Name: Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması Epitelyal Gut Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Keşfedin Rhipicephalus microplus bağırsak epitel hücrelerinden biyotinli yüzey proteinlerinin arındırılması yöntemini. Streptavidin manyetik boncuklarla saflaştırma, kene biyolojisi araştırmalarında protein izolasyonu için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu çalışma için kullanılan Rhipicephalus microplus kenelerinin sağlanması için Biosecurity Tick Colony&#39;ye (Queensland Tarım ve Balıkçılık, Avustralya) ve Lucas Karbanowicz&#39;e video çekimi için yardım etmekten dolayı teşekkür etmek istiyorlar.

1. Bağırsak epitelinin R. microplus&#39;tan diseksiyonu <ol><li> Deney günü sığırlardan yarı-sıkıştırılmış kene toplayın. Kene ortasından kaldırıldıktan 24 saat sonra parçalara ayırın. </li><li> 92 mm x 16 mm Petri kabının tabanına bir şerit bandı yapıştırın. Kasete süper yapışkan bir damla ekleyin. Kene, ventral tarafı süper tutkal üzerine indirin, 2 dakika kurumaya bırakın. </li><li> Petri kabı içine 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) dökün veya kene tamamen su altına alıncaya kadar. </li><li> 11 numaralı bir neşter kullanarak, kene her iki yanında da gözlerin üstünden alttaki festo parçalarına kadar kesilir. </li><li> Steril forseps kullanarak, tamamen iç organları açığa, Kalkan ve alloscutum çıkarın. </li><li> Kirlenmeyi önlemek için ince beyaz iplik benzeri organları (trakea) ve diğer membranları çıkarın. </li><li> Bağırsağı, forseps kullanarak, üst bölgeyi sıkarak vekarkas. Kalan tüm bağırsak dokularını çıkarın, böylece başka dokuların parçalanmadığından emin olun. </li><li> Bağırsak proteinaz inhibitörü kokteyli (PIC) ile kalsiyum klorür ve magnezyum sülfat içermeyen buz soğukluğundaki Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde saklayın. Bağırsakları kuru buzda dondurun ve -20 ° C&#39;de saklayın. Not: Bağırsak diseksiyonu ve iç organların kene detaylarına yardımcı olmak için, D. Sonenshine&#39;in Bölüm 3.1&#39;ine, &quot;Kenların Biyolojisi&quot; na bakın. 19 . </li></ol> 2. Epitelyal Hücre Ayrışımı <ol><li> 50 ml tüp içinde 70 mikron hücre süzgeçine disseke bağırsak dökün. </li><li> Çözelti berraklaşıncaya ve bağırsaklar beyaz / berrak bir görünüm alıncaya kadar bağırsak dokusunu PIC ile 50 mL buz soğukluğundaki HBSS ile yıkayın. </li><li> PIC ile 30 mL buz soğukluğunda HBSS bağırsaklarını yeniden süspanse edin, hafifçe karıştırın ve bağırsaklarını pelet haline getirmek için 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. </li><lI&gt; Epitel bağırsak hücrelerini çıkarmak için bağırsağın 10 mL hücre kültürü ortamında Dulbecco&#39;nun modifiye kartal ortamı (DMEM),% 2 fetal buzağı serumu (FCS), 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1 mM Tris Karboksietil) fosfin (TCEP), PIC ile karıştırın ve 6 rpm&#39;de bir silindir kullanılarak yavaş döndürme altında 37 ° C&#39;de 60 dakika inkübe edin. </li><li> Süspansiyonu 250 um&#39;lik bir hücre süzgeci ile filtre edin, akış yolu ile girdaplayın ve kalan akış akışını toplayan 70 μm&#39;lik hücre süzgeci ile filtreleyin. </li><li> Süspansiyonu 500 xg&#39;de 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca santrifüjleyerek tek hücrelerin pelet haline getirin. </li></ol> 3. Bir yoğunluk santrifüj gradyanı kullanarak Tek Epitelyal Hücrelerin İzolasyonu <ol><li> Bir AP15 ön filtre kağıdından süzerek yoğunluk santrifüj gradyanını ( örn . Percoll) hazırlayın. Degrade katmanlamadan önce 1 saat süreyle% 40 ve% 20 Percoll&#39;u mqH 2 0 (v / v) içinde hazırlayın ve 4 ° C&#39;de soğutun. </li><li> Bir peristaltik kullanmaEn düşük hızda ayarlanan pompa, 3 mL&#39;lik% 40 yoğunluklu santrifüj gradyanı, 16 mL&#39;lik ultra santrifüj tüpüne yerleştirilerek 15 dakika boyunca buzda kalmasına izin verilir. Pompanın hızı dakikada bir &lt;1 mL&#39;ye ulaşmalıdır. </li><li> Tüpü 45 ° &#39;lik bir açıyla eğinmek için% 40 tabakanın üzerine% 20 yoğunlukta santrifüj gradyanını katmak için peristaltik pompayı kullanın. Pompanın hızı, dakikada 1 mL&#39;den az akış hızına ulaşmalıdır. Katmanların 15 dakika boyunca buzda kalmasına izin verin. </li><li> % 20-40 yoğunluklu santrifüj gradyanı üzerinde kan bağı hücreleri içeren 3 mL DMEM ortamı katmak için dakikada 1 mL&#39;den daha düşük peristaltik pompa kullanın. </li><li> Azami hızlanma ve minimum hızlanma için santrifüj programlayın. 10 dakika 600 x g&#39;de santrifüjleyin. Epitel tek hücrelerini izole etmek için DMEM ile interfazları toplayın:% 20 yoğunlukta santrifüj gradyanı ve% 20:% 40 yoğunlukta santrifüj gradyanları. Sonraki analizler için toplanan ara fazları 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol><html> 4. Hücre İzolasyonunun Değerlendirilmesi <ol><li> hemasitometre <ol><li> Hematitometre slaydını alkolle temizleyin. </li><li> Yavaşça hücreleri yukarıya ve aşağıya pipetleyerek hücreleri erteleyin. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde hücre süspansiyonundan 100 μL pipetleyin. </li><li> 0.4% Trypan Blue 400 μL ekleyin. Tüpü hafifçe oynatarak hafifçe karıştırın. </li><li> Hemocytometer&#39;in her iki haznesini yavaşça doldurmak için Trypan Blue ile işlenmiş hücre süspansiyonundan 100 μL pipetleyin. </li><li> Hemositometreyi, 10X&#39;lik bir hedefle hemositometrenin ızgara çizgilerine odaklanarak, hafif bir mikroskop altında yerleştirin. </li><li> Elde taşınan bir çarpıcı sayaç kullanarak, canlı olmayan lekelenmemiş hücreleri 16 kareden oluşan bir kümede sayın. Aynı meydanın içinde mavi ölü hücreleri sayın. 16 kareden oluşan dört set sayılana kadar saymaya devam edin. </li><li> Formül kullanarak mL başına toplam hücre sayısını hesaplayın: 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Aşağıdaki formülle hücre yaşayabilirliğini hesaplayın: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Hücre İzolat Görselleştirme <ol><li> 1,5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpünde 9 μL HBSS&#39;de izole hücrelerin 1 μL&#39;sini seyreltin. Mikro santrifüj tüpünü nazikçe karıştırmak için kullanın. </li><li> Bir cam slayt ortasına HBSS izole hücrelerin 5 mcL Pipet. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile üç damla montaj aracı uygulayın. </li><li> Slayt 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Hava kabarcıkları önleyerek preparatın üzerine bir kapak kayışı yerleştirin. </li><li> Floresan mikroskop altında 360 nm uyarımda DAPI ile lekelenmiş hücreleri ve 460 nm&#39;de emisyonu görselleştir. </li></ol></li></ol> 5. Hücre Yüzey Proteini Biyotinilasyonu <ol><li> Biotinat 100 uL tek hücreli epitel hücrelerinin Biotin (Tip A) KonjugasyonuKiti, üreticinin talimatlarına göre 1: 1 yüzey proteininin konjuge edilecek molar bir oranda </li><li> Hücre lizisi için, biyotinlenmiş hücrelere 100 μL PBS,% 1 Triton X-100,% 10 gliserol, 100 uM oksitlenmiş glutatyon ve PIC ekleyin. 