Name: Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran vezikülleri hazırlayarak yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek için sitoplazma replasman tedavisi uygulama yöntemini. Bu teknik, yaşlanma araştırmalarında yeni tedavi yaklaşımları geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Li Ka Shing Vakfı, Guangdong Yüksek Düzeyli Üniversite Projesi &quot;Deniz Teknolojileri için Yeşil Teknolojiler&quot;, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) ve Guangdong Eğitim Bölümü (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

8 ila 12 haftalık BALB / c fareleri Shanghai Experimental Animal Center&#39;dan (Shanghai, Çin) satın alındı ​​ve spesifik patojen içermeyen ve klimalı bir hayvan tesisinde yetiştirildi. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Shantou Üniversitesi tarafından kurulan laboratuar hayvanlarının kullanımı ve bakımına ilişkin esaslara uygundu. 1. Cihazın Montajı <ol><li> Steriliyet sağlamak için, kullanmadan önce 30 dakika boyunca bir doku kültürü kapağının UV ışığını açın. </li><li> Tek kullanımlık bir 25 mm filtre ünitesinin vidalarını sökün ve ünitenin altını ve altını 30 dakika süreyle% 75 etanol ile dolu 200 mL&#39;lik bir cam kaba batırın. Ünite tıbbi sınıf polipropilenden yapılmıştır. </li><li> Forsep kullanarak ünitenin alt kısmını ve altını kaldırın, kalan etanolü elle çalkalayın ve parçaları havalandırmanın başında 10 dakika boyunca kurumasına izin verin. </li><li> PBS&#39;de 19 mm&#39;lik bir polikarbonat zar yerleştirin ve şişenin destekleyici matrisinin üzerine dikkatlice yerleştirin.Ünitenin m. Polimer filmin pürüzsüz, düz bir yüzeyi ve iz sürüklenmiş 3 um gözenekleri vardır. </li><li> Kapağı alt tarafa sıkıca vidalayarak üniteyi yeniden monte edin. Zarın merkezden ayrılmadığından emin olun. </li><li> 1 mL&#39;lik bir insülin şırınganın iğnesini çıkarın ve 1 mL&#39;lik PBS&#39;yi çekin. Şırıngayı filtre ünitesine takın ve ardından üniteyi ıslatmak ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını test etmek için PBS&#39;yi ünite boyunca itin. </li></ol> 2. Plazma Membran Vesiküllerinin Üretimi (PMV&#39;ler) <ol><li> Nemeth ve diğerleri tarafından bildirilen bir BMSC kültürü oluşturun . 15 ,% 15 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM kültür ortamında. Hücreleri 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 içeren nemli bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu bir plakada yetiştirin. </li><li> Hücreleri yaymak için, kültür ortamını çıkarın ve kuyu, 0.5 mL kalsiyum içermeyen PBS ile durulayın. </li><li> 0.5 mL% 0.25 tripsin-EDTA ilave edin ve hücreleri 37 ° C&#39;de inkübe edin.3 dakika boyunca. Hücrenin ayrılmasını kolaylaştırmak için plakaya birkaç kez elinizin avucuna dokunun. 1 mL kültür ortamı ekleyerek sindirimi durdurun. </li><li> 15 mL konik tüp içindeki hücreleri toplayın ve tezgah üstü santrifüjde 200 xg&#39;de 2 dakika döndürün. 4 ml kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 6 oyuklu bir plakanın iki kuyucuğuna bölün. NOT: Hücreler genellikle yaklaşık 24 saatte konfluansa gelirler. </li><li> PMV&#39;ler üretmek için tripsin sindirimi ile 6 oyuklu bir plakanın bir kuyudan (yaklaşık 5 x 10 5 hücre) hücreleri hasat edin ve 0.5 mL kültür ortamındaki hücreleri tek dağılım haline getirin. </li><li> Hücreleri insülin şırınga içine yükleyin, filtre ünitesine takın ve hücreleri filtre boyunca sıkıştırmak için pistonu çabucak bastırın. Sıkıştırılmış ortamı atın, çünkü içinde yalnızca birkaç PMV bulunmalıdır. </li><li> Şırınga içine 0.5 mL daha ilave edin ve çabucak filtreye itin. Içeren ikinci ekstrüzyon ortamı toplandı.