Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, plazma zarı vezikülleri veya fare kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden veya BMSC'lerden türetilen PMV'ler kullanılarak farelerin gastroknemius kasına yeni bir sitoplazma replasman tedavisi sağlamaktır. Bu yöntem, PMV füzyonu yoluyla diğer BMSC'den genç sitoplazmalı hücrelerin takviyesi ile ilgili soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, yaş ilişkili fenotiplerini iyileştirebilir veya hatta tersine çevirebilir. Bu tekniğin ana avantajı, BMSC sitozolünün PMV kapsüllenmesi ve mekanik bir ekstrüzyon ile anında indüklenebilmesidir.

Bu yöntemi gösterirken, ekstrüzyon ve inşa etme adımlarını gerçekten sahip olmak için test ederek öğrenmek zor olduğu için çok önemlidir. PMV'leri oluşturmak için, önce 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde altı oyuklu bir plakanın bir oyuğunda tam DMEM kültür ortamında kültür faresi BMSC'leri. Hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, kuyuyu 0.5 mililitre kalsiyum içermeyen PBS ile durulayın ve hücreleri 0.5 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın.

37 santigrat derecede üç dakika sonra, hücre ayrışmasını kolaylaştırmak ve bir mililitre kültür ortamı ile sindirimi durdurmak için plakaya avuç içi ile birkaç kez vurun. Hücreleri santrifüjleme için beş mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve peleti dört mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri yeni bir altı oyuklu plakanın iki oyuğu arasına bölün ve plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Ertesi gün, az önce gösterildiği gibi tripsin sindirimi ile hücreleri bir kuyudan hasat edin. Santrifüjleme ile toplandıktan sonra peletin 0,5 mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edilmesi. Hücreleri bir mililitrelik insülin şırıngasına yükleyin ve şırıngayı bir filtre ünitesine takın.

Hücreleri filtreden sıkmak için pistona hızla bastırın ve ekstrüde edilmiş ortamı atın. Daha sonra, az önce gösterildiği gibi filtreden 0,5 mililitre ekstra kültür ortamı yükleyin ve dağıtın, ortamı ikinci ekstrüzyondan toplayın. Toplanan ortamın 150 mikrolitresini 35 mililitrelik bir cam tabanlı tabağa tohumlayın ve veziküllerin yaklaşık 10 dakika çökmesine izin verin.

Ardından, 20 kat objektif lens kullanarak bir CCD kamera ile donatılmış ters faz kontrast mikroskobu altında PMV'lerin varlığını onaylayın. PMV'lerdeki mitokondriyal muhafazayı ve membran potansiyelini izlemek için,% 90 birleşik bir BMSC kültürünü, sırasıyla uygun bir mitokondriyal boya veya bir mitokondriyal membran potansiyel probu ile taze kültür ortamında 30 santigrat derecede 37 dakika boyunca boyayın. Daha sonra hücreleri yıkama başına 0.5 mililitre PBS ile üç kez durulayın ve hücreleri, konfokal mikroskopi ile görselleştirmeleri için gösterildiği gibi PMV üretimi için tripsin sindirimi ile hasat edin.

PMV proteinlerinin sitoplazmik lokalizasyonunu izlemek için, önce bir EGFP ekspresyon kaseti için iki mikrogram süper sarmal plazmit DNA'yı ve 50 mikrolitre serum serbest DMEM içeren ayrı ayrı 0.5 mililitrelik tüplerde altı mikrolitre katyonik transfeksiyon reaktifini seyreltin. Tüpleri girdaplayın, ardından kısa bir santrifüjleme yapın. Daha sonra, seyreltilmiş DNA çözeltisini içeren tüpe transfeksiyon reaktifini damla damla ekleyin.

DNA transfeksiyon karışımını bir dakika boyunca sağlam bir şekilde vorteksleyin, ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyonda kısa bir dönüş yapın. Daha sonra, iki mililitre taze kültür ortamı ile altı oyuklu bir plakada% 30 birleşik bir BMSC kültürünü besleyin ve DNA karışımını hücrelere damla damla ekleyin. Transfeksiyonlarından 48 saat sonra, BMSC'yi tripsin sindirimi ile hasat edin ve PMV'leri az önce gösterildiği gibi hazırlayın.

PMV'ler daha sonra 100 kat yağ hedefi kullanılarak konfokal mikroskopi ile analiz edilebilir. PMV'leri enjekte etmeden önce, bir BMSC kültürünü, 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir mililitre taze kültür ortamında membran boyama floresan hücre izleyici boyası ile etiketleyin ve hücreleri tripsin sindirimi ile hasat edin. Etiketli hücreleri, bir mikrogram polietilen amin ile takviye edilmiş 0.5 mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin ve gösterildiği gibi PMV'leri hazırlayın.

Daha sonra PMV'leri santrifüjleme ile konsantre edin ve peleti 100 mikrolitre taze kültür ortamında hafifçe döndürerek yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 30 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik insülin şırıngasına yükleyin ve anestezi uygulanmış bir BALB / c faresinin gastroknemius kasının dışını %75 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra tüm PMV hacmini yavaşça kasın içine enjekte edin ve hayvanın bir ısı lambası altında iyileşmesine izin verin.

12 saat sonra, kasın üzerine% 75 etanol serpin, cildi makasla açın ve her iki ucundan tüm gastroknemius kasını toplayın. Kası PBS ile durulayın ve bir floresan mikroskobu altına yerleştirin. 20 kez objektif lensi kullanarak, floresan olmayan kas dokusu parçalarını keskin bir tıraş bıçağıyla çıkarın ve kalan güçlü kırmızı floresan parçalarını yaklaşık dokuz milimetre küp küp halinde doğrayın.

Her küpü en uygun kesme sıcaklığı ortamına gömün. Daha sonra küpleri beş dakika boyunca sıvı nitrojene batırın. Ve doku örneklerini analizlerine kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Gösterildiği gibi BMSC'lerden üretilen PMV'ler, 20 kez objektif kullanılarak faz kontrast mikroskobu altında incelendiği gibi, ağırlıklı olarak yaklaşık üç mikrometre çapında bir boyut sergiler. 48 saat boyunca bir floresan ekspresyon kaseti ile BMSC transfeksiyonu, EGFP proteininin PMV'ler tarafından sitoplazmik kapsüllenmesini gösterir. Ayrıca, floresan bir mitokondriyal boya ile ayakta durmak, PMV'lerin büyük bir kısmının mitokondri içerdiğini ortaya koymaktadır.

Bunların çoğu, mitokondrinin işlevselliğini gösteren bir mitokondriyal membran potansiyel boyası için pozitif boyanır. En vivo uygulamalarından önce polietilen amin muamelesi, hücresel bileşenlerin uzaklaştırılması için santrifüj konsantrasyonları sırasında PMV agregasyonunu önler. PMV üretiminden önce BMSC'lerin membran boyası etiketlemesi, floresan izlenebilir PMV'lerin üretilmesini kolaylaştırır.

Gerçekten de, etiketli PMV'lerin intramüsküler verilmesinden sonra gastroknemius kasının donmuş bölümlerinin görselleştirilmesi, muhtemelen endositoz yoluyla kas hücresi sitoplazmasına PMV iletimini gösterir. PMV oluşturma prosedürünü denerken, hücreleri filtreden geçirirken pistona hızlı bir şekilde bastırmak için şırıngayı uygun sayıda hücre ile yüklemeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra bu teknik, kök hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların farelerde yaşa bağlı hastalıkların tedavisini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, sitoplazmanın farelerin gastroknemius kasına verilmesi için BMSC'den PMV'nin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.