10 dakikada bir hafifçe karıştırarak buz üzerinde 1 saat inkübe edin. </li><li> Çözünmeyen maddeyi pelet haline getirmek için 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 20,000 xg&#39;de biyotinlenmiş hücreleri santrifüjleyin. Sitoplazmik ve biyotinlenmiş zar proteinleri içeren süpernatantı toplayın. </li><li> Bradford tahlili ile protein konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol> 6. Biyotinlenmiş Yüzey Proteinlerin İzolasyonu <ol><li> 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 50 μL Streptavidin Manyetik Boncuk ekleyin. </li><li> Boruyu manyetik bir standa yerleştirin, boncukları tüpün yanına toplayın. Süpernatanı çıkarın ve atın. </li><li> Tüpe 1000 μL TBS,% 0.1 Tween-20 ekleyin. Nazikçe karıştırın ve manyetik kütlesi ile boncukları toplayınd. Süpernatanı çıkarın ve atın. </li><li> Yıkanmış manyetik boncuklar ile 1x PBS&#39;de 300 μL&#39;ye seyreltilmiş 40 μg biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinlerini birleştirin. Çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. </li><li> Boncukları manyetik bir ayakla toplayın, yüzen maddeyi çıkarın ve atın. </li><li> Boncukları tekrar askıya almak için hafifçe karıştırarak 300 μL TBS,% 0.1 Tween-20 tüp ekleyin. Boncuk toplayın, süpernatanı çıkarın ve atın. Bu yıkama adımı iki kez tekrarlayın. </li><li> Manyetik boncuklara 0.1 M glisin pH 2.0&#39;dan 100 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Boncuk toplayın ve elüt edilen biyotinlenmiş yüzey proteinleri içeren süpernatantı çıkarın. </li><li> İzole edilmiş yüzey proteinlerini% 4-20 Tris-MOPS SDS-PAGE jelinde canlandırabilirsiniz. </li></ol> 7. Biyotinlenmiş Yüzey Proteininin Değerlendirilmesi <ol><li> Nokta leke <ol><li> Nitroselüloz zarın 7 cm x 3 cm şeridini kesin. </li><li> 10 μg total tick gu uygulayınT içerikleri (yukarıdaki 1.8&#39;den) ve membrana 10 ug biyotinlenmiş yüzey proteini. Oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın. </li><li> Bir kutuya aktarın ve 100 mL bloke edici tampon içine batırın. Bir saat çalkalanarak oda sıcaklığında inkübe edin. Engelleme tamponunu atın. </li><li> Çalkalamayla 5 dakika boyunca 100 μL PBS,% 0.05 Tween-20 içinde nitroselüloz zar yıkayın. Yıkama tamponunu atın ve yıkamaları ç kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında ajitasyon ile 2 saat süreyle 100 uL PBS,% 0.05 Tween-20&#39;de 1/5000 Streptavidin-yaban turbu peroksidazı (HRP) içinde inkübe edin ve kalan solüsyonu atın. </li><li> Nitroselüloz membranı 100 μL PBS,% 0.05 Tween-20 ile çalkalamayla 5 dakika yıkayın. Yıkama tamponunu atın ve yıkamayı üç kez tekrarlayın. </li><li> Tespit için 1 tablet 4-kloro-1-napthol 10 mL buz soğukluğunda metanol içinde çözülür. 20 mL TBS&#39;e 4 mL metanol stok ekleyin. 10 μL taze% 30 hidrojen peroksit ve immedi ekleyinNitroselüloz membrana uygulayınız. </li><li> Oda sıcaklığında ajite çözünmeyen bir mavi son ürün üretene kadar çalkalayarak inkübe edin. Bu işlem 2-15 dakika sürebilir. </li><li> Tespit solüsyonu atın ve 100 uL MQH 2 O., membran üç defa yıkamak </li></ol></li><li> ELISA Testi <ol><li> Her bir numunenin 200 ng&#39;si 400 mcL 100 mM Karbonat kaplama tamponu ile inceltin ve ELISA plakasının (düz alt kuyular) birinci sıranın (A #) 2 katını kaplayın. </li><li> Sıradaki diğer karşılık gelen oyuklara (BH) 100 mM&#39;lik karbonat kaplama tamponu 100 uL ekleyin. </li><li> Her bir numunenin seri seyreltmelerini, A sırasındaki her kuyudan 100 mcL pipetle alınarak ve B sırasına aktararak hazırlayın. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve kabarcıklar üretmekten kaçının. Satır H&#39;deki her bir kuyudaki son 100 mcL&#39;yi atarak, her satıra kadar seyreltmeleri tekrarlayın. </li><li> Plakayı parafilm ile örtün ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tablayı yıkaE başına 200 μL PBS,% 0.05 Tween-20 ile üç kez. </li><li> Kaplanmış oyuklara 200 uL engelleyici tampon ekleyin, Parafilm ile kaplayın ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 / 15,000 Streptavidin-HRP&#39;yi blokaj tamponunda seyreltin ve plakanın her oyuğuna 100 uL ekleyin. Parafilm ile kaplayın ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Plakayı, beş kez 200 uL PBS,% 0.05 Tween-20 oranında yıkayın. </li><li> Tespit etmek için, göz başına 100 μL TMB reaktif ekleyin. Yeterli renk gelişiminden sonra, genellikle 10-15 dakika arasında, reaksiyonu durdurmak için 100 uL 1 M fosforik asit ekleyin. </li><li> Λ = 450 nm&#39;de her kuyunun absorbansını okuyun. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li>
<li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li>
<li>García-García, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li>
<li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management%3A+The+state+of+play%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li>
<li>Kearney, S. <a target="_blank" href="https://dpir.nt.gov.au/__data/assets/pdf_file/0007/233269/845.pdf">Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks</a>. , AgNote No. K58. (2013).</li>
<li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li>
<li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li>
<li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li>
<li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+Tick+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li>
<li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0965174897000611">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li>
<li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+separate+apical%2C+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li>
<li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Acad.+Bras.+Ci%C3%AAnc%22%5BJournal%5D)">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).</li>
<li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li>
<li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li>
<li>Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aObenchain%2C+FR+%22Current+Themes+in+Tropical+Science+Volume+1%22">Current Themes in Tropical Science Volume 1</a>. , Pergamon Press. 201-205 (1982).</li>
<li>Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=ucg4AAAAQBAJ&source=gbs_book_similarbooks">&#34;Biology of Ticks&#34</a>. 1, Two, Oxford University Press. (2014).</li>
<li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://search.library.utoronto.ca/details?296351&uuid=a608221a-1254-44a3-8e22-b81b799145f5">&#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&#34 (English Translation)</a>. , Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sığır istilası, akarisitlerin 1 , 4 kullanımına bağlı en yaygın kontrol yöntemiyle dünyanın tropik ve subtropikal bölgelerinde sığır endüstrisi için büyük bir problem teşkil etmektedir. Bm86, daha önce Bm86 coğrafi dizilim varyasyonu ve düzenli boostlama gereksinimi 4 nedeniyle, bir aşı stratejisi olarak sınırlı başarı ile, R. microplus istila 10&#39;a karşı koruyucu bir antijen olarak kene bağırsak epitel...