Çeşitli boyutlarda PMV&#39;ler. </li><li> Toplanan aracın 150 μL&#39;sini bir 35 mm&#39;lik cam altı tabağa yükleyin ve PMV&#39;lerin yaklaşık 10 dakika boyunca tabana çökelmesine izin verin. PMX&#39;leri, 20X objektif lensi kullanarak bir CCD kamera ile donatılmış ters faz kontrast mikroskopu altında inceleyin. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskopi Kullanılarak PMV&#39;ler İçerisinde İçerik İncelenmesi <ol><li> BMSC&#39;lerde transfeksiyon yapmak için, 50 μL serumsuz DMEM&#39;de 2 μg süper sargılı plazmid DNA ve 6 μL katyonik transfeksiyon reaktifini ( örn., PolyJet) sulandırın. Tüpün kenarlarından tüm sıvıyı toplamak için iyice karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin. </li><li> Seyreltilmiş çözelti damla damla DNA çözeltisine damla damla ilave edin (adım 3.1&#39;den), kuvvetli bir şekilde 1 dakika vorteksleyin, kısaca döndürün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Gecelik yaklaşık% 30 birleşimde tohumlanmış olan BMSC&#39;lerdeki eski aracı maddeyi 2 mL taze kültür ortamı ile değiştirin ve DNBir transfeksiyon karışımı damla damla. </li><li> 12 saatlik transfeksiyon sonrasında 2 mL taze ortam ile değiştirin. </li><li> Sitoplazma lokalize proteinleri izlemek için hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi bir EGFP ifade kasedi (pEGFP-N1) içeren plasmidle transfekte edin. Yukarıda tarif edildiği gibi PMV üretimi için transfeksiyondan 48 saat sonra tripsin sindirimi ile hücreleri hasat edin. </li><li> Mitokondriyeyi izlemek için, hücreleri mitokondriyal boya (1 uM, MitoTracker) ile taze kültür ortamında 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca lekeleyin. </li><li> Mitokondrinin zar potansiyelini saptamak için, hücreleri siyanin boyası JC-1 (5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrakloro-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraetilbenzimidazolilkarbosiyanin iyodid) (10 μg / ML) taze kültür ortamında 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. <ol><li> Hücreleri 0.5 mL PBS ile üç kez yıkayın ve yukarıda tarif edildiği gibi PMV üretimi için tripsin sindirimiyle hücreleri hasat edin. </li><li> Toplanan tıbbi maddenin 150 μL&#39;ini yükleyin.35 mm&#39;lik bir cam altı tabağa koyun ve PMV&#39;lerin yaklaşık 10 dakika boyunca tabana oturmasına izin verin. 100X yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında PMVs inceleyin. </li></ol></li><li> EGFP&#39;yi veya mitokondriyal boyayı algılamak için 488 nm lazeri açın ve 505-530 nm&#39;de sinyal toplayın. JC-1&#39;i saptamak için 488 nm ve 543 nm lazerleri açın ve 505-530 nm ve 560-615 nm&#39;de sinyal toplayın. İğne deliği değerini yaklaşık 1.4 yapın. </li></ol> 4. Konsantre PMV&#39;lerin Santrifüjle Hazırlanması <ol><li> Tripsin sindirimi ile hücreleri hasat edin ve yukarıda tarif edildiği gibi PMV&#39;leri 0.5 mL kültür ortamında üretin. </li><li> PMV&#39;leri oda sıcaklığında 5 dakika süreyle bir tezgah üstü santrifüjde 1200 xg&#39;de döndürün. Dikkatle süpernatantı aspire edin ve yumuşak topraklama ile kültür ortamı 100 