı açığa çıkarmak için göğüs üzerindeki kare şeklinde bir deri parçasını kaldırın. Ardından, torasik kavite üzerinde bir pencere açın ve ana kan damarlarını kesmeden bağ dokusunu dikkatlice yırtın. Her bir kıkırdak plakayı tek tek kaldırmak için pens kullanın ve her bir plakayı cerrahi makasla eksize edin.Açığa çıkmış perikardiyumu forsepsle dikkatlice tutun. Dokuyu yukarı çekip cerrahi makasla, kalbe zarar vermeden perikardiyumu kaldıracak kadar derinlemesine delin. Ardından, kalbi ve aortu açığa çıkarmak için perikardiyumu nazikçe uzaklaştırarak, kalpten dallanan aortun yaklaşık beş milimetrelik kısmında kalbi net bir şekilde görüntüleyin.Aksolotlu perfüze etmek için, kelepçe kolunun iğne yerleştirme sırasında kolayca hareket ettirilebilmesi amacıyla, yüklü bir kelebek iğneye sahip kelepçe standını polistiren köpük bir çerçevenin yanına yerleştirin. Pompa tüplerinden 0.7x PBS akıtmak için peristaltik pompayı çalıştırın ve iğne ucunu rostral yöne doğru yönlendirin. Penseti aortik arkın altına kaydırın ve hafifçe yukarı çekin.Ardından, iğne aort boyunca hayvanın başına doğru ilerleyecek şekilde iğne-klempe kombinasyonunu yönlendirin ve forsepsi destek için aortun arkasında tutarak iğneyi aortun içine yaklaşık beş milimetre kadar yerleştirin. Başarılı bir yerleştirme, kalp atriyumlarının görünür şekilde genişlemesiyle teyit edilebilir. Bir atriyumu hızlıca laseleterin ve kanın boşalmasını sağlayın.Ardından, axolotl'u yaklaşık 20 ila 30 mililitre PBS ile perfüze edin. Başarılı bir perfüzyondan sonra, hayvanın rengi açık pembeden beyaza dönmelidir. Tüm PBS perfüze edildiğinde, peristaltik pompayı durdurun ve tüpün boş ucunu 15 mililitrelik bir Dil çözeltisi tüpüne taşıyın.Hortumda hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek pompayı yeniden çalıştırın ve hayvanı hazırlanan Dil stok çözeltisinin tamamıyla perfüze edin. Başarılı bir perfüzyonda axolotl, özellikle solungaçlarında belirgin olacak şekilde parlak pembe bir renk alacaktır. Tüm Dil perfüze edildiğinde pompayı durdurun ve hortumun boşta kalan ucunu %4'lük paraformaldehit çözeltisine yerleştirin.Ardından, pompayı yeniden çalıştırın ve en az 10 mililitre fiksatif perfüzyonu gerçekleştirin. Paraformaldehitin tamamı uygulandığında, pompayı durdurun ve iğneyi çıkarın. Aksolotlu plastik bir kaba aktarın ve kabı floresan mikroskop tablasına yerleştirin.Ardından, ışıklar kapalıyken, kırmızı turuncu ışık yayan Dil'in eksitasyonuna izin veren bir filtre seçin. Başarılı bir perfüzyondan sonra, Dil boyası; kuyruk, uzuvlar, solungaçlar ve gözler dahil olmak üzere tüm aksolotl dokularında kırmızı bir giriş sinyali olarak görülür. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütülürse bir saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, göğüs boşluğunu açarken ana kan damarlarına veya kalbe zarar vermemeye dikkat etmek ve tam kat delinmeleri önlemek için iğneyi aort ile aynı hizada yerleştirmek önemlidir. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak için iskelet preparasyonları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyomedikal alandaki araştırmacıların farklı türlerin damar sistemlerini keşfetmelerinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, Dil karbosiyanin boyası ile aksolotla kalbe perfüzyonunun nasıl gerçekleştirileceğine dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. İğneler ve paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve işlem sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Modifiye edilmiş Landis tekniği, mikroperfüzyon teknikleri kullanılarak kontrol ve test koşulları altında normal ve genetik olarak modifiye edilmiş sıçanların mezenterindeki tek tek mikro damarların hidrolik iletkenliğinin eşleştirilmiş ölçümünü sağlar. Fizyolojik koşullar altında mikrodamar geçirgenliğini ve transvasküler değişimi düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için uygun bir yöntem sağlar.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Burada ekokardiyografi protokolleri kalbi amfibi semender (Ambystoma mexicanum), kalp yeniden oluşturma işlemi bir modeli türler, iki boyutlu ve üç boyutlu görüntü edinimi için mevcut. Bu yöntemler ile kardiyak fonksiyonların yüksek bir kronolojik zamanmekansal çözünürlükte boyuna değerlendirilmesi için olanak sağlar.

Amfibi (Ambystoma Mexicanum) 2D ve 3D ekokardiyografinin yeri

Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Bir protokol mesane, prostat, cinsel organlar, kemik, kas ve ayak derisi de dahil olmak üzere fare alt vücut, yerinde perfüzyon için açıklanmıştır.

Farelerde Alt Karın Organları nın ve Arka Ekstremitelerin Situ Kapalı Devre Perfüzyonunun Oluşturulması

Bu protokol, FVB farelerde arka bacak kangrenini indüklemek için femoral arter ve ven elektrokoagülasyonunu nitrik oksit sentaz inhibitörü uygulamasıyla birleştiren benzersiz, klinik olarak ilgili bir periferik arter hastalığı modelini tanımlamaktadır. İntrakardiyak DiI perfüzyonu daha sonra ayak yastığı vaskülatürünün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülenmesi için kullanılır.

Murin Arka Ekstremite Kangren Modelinde Footpad Vaskülatürünün Yüksek Çözünürlüklü Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Burada, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için Afrika pençeli kurbağalarından doku örnekleri hazırlamak için etkili bir hızlı kan perfüzyon protokolü sunulmaktadır.

Ksenopusta etkili hızlı kan perfüzyonu

Bu protokol, yükleme, bakım ve değerlendirme prosedürlerinin bir açıklamasıyla birlikte yüksek verimli temel ve translasyonel insan kanseri araştırmaları, gelişmiş ilaç taraması, hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları gerçekleştirmek için fizyolojik olarak ilgili bir çip üzerinde tümör modeli sunar.

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Öğrenin Ambystoma mexicanum damar yapısını DiI boyama ve perfüzyon yöntemiyle görselleştirmeyi. Bu teknik rejeneratif tıpta doku yenilenmesi ve revaskülarizasyon çalışmalarına ışık tutar.

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu

Daha fazla video keşfet