Sığır kenesi Rhipicephalus microplus , sığır kene humması (babesiosis), anaplasmosis ve equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4&#39;ü vektörelleştirdiği için tropik ve subtropikal bölgelerdeki sığır endüstrisi üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Zararlı etkiyi azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır ancak kimyasal akarisitlerin kullanımı gibi geleneksel yöntemlerin süt ve ette kimyasal kalıntıların varlığı ve kimyasal olarak dirençli kenelerin yaygınlığı gibi örtük dezavantajları vardır 5 , 6 , 7 . Sonuç olarak, doğal dirençli sığırların kullanımı, biyolojik mücadele (biyoparestisitler) ve aşı gibi alternatif kene kontrol yöntemlerinin geliştirilmesi incelenmiştirInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Aşı adayları olarak kullanılabilecek proteinlerin peşinde, mevcut araştırma kene bağırsağına odaklanmaktadır. Orta bacak duvarları, ince bir bazal tabakaya dayanan, tek katlı epitelyal hücrelerden oluşur; bazal laminanın dış kısmı kas ağını oluşturur. Işık ve elektron mikroskopu gözlemleri, orta bağırsağın üç tip hücreden oluştuğunu göstermektedir: rezerv (ayırt edilmemiş), sekresyon ve sindirim. Hücre tiplerinin sayısı, fizyolojik faza bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Sekretuar ve sindirim hücreleri, hem rezerv hücreler 18 , 19 , 20&#39;den kaynaklanır . CDNA kütüphanelerinin inşasıKene bağırsağının bileşimini incelemek potansiyel aşı adayları olan Bm86 gibi antijenik proteinlerin tanımlanmasına yol açtı 2 , 3 , 4 . Glikoprotein Bm86, kenarı bağırsak hücrelerinin yüzeyinde lokalizedir ve aşılanmış sığırlarda sığır kenesine ( R. microplus ) karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi oluşturmaktadır. Bağışıklık kazandırılmış konak tarafından üretilen anti-Bm86 IgG&#39;leri kene tarafından alınır, bu antijeni tene bağırsak hücrelerinin yüzeyinde tanır ve sonra da bağırsak dokusunun işlevi ve bütünlüğünü bozmaktadır. Bm86 antijenlere dayanan aşılar sayısı, ağırlık ve daha sonra kene kuşak 4 düşük bir larva istila sonuçlanan kadın engorging üreme kapasitesini azaltarak, R. microplus ve Rhipicephalus annulatus etkin biçimde kontrol göstermiştir. Bununla birlikte, Bm86 esaslı aşılar tüm kene aşamalarına karşı etkili değildir veBazı coğrafi R. microplus suşlarına karşı yetersiz etkinlik gösterdiğinden, sığır ve süt endüstrileri bu aşıları 2 , 4&#39;ü kötü şekilde benimsemişlerdir. Epitel hücrelerini kan bağı bağından ayırma yeteneği, farklı çevre koşullarında morfoloji ve fizyoloji de dahil olmak üzere protein membran kompozisyonunu belirlemek için araştırmanın ilerlemesini sağlayacak önemli bir yeniliktir. Burada tarif edilen metot, alt epitel destek dokularından epitelyumu 10 serbest bırakmak için kenetleme maddesi etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve indirgeyici ajan tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) kullanmaktadır. Epitel, dokuların mekanik olarak parçalanması sonrasında sallayarak, ardından Percoll&#39;da süreksiz gradyent santrifüjlemeyle toparlanır. Bu makale, kene gut epi&#39;sinin izolasyonu için uygulanabilir ve yeni bir teknik tanımlamaktadırHücre hücreleri. Bu epitelyal hücrelerin yüzeyinden izole edilen biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra FACS ve / veya LC-MS / MS analizi gibi aşağı akım uygulamaları ile analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>%0,4 Tripan Mavisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>3322</td><td></td></tr><tr><td>100mM Karbonat Tamponu</td><td></td><td></td><td>3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml damıtılmış su pH 9,6</td></tr><tr><td>16 mL sızdırmazlık kapaklı santrifüj tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0016</td> Gradyan 250 ve <td>mikrodan önce buzda soğutun</td></tr><tr><td>; M hücre süzgeci</td><td>Thermo Fisher</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>3,3 & prime ;, 5,5 & prime; -Tetrametilbenzidin (TMB) ELISA</td><td>Sigma</td><td>T0440</td> için Sıvı Substrat Sistemi <td>4C'de Saklanır</td></tr><tr>%<td>30 Hidrojen Peroksit</td><td>Laboratuvar Sahnesi</td><td>BSPA5.500</td><td></td></tr><tr><td>%4-20 Tris-MOPS Jel</td><td>Gen Komut Dosyası</td><td>M42015</td><td></td></tr><tr><td>4-Kloro-1-naftol tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tüp</td><td>Corning Mavisi</td><td></td><td>30 x 115mm stil. Polipropilen konik boru.