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 35 mm&#39;lik cam alt tabağa 50 μL PMV yükleyin ve yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çökelmelerine izin verin. PMV&#39;leri inceleyin40X yağ objektif lens kullanarak konfokal bir mikroskop altında. </li><li> Seyreltilmiş polietilenimin (PEI) çözeltisi serisini 1 saat süreyle BMSC kültürüne ilave edin ve sitotoksisite işaretlerini kontrol edin. NOT: Burada BMSC&#39;lerde toksisite işareti bulunmadığından 2 μg / mL PEI seçilmiştir. </li><li> Tripsin sindirimle hücreleri hasat edin ve agregasyonu önlemenin bir yolu olarak hücre zarını şarj etmek için 1 saat boyunca 2 ug / mL&#39;de PEI ilave edin. Yukarıda tarif edildiği gibi 0,5 mL kültür ortamında PMV&#39;ler üretin. PMV&#39;leri konsantre hale getirin ve yukarıda açıklandığı gibi konfokal bir mikroskop altında inceleyin. </li></ol> 5. PMV&#39;lerin Gastroknemius Kasına Enjekte Edilmesi <ol><li> Memeyi lekelenmek için, 30 dakika boyunca BMSC&#39;ye 1 mL taze kültür ortamında CM-DiI (klorometil dialkil-indokarbosiyanin) (10 uM) boya ilave edin. </li><li> Tripsin sindirimi ile hücreleri (yaklaşık 5 x 10 5 ) toplayın ve 0.5 mL kültür ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. PEI (2 μg / mL) 1h. PMV&#39;leri, yukarıda tarif edildiği gibi, 100 uL kültür ortamında üretin ve konsantre hale getirin. </li><li> 12 saatlik aç bıraktıktan sonra sodyum barbital (10 mg / kg) enjekte ederek bir BALB / c fareyi başlatın. </li><li> Gastroknemius kasının dışını% 75 etanol ile temizleyin. 30 G&#39;lik bir insülin şırınga kullanarak yavaşça PMV&#39;leri (100 μL) gastroknemius kasına enjekte edin. </li><li> Anestezi uygulandıktan sonra, deney süresince gözlerin üzerine ıslak bir gazlı bez yerleştirin ve uyanana kadar fareyi bir akkor ışıkla ısıtın. Fare tek başına bir havalandırma kafesinde yalnız bırakın. </li><li> Ameliyattan 12 saat sonra gastroknemius kasını hasat etmek için fare servikal dislokasyonla öldürüldü. </li><li> Gastroknemius kası üzerine% 75 etanol serpiştirin, makasla deriyi açın ve her iki ucundaki tüm gastroknemius kasını kesin. </li><li> Kas PBS ile durulayın ve bir floresan mikroskop altında 20X objektif lens kullanarak inceleyin. </li><li> Kası birFloresan olmayan parçaları çıkarmak için keskin traş bıçağı. Güçlü kırmızı flüorür ile parçaları yaklaşık 9 mm 3 küp içine kesin. </li><li> Her küveti optimum kesme sıcaklığı ortamına (OCT) yerleştirin, 5 dakika süreyle sıvı nitrojene batırın ve kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;lik bir dondurucuda saklayın. </li><li> Dondurulmuş parçaları bir kriyostat kullanarak 20 μm kalınlığında parçalara kesin ve her bir bölüme bir cam slayta yapıştırın. Kesiti PBS ile bir kez durulayın. </li><li> Bir leke daire kalemi olan bölüm etrafında bir daire çizin ve 100 mcL DAPI (1 μg / mL) ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka sonra DAPI çözüm aspire ve PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Örneğe monte yağı atın, bir cam kaymayla örtün ve slaytı oje ile sızdırmaz kılın. 100X yağ objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında bölüm inceleyin. </li><li> CM-DiI&#39;yi tespit etmek için 543 nm lazeri açın ve 560-615 nm&#39;de sinyal toplayın. DAPI algılamak için &lt;a0&gt; &lt;/ a0&gt;, 405Nm lazer ve 420-480 nm&#39;de sinyal toplayın. İğne deliği değerini yaklaşık 1.4 yapın. </li></ol>

