Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu Ambystoma mexicanum

Bu prosedürün genel amacı, aksolotlun damar sistemini görselleştirmektir. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanında, aksolotldaki rejenere dokuların revaskülarizasyonunun karmaşıklıkları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu vasküler görselleştirme tekniğinin temel avantajı, hayvandaki tüm kan damarlarının standart bir floresan mikroskobunda kolayca görüntülenebilmesidir.

Bu yöntem aksolotl uzuv rejenerasyonu hakkında fikir verebilse de, kuyruk, kalp, gözler, solungaçlar veya diğer organlar gibi diğer dokulara da uygulanabilir. Aksolotl göğsünü açmadan önce, önce ayak parmağınızı sıkıştırarak uygun sedasyon seviyesini onaylayın. Ardından, cildi göğsün merkezi ekseni boyunca, omuz çizgisinin hemen altında sıkıştırmak için cerrahi forseps kullanın.

Bir neşter kullanarak, cildin yukarı çekildiği yerde bir kesi yapın ve iki kıkırdak plakasını ortaya çıkarmak için göğsün üzerinde kare bir deri parçası çıkarın. Ardından, göğüs boşluğunun üzerine bir pencere açın ve herhangi bir ana kan damarını kesmeden bağ dokusunu dikkatlice yırtın. Her bir kıkırdak plakasını ayrı ayrı kaldırmak için forseps kullanın ve her plakayı cerrahi makasla çıkarın.

Açıkta kalan perikardları forseps ile dikkatlice sıkıştırın. Dokuyu yukarı çekmek ve cerrahi makasla, kalbe zarar vermeden perikardını çıkaracak kadar derine delmek. Ardından, kalbi ve aortu ortaya çıkarmak için perikard'ı nazikçe çıkarın, kalbi aortun yaklaşık beş milimetresinde net bir şekilde görmek ve kalpten dallanmasını sağlayın.

Aksolotl'u perfüze etmek için, polistiren köpük çerçevenin yanına yüklü bir kelebek iğneli bir kelepçe standı yerleştirin, böylece kelepçenin kolu iğne yerleştirme için kolayca manipüle edilebilir. 0.7x PBS'yi pompa hortumundan akıtmak için peristaltik bir pompayı açın ve iğne ucunu rostral yöne doğru tutun. Forsepsleri aort kemerinin altına kaydırın ve hafifçe yukarı çekin.

Daha sonra, iğne kelepçesi kombinasyonunu, iğne aortun uzunluğu boyunca hayvanın kafasına doğru ilerleyecek şekilde manevra yapın ve iğneyi aortun içine yaklaşık beş milimetre yerleştirin, forsepsleri destek için aortun arkasında tutun. Başarılı bir yerleştirme, kalp kulakçıklarının gözle görülür şekilde genişlemesi ile doğrulanabilir. Bir atriyumu hızla yırtın ve kanın akmasına izin verin.

Ardından, aksolotl'u yaklaşık 20 ila 30 mililitre PBS ile perfüze edin. Başarılı bir perfüzyondan sonra, hayvanın rengi açık pembeden beyaza dönmelidir. PBS'nin tamamı perfüze edildiğinde, peristaltik pompayı duraklatın ve borunun serbest ucunu 15 mililitrelik bir Dil çözeltisi tüpüne taşıyın.

Boruda kabarcık oluşmamasına dikkat ederek pompayı yeniden başlatın ve hayvanı tüm çalışan Dil stoğu ile perfüze edin. Başarılı bir perfüzyonda, aksolotl solungaçlarda en belirgin olacak parlak pembe bir renge dönüşecektir. Dil'in tamamı perfüze edildiğinde, pompayı duraklatın ve borunun serbest ucunu %4 paraformaldehit çözeltisine yerleştirin.

Ardından, pompayı yeniden başlatın ve en az 10 mililitre sabitleyici perfüze edin. Paraformaldehitin tamamı uygulandığında, pompayı durdurun ve iğneyi çıkarın. Aksolotl'u plastik bir tabağa aktarın ve tabağı bir floresan mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından, ışıklar kapalıyken, kırmızı turuncu bir ışık yayan Dil'in uyarılmasına izin veren bir filtre seçin. Başarılı bir perfüzyondan sonra, Dil boyası kuyruk, uzuvlar, solungaçlar ve gözler dahil olmak üzere tüm aksolotl dokularında kırmızı bir kabul sinyali olarak görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa bir saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, göğüs boşluğunu açarken ana kan damarlarını veya kalbi yırtmamaya dikkat etmeyi ve delinmeleri önlemek için iğneyi aort ile aynı hizaya sokmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için iskelet hazırlıkları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, biyomedikal alandaki araştırmacıların farklı türlerin damar sistemini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, aksolotlun karbosiyanin boyası ile kardiyak perfüzyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız, Dil. İğneler ve paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.