Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Bu tekniğin genel amacı, modifiye sialik asit ekspresyonu ile hücreler veya hücre türevi ürünler üretmektir. Bu nedenle hücreler, karşılık gelen sialik asitlere metabolize edilen ve daha sonra hücre yüzeyinde eksprese edilen N-asil modifiye Mannozaminler ile muamele edilir. Bu yöntem, glikokonjugatların reseptör-ligand etkileşimleri üzerindeki etkisi gibi Glikobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, uygulanmasının kolay olması ve tamamen sitotoksiktir. Metabolik Glikomühendisliği göstermek için, ticari olarak temin edilebilen N-asetilmannozamin kullanacağız. Ayrıca, N-propiyonil ve N-butanoylmannosamin'in sentezini ve kullanımını göstereceğiz.

Metabolik glikomühendisliğin polisialik asidin ekspresyonu üzerindeki biyolojik etkileri gösterilmiştir. İlk olarak, 431.2 miligram Mannozamin hidroklorürü, bir karıştırma çubuğu içeren 15 mililitrelik bir cam şişede 10 mililitre üç Milimolar Sodyum metoksit çözeltisi içinde çözün. Karışımı buz üzerinde sıfır santigrat dereceye kadar soğutun.

Karıştırırken, çözeltiye damla damla 210 mikrometre propiyonil klorür yavaşça ekleyin. Ardından, karıştırma karışımını sıfır santigrat derecede dört saat inkübe edin. Bunu takiben, çözeltiyi 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve ince bir iğne ile tüpün kapağına dört ila 8 delik açın.

Sıvı nitrojen kullanarak çözeltiyi hızla dondurun. Ardından, numuneyi tamamen kuruyana kadar liyofilize edin. Liyofilizasyondan sonra, kurutulmuş ürünü etil asetat, metanol ve su içinde çözün.

Bir pipet kullanarak, çözeltiyi önceden hazırlanmış bir silika jel kolonuna yükleyin. 500 mililitre çözücüyü ayrıştırdıktan sonra, dört mililitre fraksiyon toplayın. Ayrıştırılmış fraksiyonları 15 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve ince bir iğne ile tüpün kapağına üç ila altı delik açın.

Çözeltiyi sıvı nitrojen ile dondurduktan sonra, numuneyi tamamen kuruyana kadar liyofilize edin. Kültür: Kelly nöroblastom hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte RPMI ortamında. Mannozaminlerin uygulanmasından önce, Kelly nöroblastom hücrelerini Tripsin ve EDTA ile 10 dakika inkübe ederek ayırın.

Tripsini RPMI ortamı ile nötralize ettikten sonra, bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. Sialik asit monosakkaritlerini ölçmek için, hücreleri 500 mikrolitre ortamda 48 oyuklu bir doku kültürü plakasına yerleştirin. Polisialik asitlerin analizi için, hücreleri üç mililitre ortamda altı santimetre çapında bir hücre kültürü kabına oturtun.

RPMI'de çözünen ilgili mannozamin türevlerini, beş milimolar nihai konsantrasyonda yeni kaplanmış hücrelere ekleyin ve her 24 saatte bir N-asil modifiye Mannozaminleri içeren ortamı değiştirerek 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İşlemden sonra, ortamı boşaltın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri Tripsin ve EDTA ile 10 dakika inkübe ederek ayırın.

Ayrılan hücrelere aynı hacimde hücre kültürü ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Bunu takiben, ayrılan hücreleri 15 mililitrelik plastik tüplere aktarın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez yıkayın.

Santrifüjlemeyi takiben, toplanan hücre peletlerini 500 mikrolitre buz gibi soğuk HPLC lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneleri orta-yüksek genliklerde 30 saniyelik bir süre boyunca ultrasonik bir işlemci iğnesi ile üç kez ultrasonikleştirin, numuneleri döngüler arasında en az bir dakika buz üzerinde soğutun. Parçalanmış hücre örneklerini santrifüjledikten sonra, süpernatanı 1.5 mililitrelik plastik tüplerde zar fraksiyonlarından ayırın.

Asit hidrolizi için, ayrılan membran fraksiyonlarına 150 mikrolitre bir molar TFA çözeltisi ekleyin. Numuneleri 200 ila 600 RPM'de çalkalayarak 80 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Daha sonra, numuneleri üç kilodalton dışlama membranı ile 0,5 mililitrelik filtre tüplerine taşıyın.

Numuneleri, üst faz hacmi 20 mikrolitreden az olana kadar 20.000 kez G ve 21 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika santrifüjleyin. Bunu takiben, ekleri atın ve ince bir iğne ile ultrafiltrat içeren tüplerin kapaklarına iki ila dört delik açın. Numuneler sıvı nitrojen ile dondurulduktan sonra, gece boyunca liyofilize edin.

Kurutulmuş numuneleri 10 mikrolitre 120 milimolar TFA çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve 50 mikrolitre DMB çözeltisi ekleyin. Numuneleri ultraviyole ışıktan korumak için koyu renkli 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Hücre zarı örneklerini ve standartlarını 56 santigrat derecede 1,5 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, etiketleme reaksiyonunu durdurmak için her numuneye dört mikrolitre 400 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. HPLC analizi için, kolonun sıcaklığını 40 santigrat dereceye ayarlayın ve floresan dedektörünü uyarma için sırasıyla 373 nanometre ve ihmal için 448 nanometre olarak yapılandırın. 10 mikrolitre numune hacmi enjekte edin ve probları, eluant olarak metanol, Asetonitril ve su ile dakikada 0,5 mililitre akış hızında 15 dakika boyunca ayırın.