<ol><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li>
<li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems%3A+recent+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional%2C+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li>
<li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li>
<li>López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00645-4">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li>
<li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li>
<li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li>
<li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+amyloid-%CE%B2+harmful+to+the+brain%3F+Insights+from+human+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li>
<li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li>
<li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+keeping+that+old+broom+working%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li>
<li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23454757">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li>
<li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41(2016).</li>
<li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+heart+and+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li>
<li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).</li>
<li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+B%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li>
<li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine%3A+A+versatile%2C+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazıda önerildiği gibi sitoplazma replasman tedavisi, gen, moleküler ve hücre tedavisi gibi bildirilen diğer yaklaşımlara göre benzersiz avantajlara sahiptir. BMSC'lerden üretilen PMV'ler, yalnızca kök genlerinin ürünlerini değil, aynı zamanda yaşlanma ile ilişkili yaşlanma fenotiplerini düzeltmek için gerekli olan bozulmamış hücresel organelleri de kapsar. Yaşlanan hücrelere genç sitoplazma verildiğinde, arızalı mekanizmalar kısa bir rahatlama sağlayabilir; Aynı zamanda, epigenom uzun süreli bir etki sağlamak için ye...

<html> Gen, enzim ve hücre replasman tedavileri için yaklaşımlar oluşturmak için büyük çaba harcandı. Bu, büyük ilerlemeler ve hatta klinik uygulamalarla sonuçlandı 1 , 2 , 3 . Yakın zamanda, yaşlı kadınların veya ölümcül mitokondriyal DNA mutasyonu taşıyan in vitro döllenmeye çekirdek transfer teknolojisine dayalı tartışmalı bir mitokondria replasman tedavisi uygulanmıştır4. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser gibi yaşla ilişkili hastalıklarda bulunan kusurlar genellikle çok yönlüdür. Lipid damlacıklarının birikiminin; Amiloid proteinin birikimi; Açılmış proteinlerin endoplazmik retikulumda tutulması; Ve arızalı proteazom, otofagozom ve mitokondri bu hastalıkların gelişimine veya şiddetlenmesine katkıda bulunur&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Halen, yaşlanmaya ve yaşlanmaya neden olan fenotiplere neden olan sitozol ve organellerde arızanın doğrudan düzeltilmesini amaçlayan herhangi bir mekanizma mevcut değildir. Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV&#39;lerin) üretimini bildirdik 12 . Çekirdek dışında, PMV&#39;lerde protein ve RNA da dahil olmak üzere zar veya sitoplazmadaki bileşenlerin yanı sıra mitokondri gibi organel bileşikleri de bulundu. Esasen, bir PMV minyatür enükleated hücre olarak kabul edilebilir. Daha da önemlisi, PMV&#39;lerin mitokondriyal eksik Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşulları altında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Bu, establi hakkındaki ilk rapordur.Sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel olarak verimli bir yaklaşım savunur. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC&#39;ler), kemik iliğinden rutin olarak üretilen ve kültürde kolaylıkla genişleyen multipotent progenitör hücrelerdir. Embriyonik kök hücre markörleri Oct4, Nanog ve SOX2 MSC&#39;lerde düşük seviyelerde tespit edildi 13 . Telomeraz etkinliği de ölçülebilirdir. Buna ek olarak, yardımcı uyarıcı moleküller ve insan lökosit antijeni (HLA) Sınıf II moleküllerinin yanı sıra MSC&#39;lerde düşük HLA Sınıf I ifadesi bulunmadığından, bunları allojenik veya &quot;raflarda&quot; kullanım için ideal hücreler haline getirir Hem rejeneratif tıp hem de immünomodülatör uygulamalar 14 . Burada, 3-μm gözenekli bir polikarbonat zar yoluyla ekstrüzyon yoluyla fare BMSC&#39;lerden PMV&#39;lerin nasıl hazırlanacağını, PMV&#39;lerde mitokondri varlığını belirleyip, confoc kullanarak PMV&#39;lerin bakımını inceliyoruz.Konsantre fakat agregasyonsuz PMV&#39;leri santrifüjleme ile hazırlayın ve PMV&#39;lerin farelerin gastroknemius kütlesine in vivo enjeksiyonu gerçekleştirin.