</td></tr><tr><td>70 ve mikro; M hücre süzgeci</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>AP15 filtre kağıdı</td><td>Millipore AO1504200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin (Tip A) Konjugasyon Kiti</td><td>Abcam</td><td>Ab102865</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>DP Manager&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>2.2.1.195</td><td>Hücre görüntü yazılımı</td></tr><tr><td>Koli Bandı</td><td>Ev Tamircisi</td><td></td><td>48mm x 25mm Koli Bandı</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM - protokol EDTA için buz gibi</td></tr><tr><td></td><td>Amresco</td><td>0105-500G</td><td></td></tr><tr><td>F96 Maxisorp İmmüno</td><td>Plaka Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>FCS</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu ve nbsp;</td><td>&nbsp; Olimpos&nbsp;</td><td>DAPI</td> Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI Forseps Dumont # 9 Dumont - Switerzland Gliserol Sigma-Aldrich G5516 Moleküler biyoloji için Gliserol ile BX51 <td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>>% 99</td></tr> <tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>El Tipi Tezgah Ofisleri JA0376230 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>H9394</td><td>HBSS ve protokol Hematitometre için buz gibi</td></tr> soğuk <tr><td></td><td>Optik Lakor</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>L-Glutatyon oksitlenmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Ayırma Standı</td><td>Novagen-4</td><td></td> <td>Tüplü Manyetik Ayırma Rafı</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Su</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>Ultra Saf Su için Entegre Su Arıtma Sistemi</td></tr><tr><td>Nitroselüloz Membran</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>66485</td><td>30cm x 3M saf nitroselüloz membran</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained protein Merdiven</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM0671</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml damıtılmış su) pH 7,4</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Masterflex</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>Fosforik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6560</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein İçermeyen T20 PBS Bloke Edici Tampon</td><td>Termo-Scientific</td><td>37573</td><td>4C'de Saklanır. Bloke Edici Tampon</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215-5ML</td><td>PIC &ndash; -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hızlı Başlangıç Bradford Boya Reaktifi 1x</td><td>Biorad</td><td>500-0205</td><td>Bradford Testi için</td></tr><tr><td>Hızlı Başlangıç BSA Standartları</td><td>Biorad</td><td>500-0207</td><td>Bradford Testi için BSA standartları</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Laboratuvarı Co Boyutu</td><td></td><td>11 Neşter</td></tr><tr><td>SilverQuest TM Boyama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Simply Blue TM Güvenli Boyama&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall C6 + Ultrasantrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Manyetik Boncuk</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı - Ultra Hızlı Mini</td><td>UHU</td><td></td><td>UHU Süper Yapıştırıcı 1mg. Ultra Hızlı mini</td></tr><tr><td>Masa Üstü Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td>Ratek</td><td>VM1</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Hibe</td><td>GD100</td><td></td></tr></tbody></table>

biyotinile hücre yüzey proteinlerinin arındırılması<emrhipicephalus microplus</em&gt; epitelyal gut hücreleri

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus - sığır kene - birçok patojen vektörü olarak hayvancılık üzerindeki ekonomik etki açısından en önemli ektoparazitedir. Damla bağırsak epitel hücrelerinin yüzeyinde bulunan BM86 gibi aşı adaylarının bulunmasına odaklanarak, zararlı etkilerini azaltmak için sığır kene kontrolüne yönelik çalışmalar yapılmıştır. Mevcut araştırmalar, diğer aşı adaylarını taramak için cDNA ve genomik kütüphanelerin kullanımına odaklanmaktadır. Dişi bağırsak hücrelerinin izolasyonu, kenet hücresi zarı üzerine yüzey proteinlerinin kompozisyonunun araştırılmasında önemli bir avantaj teşkil eder. Bu yazı, yarı-sıkışmış R. microplus&#39;un bağırsak içeriğinden epitel hücrelerinin izolasyonu için yeni ve uygulanabilir bir yöntem teşkil etmektedir . Bu protokol, subepitelyal destek dokularından epitel hücrelerini serbest bırakmak için TCEP ve EDTA&#39;yı ve süreksiz yoğunluk santrifüj gradyanını kullanmaktadırNt, epitel hücrelerini diğer hücre türlerinden ayırır. Hücre yüzey proteinleri biyotinile edildi ve FACS veya LC-MS / MS analizinde aşağı akış uygulamaları için streptavidin bağlantılı manyetik boncuklar kullanarak kene bağırsak epitel hücrelerinden izole edildi.

