Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus epitelyal bağırsak hücrelerinden biyotinile hücre yüzey proteininin saflaştırılması. Bu çalışmada, Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan bireysel epitel hücrelerini izole etmek için modifiye edilmiş bir Percoll gradyan tabanlı metodoloji kullanılmıştır. Yüzeye bağlı proteinler, sonraki uygulamalarda kullanılmak üzere streptavidin manyetik boncukları aracılığıyla biyotinillendi ve saflaştırıldı.

Bağırsak epitelinin yarı tıkalı Rhipicephalus microplus'tan diseksiyonu. Aşağıdaki malzemelere ihtiyacınız olacak. Bir Petri kabının altına bir şerit koli bandı yapıştırın.

Banda bir damla Süper Yapıştırıcı ekleyin. Keneyi ventral tarafı aşağı bakacak şekilde Süper Yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve kurumasını bekleyin. Keneyi tamamen 100 mL PBS'ye batırın.

11 numara bir neşter kullanarak, kenenin her iki tarafındaki gözlerin üstünden alt festonları kesin. Steril forseps kullanarak, iç organları açığa çıkarmak için scutum ve alloscutum'u tamamen çıkarın. İnce beyaz iplik benzeri organları ve diğer zarları çıkarın.

Forseps kullanarak bağırsağı çıkarın. Bağırsakları buz gibi HBSS ve PIC'de saklayın. Epitel hücre ayrışması.

Aşağıdaki malzemelere ihtiyacınız olacak. Disseke edilmiş bağırsağı 50 mL'lik bir Falcon tüpünün içindeki 70 mikronluk bir hücre süzgecine dökün. Falcon tüpünün içinde bir vakum oluşabileceğinden, hava sirkülasyonuna izin vermek için filtreyi kaldırın.

Bağırsak dokusunu PIC ile 50 mL buz gibi HBSS ile yıkayın. PIC ile 30 mL buz gibi HBSS'de bağırsakları yeniden askıya alın. Gerekirse, bağırsakların yeniden askıya alınmasına yardımcı olmak için steril bir kazıyıcı kullanın.

500 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Bağırsak hücrelerini 10 mL DMEM,% 2 FCS, 5 milimolar EDTA, bir milimolar TCEP ve PIC'de yeniden süspanse edin.

Yavaşça karıştırın. Bir merdane kullanarak yavaş dönüş altında 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Süspansiyonu 250 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.

Akışı girdapla geçirin. Ve 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzerek kalan akışı toplayın. Süspansiyonu santrifüjleyin.

Percoll gradyanı kullanılarak tek epitel hücrelerinin izolasyonu. Aşağıdaki malzemelere ihtiyacınız olacak. AP15 ön filtre kağıdından süzerek, %40 ve %20 Percoll'u Milli-Q suda hazırlayın.

Percoll solüsyonu ile steril bir şırınga yükleyin. Filtre donanımına uygulayın ve Percoll'u yavaşça boşaltın. Degradeyi katmanlamadan önce bir saat boyunca dört santigrat derecede soğutun.

Peristaltik pompayı gösterildiği gibi ayarlayın. En düşük hıza ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanarak, 16 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne üç mL %40 Percoll katmanı. 15 dakika buz üzerinde oturmasına izin verin.

Pompanın hızı, dakikada bir mL'den daha az bir akış hızına yol açmalıdır. Tüpü 45 derecelik bir açıyla eğerek, %20Percoll'u %40'lık katmanın üzerine yerleştirmek için peristaltik pompayı kullanın. Damlacıkların alt katmanlarla karışmasını önlemek için çıkış tüpünün santrifüj tüpüne dayandığından emin olun.

Pompanın hızı, dakikada bir mL'den daha az akış hızına yol açmalıdır. Katmanların 15 dakika buz üzerinde oturmasına izin verin. % 20 ila 40 Percoll gradyanı üzerinde izole epitel hücrelerini içeren üç mL DMEM çözeltisinin katmanına dakikada bir mL'den daha az akış hızında peristaltik pompa kullanarak.

Damlacıkların alt katmanlarla karışmasını ve gradyanı bozmasını önlemek için çıkış tüpünün santrifüj tüpüne dayandığından emin olun. 600 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Epitelyal tek hücreleri izole etmek için DMEM, %20 Percoll gradyanı ve %20 %40 Percoll gradyanları arasındaki interfazları toplayın.