<table><tbody><tr><td>IsoporeTM membranlar</td><td>Kırlangıç</td><td>TSTP04700</td><td>3 mm gözenekli</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık filtre ünitesi</td><td>Xinya, Şangay, Çin</td><td>25 mm</td><td>Tıbbi sınıf polipropilen</td></tr><tr><td>İnsülin şırınga</td><td>BD</td><td></td><td>328446 1 mL</td></tr><tr><td>pN1-EGFP</td><td>Clontech</td><td>&nbsp; 6085-1</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker</td><td>Moleküler Problar</td><td>M7514</td><td>Yeşil FM, 1 & mu; M</td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Beyotime, Haimen, Çin</td><td>C2006</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Beyotime, Haimen, Çin</td><td>C1036</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td>Mn = 75.000</td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE 2000</td><td>CCD kameralı</td></tr><tr><td>Confocol Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>Hücre</td><td>transfeksiyonu için</td> SigaGen <td>SL100688</td></tr></tbody></table>

potansiyel sitoplazma replasman tedavisi için kemik İliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran vesiküllerinin hazırlanması

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV&#39;ler) üretimini bildirdik. PMV&#39;lerin mitokondriyal yetersiz Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşullarında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser, çeşitli hücre tiplerinin sitolol ve organellerinde çok sayıda mekanik ve fonksiyonel kusur ile ilişkili olduğu bildirilen yaşa bağlı hastalıklardır. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC&#39;ler), kendi çoktanlıklarını korurken kendi kendini yenileme kabiliyetlerine sahip olan kemik iliğinden gelen benzersiz bir hücre popülasyonunu temsil eder. Yaşlanmayı önleyici hücrelerin, otolog BMSC&#39;lerden genç sitoplazması ile PMV&#39;lerin füzyonu yoluyla eklenmesi, yaşa bağlı fenotiplerin iyileştirilmesi veya hatta tersine çevrilmesi için umut verici bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, 3&#39;lü polikarbonat membran içinden ekstrüzyon yoluyla BMSC&#39;lerden PMV&#39;lerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.1 gözenekleri, mitokondri varlığını belirlemek ve bir konfokal mikroskop kullanarak PMV&#39;ler içinde zar potansiyelinin bakımı incelemek, santrifüj ile PMVs konsantre ve farelerin gastroknemius kas içine PMVs in vivo enjeksiyonu gerçekleştirmek.

PMV&#39;lerin başarılı bir şekilde hazırlanmasının anahtarı, filtre ünitesinin doğru şekilde monte edilmesine ( Şekil 1 ) bağlıdır ve membrandan 1 mL PBS iterek test edilebilir. Sızıntı oluşursa, filtre ünitesini tekrar monte edin ve tekrar test edin. Bununla birlikte, sızıntı, hücreler zardan içeri itildiğinde güvenilir şekilde test edilebilir. 10X objektif kullanarak normal bir mikroskopta yalnızca birkaç PMV tespit edilirse veya PMV&#39;lerin boyutu çoğunlukla 1 μm ci...

Yaşa bağlı hastalıklar, sitoplazmadaki bileşenlerin birden fazla kusuru ile ilişkilidir. Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran veziküller hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek veya hatta tersine çevirmek için sitoplazma replasman tedavisi aracı olarak potansiyel olarak kullanılabilir.