Kütle spektrometresi analizi için, toplanan her HPLC örneğinden 20 mikrolitre enjekte edin. LC kütle seçici dedektör sisteminin değerlendirme yazılımında, toplam iyon kromatogramında ilgilenilen tepe noktasını seçin. Çözülen tepe noktasının kütle spektrumunu görüntüleyin ve 300 ile 700 arasındaki pozitif kütle-yük oranını görüntüleyin.

Önceden hazırlanmış glikomühendislik hücrelerinin peletlerine bir mililitre western blot lizis tamponu ekleyin ve girdap yapın. Numuneleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, her beş dakikada bir girdap yapın. Bunu takiben, numuneleri 20.000 kez G ve dört santigrat derecede 1.5 saat santrifüjleyin.

Daha sonra, parçalanmış hücrelerden proteinleri içeren süpernatanı 1.5 mililitrelik tüplere toplayın. Her protein fraksiyonunun 90 mikrolitresine 10 mikrolitre Laemmli numune tamponu ekleyerek numuneleri SDS sayfası için hazırlayın. Numuneleri beş dakika kaynatın.

Numuneleri %8'lik bir SDS-akrilamid jel üzerine yükledikten sonra, jeli oda sıcaklığında iki saat boyunca 25 miliamperde çalıştırın. Bittiğinde, cam kapağı jelden dikkatlice çıkarın ve yükleme ceplerini içeren jelin üst kısmını kesin. Daha sonra, jeli daha önce batı leke tamponuna batırılmış 0.2 mikro nitroselüloz membran üzerine yerleştirin.

Proteinleri sistemin tavsiyesine göre nitroselüloza aktarın. Nitroselüloz membranı lekeleme sisteminden çıkardıktan sonra, proteinleri görselleştirmek ve böylece transferin kalitesini kontrol etmek için lekeyi Ponceau kırmızısı ile boyayın. Daha sonra nitroselüloz membranı plastik bir hazneye aktarın ve 10 mililitre bloke edici solüsyon ekleyin.

Nitroselüloz membranı inkübe ettikten sonra, bloke edici çözeltiyi boşaltın ve PBS'ye monoklonal anti-polisialik asit 735 antikoru ekleyin. İnkübasyondan sonra, zarı PBS ile beş dakika boyunca en az üç kez yıkayın. Şimdi, yaban turpu peroksidaz ile birleştirilmiş poliklonal anti-Fare IgG ikincil antikorunu nitroselüloz membrana ekleyin.

Membranı inkübe ettikten ve yıkadıktan sonra, uygun bir görüntüleyicinin bir plakasına aktarın. Ardından, sinyali üreticinin talimatlarına göre tespit edin. DMB etiketli N-glikolil nöraminik asit, yedi ila dokuz dakika arasında sürer.

Ve DMB etiketli N-asetil nöraminik asit 10 ila 12 dakika arasında buharlaşır. Kromatogramda gözlenen birkaç küçük tepe noktası, reaksiyona girmemiş DMB ve reaksiyon ara ürünlerini temsil eder. Hücre lizatlarının HPLC kromatogramları, hücre lizatlarında bulunan diğer alfa keto asitlerle reaksiyondan kaynaklanan iç safsızlıkları ve DMB yan ürünlerini temsil eden birkaç tanımsız tepe gösterir.

N-asetil Mannozamin ile tedavi genellikle hücre yüzeyinde N-glikolilnöraminik asidin tükenmesine yol açar. N-propiyonil nöraminik asit veya N-butanoil nöraminik asit ile muamele edilmiş parçalanmış hücrelerin kromatogramlarında, karşılık gelen doğal olmayan sialik asitlerin görünümünü gösteren tepe noktaları gözlenir. DMB'nin sialik asit türleri ile reaksiyonu, bu boya ile etiketlenmemiş sialik asit türlerine kıyasla 116.2 daltonluk bir moleküler kütle artışına yol açar.

Potansiyel iyon türlerinin yanı sıra, sodyum eklentileri de gözlenir. DMB-Neu5Gc, reaksiyona girmemiş veya kısmen reaksiyona girmiş DMB türlerinden kısa bir süre sonra ortaya çıkar, bu da DMB-Neu5Gc'nin kütle spektrumundaki tanımsız zirvelerin görünümünü açıklar. Kelly nöroblastom hücrelerinin N-propionilmannozamin veya N-butanoylmannozamin ile tedavisi, hücre yüzeyinde polisiatik asit ekspresyonunun azalmasına yol açar.

Öte yandan N-asetilmannozamin ile tedavi, polisiatik asit ekspresyonunun artmasına neden olur. Bu tekniği uygulayarak, birkaç gün içinde mutlak sialilasyona sahip hücreler üretilebilir. Bu tür glikomühendislik hücreleri daha ileri deneylerde kullanılabilir.

Örneğin, reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek veya burada gösterildiği gibi, polisiatik asidin ekspresyonunu inhibe etmek. Burada sunulan metabolik mühendislik prosedürü, sialik asit deneyleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, aynı prosedür hayvan deneylerinde de kullanılabilir.

Sunulan protokolümüzün ve bu video prodüksiyonunun, yazarların, biyolojik sistemlerdeki sialik asit ve sialik asit reseptörlerinin işlevini ve biyolojik rolünü analiz etmek için metabolik glikomühendisliği laboratuvarlara getirmelerine yardımcı olacağını umuyoruz. Organik kimyagerler, daha karmaşık yapılara sahip N-asil modifiye mannozaminleri sentezleyebilir ve bunları protokolümüzde önerildiği gibi kullanabilirler. Protokolümüzü takiben, tüm numuneler floresan etiketlemeden hemen sonra analiz edilmelidir.

Sonuç olarak, HPLC ve ACMS analizörleri arasında herhangi bir gecikme olmamalıdır.