Hücre yüzey proteini biyotinilasyonu ve biyotinile yüzey proteinlerinin izolasyonu. Aşağıdaki malzemelere ihtiyacınız olacak. Üreticinin talimatlarına göre Biotin Tip A Konjugasyon Kiti kullanılarak 100 mikrolitre tek hücreli epitel hücresini biyotinilatın.

Biyotinile hücrelere 100 mikrolitre PBS, %1 Triton X-100, %10gliserol, 100 mikromolar okside glutatyon ve PIC ekleyin. Her 10 dakikada bir hafifçe karıştırarak bir saat buz üzerinde inkübe edin. Hücre ekstraktını 20.000 g'da dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin ve bir kenara koyun.

1.000 mikrolitre TBS% 1 Tween-20 ile yıkayarak 50 mikrolitre streptavidin manyetik boncuk hazırlayın. Parmağınızla hafifçe vurarak hafifçe karıştırın. Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve boncukları tüpün yan tarafına doğru toplayın.

Süpernatanı çıkarın ve atın. 300 mikrolitre biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini yıkanmış manyetik boncuklarla birleştirin. Çalkalama ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Manyetik stand ile boncukları toplayın, süpernatanı çıkarın ve atın. Tüpe 300 mikrolitre TBS %1 Tween-20 ekleyin, boncukları yeniden süspanse etmek için hafifçe karıştırın. Boncukları toplayın, süpernatanı çıkarın ve atın.

Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Manyetik boncuklara 1 molar glisin pH iki'den 100 mikrolitre ekleyin. Ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Boncukları toplayın ve ayrıştırılmış biyotinile yüzey proteinleri içeren süpernatanı çıkarın. Şekil bir, epitel hücrelerini ve yüzey proteinlerini bütün bir keneden izole etmek için kullanılan protokolün bir temsilidir. Bu protokolü kullanarak,% 75 ila 80 canlılık ve 20 ila 24 mikrogram saflaştırılmış biyotinile yüzey proteini, 50 kene'lik bir ilk diseksiyondan mL başına yaklaşık 1.2 ila 10 ila yedi hücre saflaştırılabilir.

Bu protokol kullanılarak hazırlanan kene get epitel hücrelerinin temsili floresan mikroskobu görüntüleri şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir. Hücreler, numune boyunca tekil, küresel, pürüzsüz yüzey morfolojisi ve tutarlı bir boyut olarak görünür. Zayıf izolasyonlar, değişen hücre boyutları ve morfolojileri yoluyla tanımlanan değişen hücre popülasyonlarına sahip bireysel epitel hücrelerinin eksik ayrışmasını içerecek şekilde görselleştirilir.

Konakçı proteinlerden çapraz kontaminasyon, şekil 3A, beyaz veya berrak bir Percoll gradyanı üretmek için kene bağırsaklarının yeterince durulanması ile en aza indirilebilir, şekil 3B. Proteinlerin SDS-PAGE, şekil 4A, gümüş boya, şekil 4B, nokta leke, şekil beş ve ELISA, şekil altı ile karşılaştırılması, açıklanan metodolojilerin, Rhipicephalus microplus kene bağırsaklarından izole edilen bireysel epitel hücrelerinden biyotinile yüzey proteinlerini başarıyla saflaştırdığını göstermektedir. Sonuç olarak, bu çalışmada kullanılan yöntemler, Rhipicephalus microplus'ın tüm bağırsağından bireysel epitel hücrelerini başarıyla izole etti.

Rhipicephalus microplus epitel hücrelerinin yüzeyinden proteinler, daha ileri analiz ve çalışmalar için elde edildi. Son olarak, geliştirilen protokol, kene bağırsağından bireysel epitel hücrelerinin potansiyel verimini ve hücrenin biyotinile yüzey proteinlerinin verimliliğini göstermiştir. Geliştirilen protokol, bağırsağın zar protein bileşimini inceleyerek kene-konak etkileşimlerini araştırmak amacıyla ekonomik öneme sahip herhangi bir kene türünde kullanılabilir.