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Bu prosedürün genel amacı, fare kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden (BMSC'ler) türetilen plazma membran vezikülleri (PMV'ler) kullanarak, farelerin gastroknemius kasına özgün bir sitoplazma değişim tedavisi uygulamaktır. Bu yöntem, hücrelerin diğer BMSC'lerden gelen genç sitoplazma ile PMV füzyonu yoluyla desteklenmesinin, yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirip iyileştiremeyeceği ve hatta geri döndürüp döndüremeyeceği sorularına yanıt bulmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, BMSC sitozolünün PMV'ler içine kapsüllenmesi ve bunun mekanik ekstrüzyon yoluyla anında indüklenebilmesidir.Bu yöntemi gösterirken, ekstrüzyon ve yapılandırma adımlarının sadece deneyerek değil, gerçekten uygulama yoluyla öğrenilmesinin zor olması nedeniyle dikkatli olmak kritik önem taşır. PMV'leri üretmek için, öncelikle fare BMSC'lerini altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda, %5 karbondioksit ve 37 °C'deki nemlendirilmiş bir inkübatörde, komple DMEM kültür ortamında kültüre edin. Hücreler %90 konfluense ulaştığında, kuyucuğu 0,5 mL kalsiyumsuz PBS ile durulayın ve hücreleri 0,5 mL %0,25 trypsin-EDTA ile ayırın.37 °C'de üç dakika bekledikten sonra, hücre ayrışmasını kolaylaştırmak için plakaya el ayasıyla birkaç kez vurun ve sindirimi bir mililitre kültür ortamı ile durdurun. Hücreleri santrifüj için beş mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve peleti dört mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri yeni bir altı kuyucuklu plakanın iki kuyucuğuna paylaştırın ve plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.Ertesi gün, hücreleri az önce gösterildiği gibi tripsin sindirimi ile bir kuyucuktan hasat edin. Santrifüj ile toplama işleminden sonra peleti 0.5 milliliters taze kültür ortamında yeniden süspande edin. Hücreleri bir mililitrelik bir insülin şırıngasına yükleyin ve şırıngayı bir filtre ünitesine takın.Hücreleri filtreden geçirmek için pistonu hızla bastırın ve dışarı çıkan medyumu atın. Ardından, az önce gösterildiği gibi filtreden 0,5 milliliters ekstra kültür medyumu yükleyip boşaltın ve ikinci dışarı çıkıştan medyumu toplayın. Toplanan medyumun 150 microliters kısmını 35 milliliter cam tabanlı bir kaba ekleyin ve veziküllerin yaklaşık 10 dakika boyunca çökmesini bekleyin.Ardından, CCD kamera ile donatılmış evirmeli faz kontrast mikroskobunda 20 kat objektif lens kullanarak PMV'lerin varlığını doğrulayın. PMV'lerdeki mitokondriyal kapsamlamayı ve membran potansiyelini izlemek için, %90 konfluens düzeyindeki BMSC kültürünü, taze kültür ortamında 37 degrees Celsius'ta 30 dakika boyunca sırasıyla uygun bir mitokondriyal boya veya bir mitokondriyal membran potansiyeli probu ile boyayın. Daha sonra hücreleri her yıkamada 0.5 milliliters PBS ile üç kez durulayın ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme için az önce gösterildiği gibi PMV üretimi amacıyla hücreleri tripsin sindirimi ile hasat edin.PMV proteinlerinin sitoplazmik lokalizasyonunu izlemek için, önce bir EGFP ekspresyon kaseti için iki mikrogram süper kıvrımlı plazmit DNA'sını ve altı mikrolitre katyonik transfeksiyon reaktifini, 50 mikrolitre serumsuz DMEM içeren ayrı 0.5 mililitrelik tüplerde seyreltin. Tüpleri vortekslen ve ardından kısa süreli santrifüj işlemine tabi tutun. Daha sonra, transfeksiyon reaktifini seyreltilmiş DNA çözeltisini içeren tüpe damla damla ekleyin.DNA transfeksiyon karışımını bir dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteksleyin, ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyon öncesinde kısa bir santrifüj işlemine tabi tutun. Sonra, altı kuyucuklu plakadaki %30 konfluensli bir BMSC kültürünü iki mililitre taze kültür ortamı ile besleyin ve DNA