Epitelyal hücreler, Şekil 1&#39;de sunulan şematik gibi R. microplus&#39;un bağırsak dokularından izole edildi. Bu protokolü kullanarak hazırlanan kene bağırsak epitel hücrelerinin temsili floresan mikroskopi görüntüleri Şekil 2A&#39;da gösterilmektedir Ve 2B. Hücre izolasyonu, yarı-tıkanmış R. microplus üzerinde yapıldığından , ...

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Rhipicephalus microplus epiteliyal bağırsak hücrelerinden biyotinize hücre yüzeyi proteinlerinin saflaştırılması. Bu çalışmada, Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan tekil epitel hücrelerini izole etmek için modifiye edilmiş Percoll gradyan tabanlı bir metodoloji kullanılmıştır. Yüzeye bağlı proteinler biyotinize edilmiş ve sonraki uygulamalarda kullanılmak üzere streptavidin manyetik boncuklar aracılığıyla saflaştırılmıştır.Yarı doymuş Rhipicephalus microplus'un bağırsak epitelinin diseksiyonu. Aşağıdaki malzemelere ihtiyacınız olacaktır. Bir Petri kabının tabanına bir şerit koli bandı yapıştırın.Banda bir damla Super Glue ekleyin. Keneyi, kurumaya bırakacak şekilde, karın tarafı Super Glue'ya gelecek şekilde yerleştirin. Keneyi tamamen 100 mL PBS içine batırın.11 numara bistüri kullanarak, kenenin her iki tarafında gözlerin üst kısmından alt kıvrımlara kadar kesin. Steril penset kullanarak, iç organları açığa çıkarmak için scutum ve alloscutum bölgelerini tamamen çıkarın. İnce beyaz iplik benzeri organları ve diğer membranları uzaklaştırın.Pens yardımıyla bağırsakları çıkarın. Bağırsakları buz gibi soğuk HBSS ve PIC içinde saklayın. Epitel hücre disosiyasyonu.Şu malzemelere

purification-biotinylated-cell-surface-proteins-from-rhipicephalus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu video, başarılı içselleştirmeyi doğrulamak için biyotinilasyon ve ardından hücre lizisi, streptavidin bazlı protein ekstraksiyonu, denatürasyon ve Western blot analizi kullanarak fare kortikal astrositlerinde hedef protein içselleştirmesini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Bir Biyotin Türevi Kullanılarak Hedef Yüzey Proteinlerinin İçselleştirilmesinin Değerlendirilmesi

Membran kaçakçılığı, proteinlerin plazma zarından hücre içine taşınmasını (yani endositoz) ve ardından bozunma için lizozomlara veya geri dönüşüm için plazma zarına kaçakçılığı içerir. Bu makalede açıklanan yöntemler, endositoz ve plazma zarı proteinlerinin geri dönüşümünü incelemek için tasarlanmıştır.

Plazma Zarı Proteinlerinin Endositozu ve Geri Dönüşümünü İncelemek için Hücre Bazlı L-Glutatyon Koruma Testleri

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Hücre içi protein katlanması için doğal bir kalite kontrol mekanizmasına sahip olan Escherichia coli ikiz-arginin translokasyon yolunu kullanarak, bağlanma afinitesi ve sitoplazmik çözünürlük için bir antikor fragmanları kitaplığını aynı anda taramak için bir yöntem sunuyoruz, antikor fragmanlarını iç zarda görüntülemek için.

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Keşfedin Rhipicephalus microplus bağırsak epitel hücrelerinden biyotinli yüzey proteinlerinin arındırılması yöntemini. Streptavidin manyetik boncuklarla saflaştırma, kene biyolojisi araştırmalarında protein izolasyonu için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması

Daha fazla video keşfet