karışımını hücrelere damla damla ekleyin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, BMSC'leri tripsin sindirimi ile hasat edin ve az önce gösterildiği gibi PMV'leri hazırlayın.PMV'ler daha sonra 100 kat yağlı objektif kullanılarak konfokal mikroskopi ile analiz edilebilir. PMV'leri enjekte etmeden önce, bir BMSC kültürünü bir mililitre taze kültür ortamında 37 °C'de 30 dakika boyunca membran boyama floresan hücre takip boyası ile işaretleyin ve hücreleri tripsin sindirimi yoluyla toplayın. İşaretlenmiş hücreleri, bir mikrogram polietilen amin ile desteklenmiş 0,5 mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin ve gösterildiği gibi PMV'leri hazırlayın.Ardından, PMV'leri santrifüjle konsantre edin ve peleti nazikçe çalkalayarak 100 µL taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Sonra, hücreleri 30 gauge iğne takılmış bir mililitrelik insülin şırıngasına yükleyin ve anestezi altındaki bir BALB/c faresinin gastrocnemius kasının dış kısmını %75 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, PMV'lerin tüm hacmini yavaşça kasa enjekte edin ve hayvanın bir ısı lambası altında iyileşmesini bekleyin.12 saat sonra, kasın üzerine %75 ethanol püskürtün, deriyi makasla açın ve gastroknemius kasının tamamını her iki ucundan hasat edin. Kası PBS ile durulayın ve bir floresan mikroskobunun altına yerleştirin. 20 kat objektif lensini kullanarak, floresan yaymayan kas dokusu parçalarını keskin bir jiletle uzaklaştırın ve geri kalan güçlü kırmızı floresan yayan parçaları yaklaşık dokuz milimetreküplük küpler halinde kıyın.Her bir küpü optimal kesme sıcaklığı ortamına gömün. Ardından küpleri beş dakika boyunca sıvı azot içinde bekletin. Doku örneklerini analiz edilene kadar -20 °C'de saklayın.20x objektif kullanılarak faz kontrast mikroskobunda incelendiği üzere, BMSC'lerden üretilen PMV'lerin ağırlıklı olarak yaklaşık üç mikrometre çap aralığında bir boyuta sahip olduğu görülmektedir. BMSC'lerin floresan ekspresyon kasedi ile 48 saat boyunca transfekte edilmesi, EGFP proteininin PMV'ler tarafından sitoplazmik olarak kapsüllendiğini göstermektedir. Ayrıca, floresan mitokondriyal boya ile yapılan inceleme, PMV'lerin büyük bir kısmının mitokondri içerdiğini ortaya koymaktadır.Bunların çoğunluğu, mitokondrilerin fonksiyonelliğini gösteren bir mitokondriyal membran potansiyeli boyası ile pozitif boyanmaktadır. İn vivo uygulamalarından önce polietilen amin işlemi uygulanması, hücresel bileşenlerin uzaklaştırılması için yapılan santrifüj konsantrasyonu sırasında PMV agregasyonunu önler. PMV oluşumundan önce BMSC'lerin membran boyası ile etiketlenmesi, floresan ile izlenebilir PMV'lerin üretilmesini kolaylaştırır.Nitekim, işaretli PMV'lerin intramüsküler iletimi sonrası gastroknemius kasının dondurulmuş kesitlerinin görüntülenmesi, PMV iletiminin muhtemelen endositoz yoluyla kas hücresi sitoplazmasına gerçekleştiğini göstermektedir. PMV üretme prosedürü uygulanırken, hücreler filtre üzerinden geçirilirken pistonu hızla itebilmek için şırıngaya uygun sayıda hücre yüklendiğinden emin olmak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kök hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların farelerde yaşa bağlı hastalıkların tedavisi üzerine çalışmalar yapmasına yol açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, farelerin gastroknemius kasına sitoplazma iletimi için BMSC'den PMV'nin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-plasma-membrane-vesicles-from-bone-marrow-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Tavşan diz eklemi osteokondral defektlerinin tedavisi için bir deney tekniği tarif edilmektedir. Osteokondral kusurları içine allojenik mezenkimal kök hücrelerin implantasyon doku mühendisliği alanında umut verici bir gelişme sağlar. Fibrin pıhtısı hücre...

Fibrin pıhtısı içinde allojenik Mezenkimal Kök Hücre implantasyonu ile Tavşan Diz Eklemi içinde Osteokondral Kusur tedavisi

Bu videoda, kemik iliği kök hücrelerini bir membran filtreden hızlı bir şekilde geçirerek plazma zarı vezikülleri oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Bu PMV'ler sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel gösterir.

Kemik İliği Kök Hücrelerinden Plazma Zarı Veziküllerinin Üretilmesi

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), çözünür faktörler veya spesifik biyomateryaller ile uyarıldıklarında osteoblastik soya doğru farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu çalışma, sığır kemik matrisi Nukbone'u (NKB) bir iskele olarak kullanan insan amniyotik membranından (-hMSC'ler) MSC'lerin verilmesi için yeni bir seçenek sunmaktadır.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mezenkimal kök hücreler genellikle kemik iliğinden elde edilir ve genişletme kültürü gerektirir. Numuneler işlenmeden önce pıhtılaştığında, pıhtıyı parçalamak için (enzimatik) trombolitik ilaç ürokinaz kullanan bir protokol uygulanabilir. Böylece hücreler serbest bırakılır ve genleşme kültürü için kullanılabilir hale gelir. Bu protokol, yeniden örneklemeye hızlı ve ucuz bir alternatif sunar.

Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma

Burada, Mezodermal Progenitör Hücreleri (MPC'ler) insan kemik iliğinden (hBM) izole etmek için optimize edilmiş, yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü açıklıyoruz. MPC'ler akım sitometrisi ve nestin ekspresyonu ile karakterize edildi. Anjiyojenik potansiyellerini korurken katlanarak büyüyen MSC benzeri hücre kültürlerine yol açma yeteneğini gösterdiler.

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

otolog serum ile insan Mezenkimal Stromal Hücreleri (hMSCs) Kültürleme, ksenojenik malzeme ve diğer olumsuz etkileri ile reddi riskini azaltır. Aynı zamanda, taze hMSCs sağlayabilir mezodermal progenitörlerin bir alt kümesi, bir geri kazanımını sağlar. otolog fibrin pıhtısı içinde hMSCs gömülmesi kolay kullanım ve etkin bir cerrahi implantasyon sağlar.

Mezenkimal Stromal Otolog Koşullarında Hücre Kültürü ve Teslimat: Ortopedik Uygulamalar için Akıllı Yaklaşım

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Bu protokol, gen tedavisi için mezenkimal kök hücre (MSC) türevli ekstraselülük vezikül biyomimetiklerinin üretilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem tanıtmayı amaçlamaktadır. Nanovezikül, MSC'den türetilen lipid çift katmanlarla sınırlıdır ve lümende ilgi çekici geni taşıyan rekombinant AAV'leri kapsüller. Bu nanovezikül, in vivo gen taşıması için gelişmiş bir vektör sunar.

Gen Taşımayı Artırmak İçin Mezenkimal Kök Hücre Zarı Zarflı Nanoveziküllerin Geliştirilmesi

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Öğrenin, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran vezikülleri hazırlayarak yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek için sitoplazma replasman tedavisi uygulama yöntemini. Bu teknik, yaşlanma araştırmalarında yeni tedavi yaklaşımları geliştirmeye yardımcı olur.

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet