Kişisel bakım ürünleri için lisans öğretim laboratuvar bir maya östrojen ekran optimize kullanarak östrojenik ligandlar saptamak

Bu prosedürün genel amacı, kişisel bakım ürünlerinden ekstrakte edilen insan östrojen reseptör agonistlerini miktar olarak belirlemek için bir maya östrojen taraması kullanmaktır. Bu yöntem; sudaki, gıdalardaki ve kişisel bakım ürünlerindeki çevresel östrojenleri tespit edip miktarını belirlediği için toksikoloji, endokrin bozulma ve ekofizyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu in vitro tekniğin temel avantajları, düşük maliyetli olması, yaygın olarak kullanılması ve teknik laboratuvar becerilerinin öğretimi için mükemmel bir platform sunmasıdır.

Çevresel östrojenlerin tespiti kritik öneme sahiptir çünkü bu maddeler, özellikle fetal gelişim ve ergenlik gibi fizyolojik geçiş dönemlerinde hormonal sinyalizasyonu değiştirebilirler. Bu yöntemin en zor kısımları, kullanımı kolay bir uygulama geliştirerek basitleştirdiğimiz hesaplamalar ve veri analizidir. Ayrıca, hassas pipetleme işlemi temel gerekliliktir.

Bu protokol, reaktiflerin hazırlanmasıyla başlar. Deneyin birinci gününde kullanılacak glikoz ve galaktoz ortamlarını, %50 etanol taşıyıcı kontrollerini ve estradiol standartlarının yanı sıra; ikinci gün için LacZ tamponu, ditiotreitol ve sodyum karbonatı hazırlayın. Glikoz ve galaktoz ortamlarını 0.2 mikrometre filtre üzerinden filtrasyonla sterilize edin.

Tek bir 96 kuyucuklu plakada, 23 farklı kişisel bakım ürünü (KBU) veya ekstraksiyon kontrolü üç paralel şeklinde test edilebilir. KBU'lar arasında sabun, saç kremi, şampuan, güneş kremi, makyaj malzemeleri, tıraş kremi ve losyonlar yer alır. Çekim amaçlı olarak, yalnızca sekiz KBU'dan örnekler hazırlanacaktır.

Her bir örneğin bir gramını, 15 ml'lik konik tüplerde 10 ml susuz etanol ile birleştirin. Ayrıca, 15 ml'lik bir konik tüpte 11 ml susuz etanolden oluşan bir negatif ekstraksiyon kontrolü hazırlayın. Her bir konik tüpün içeriğini, manuel çalkalama ve vorteksleme kombinasyonu ile 30 dakika boyunca homojenleştirin.

Konik tüpleri bir sepet santrifüjle izin verilen maksimum hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Her tüpteki süpernatantı, 40 µm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mL'lik konik bir tüpe dekante edin. Ardından, her bir 50 mL'lik tüpün içeriğini cam bir sintilasyon şişesine aktarın.

Viyalleri bir hafta boyunca havalandırmalı bir çeker ocakta açık bırakarak etanolün tamamen buharlaşmasını sağlayın. Işığa duyarlı bileşenlerin bozulmasını önlemek için kurutulan örnekleri ışıktan koruyun. Örnekler kuruduğunda, her bir örneği bir mililitre %50 etanol ile yeniden çözün ve ardından homojenleştirmek için vorteksleyin.

Maya östrojen tarama veya YES plakaları hazırlanmadan iki gece veya yaklaşık 42 saat önce, her bir aktif maya kültüründen 0,1 mililitreyi steril bir Erlenmeyer flask içindeki 10 mililitrelik filtre sterilize edilmiş glukoz besiyerine ekleyerek steril teknikle alt kültürleme yapın. 30 °C'de inkübe edin ve orijinal kültürleri stok olarak inkübe etmeye devam edin. İki gün sonra, YES analizinin birinci gününde, süspansiyon halindeki maya kültürlerini ve filtre sterilize edilmiş galaktoz besiyerini steril bir beherde seyreltmek için steril teknik kullanın.

Her bir maya örneğinden 120 µL'yi üç paralel şeklinde ve beraberinde üç paralel galaktoz ortamı boşluğunu şeffaf bir polistiren plağa pipetleyerek optik yoğunluğu doğrulayın. Seyreltilmiş maya kültürünün 610 nm dalga boyunda net optik yoğunluğunun 0,065 ± 0,005 olduğunu doğrulamak için bir plaka spektrofotometresi kullanın. Galaktoz ortamı boşluklarının OD610 değerlerini çıkararak mayanın net OD610 değerini belirleyin.

Steril bir şırınga ucuyla kullanılan tekrarlayıcı bir pipet yardımıyla, seyreltilmiş maya süspansiyonunu bu plaka düzenine uygun olarak steril bir polipropilen 96 kuyucuklu mikroplakadaki kuyucuklara ekleyin. Pipetleme işlemi sırasında, beheri sürekli çevirerek veya pipetle karıştırarak kaynak mayanın süspansiyon halinde kalmasını sağlayın. Son olarak, plaka düzeninde yeşil ile belirtilen H10 ile H12 arasındaki kuyucuklara, yalnızca medyanın katkıda bulunduğu absorbansı hesaplamak amacıyla medya kontrolleri olarak hizmet edecek 120 µL filtre-sterilize galaktoz medyası ekleyin.

Test edilecek her bir maya suşu ve kolorimetrik substrat kombinasyonu için ayrı plaklar hazırlayın. Ardından, plaka düzenine göre seri dilüsyon yaparak her plakta bir standart eğri oluşturun. Kuyucuklara A1, A2 ve A3'e beş mikrolitre estradiol standardı eklemek için steril uçlu, tek kanallı bir pipet kullanın. Kuyucukların içeriğini pipetleme yoluyla karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve ardından A1 ile A3 arasındaki kuyucuklardan 205 mikrolitreyle B1 ile B3 arasındaki kuyucuklara aktarın. 205 mikrolitrelik aktarma işlemini G satırına kadar tekrarlayın. Seri dilüsyon tamamlandıktan sonra, G1 ile G3 arasındaki kuyucuklardan 205 mikrolitre atın. Bu adımın sonunda, tüm standart kuyucuklar 120 mikrolitre içermelidir.

Bu plaka düzeninde mavi ile belirtilen, maya süspansiyonu içeren H1, H2 ve H3 araç kontrol kuyucuklarının her birine beş mikrolitre %50 etanol ekleyin. Bir sonraki adım, plaka düzeninde mor ile belirtilen ve maya süspansiyonu içeren kuyucuklara, örneklerin veya negatif ekstraksiyon kontrollerinin beş mikrolitrelik üçlülerini eklemektir. Hangi örneklerin veya ekstraksiyon kontrollerinin hangi kuyucuklara yerleştirildiğini not edin.

Hangi kuyucukların örnek içerdiğini ve hangilerinin içermediğini takip edebilmek için yeni bir uç kutusuyla başlayın ve kutudaki uçları, plaktaki ilgili kuyucukların konumlarıyla aynı konumlardan kullanın. Örnek, ekstraksiyon kontrolü ve taşıyıcı kontrolü kuyucuklarının içeriğini pipetleme yoluyla karıştırın. Her birinden 205 µL uzaklaştırarak bu kuyucukların hacimlerini 120 µL'ye ayarlayın.

Her bir plakayı steril yapışkan gözenekli bir filmle mühürleyin, etiketleyin ve 30 °C'de 17 saat boyunca inkübe edin. 17 saatlik inkübasyonun ardından plakaları inkübatörden çıkarın. Plakalar hemen işlenemiyorsa, onları streç filmle sarın ve sarılı plakaları altı gün boyunca 4 °C'de soğukta muhafaza edin.

Plakaları işlemeye hazır olduğunuzda, paketlerini açın. Kuyucukların her bir satırındaki içeriği karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve ardından her bir kuyucuktan 50 µL maya süspansiyonunu şeffaf polistiren 96 kuyucuklu mikroplakanın karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. Yeni plakayı etiketleyin.

Kuyucuklar arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için her kuyucukta yeni pipet uçları kullanın, ancak uçların steril olması gerekmez. Bir çeker ocakta, 1 mM nihai konsantrasyon elde etmek için 20 mL çözünmüş, oda sıcaklığındaki LacZ tamponuna 20 µL 1 M DTT ekleyin. LacZ tamponunu iyice karıştırın.

Tekrarlayıcı bir pipet kullanarak, polistiren plakanın tüm kuyucuklarına DTT ile birlikte ONPG veya CPRG içeren 200 µL LacZ tamponu ekleyin ve tüm kuyucukların 610 nm'deki optik yoğunluğunu bir plaka okuyucu kullanarak hemen ölçüp kaydedin. Ek plakalar için gerektiği şekilde tekrarlayın. Plakaları bir kapakla kapatın ve belirtilen süreler boyunca 30 °C'de inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandığında, plakaları inkübatörden çıkarın. Beta-galaktosidaz reaksiyonunu durdurmak için her bir kuyucuğa tekrarlayıcı pipet kullanarak 100 µL sodyum karbonat ekleyin. Bir plaka spektrofotometresi kullanarak tüm kuyucukların optik yoğunluğunu, ONPG için 405 nm veya CPRG için 574 nm'de ölçün ve kaydedin.

LacZ değerlerinin hesaplaması, Java kurulumu gerektiren otomatik bir uygulama kullanılarak yapılabilir. Başlamak için, ek bir'de açıklanan LacZ otomatik uygulamasını açın. Şekil bir'de gösterilenle aynı plaka düzenini kullanarak, tüm kuyucukların ONPG için 405 nanometre veya CPRG için 574 nanometredeki optik yoğunluk okumalarını yapıştırın.

Analizin renk üretmesi için gereken inkübasyon süresini ve saat miktarını girin ve İleri'ye tıklayın. Tüm kuyucuklar için 610 nanometredeki optik yoğunluk okumalarını yapıştırın. LacZ sonuçlarını görüntülemek için Gönder'e tıklayın.

LacZ sonuçları klavye komutları kullanılarak kopyalanabilir ve gerektiğinde bir hesap çizelgesine veya diğer dosyalara yapıştırılabilir. Bu analize, çevrimiçi YES deneyi veri analiz uygulamasını açarak başlayın. İlk sekmede açıklandığı şekilde formatlanmış bir CSV veri dosyasını yükleyin.

İkinci sekmedeki estradiol standart eğrisini dijitalleştirin ve regresyon parametrelerini tahmin edin. Üçüncü sekmedeki regresyon modeli çıktılarını görüntüleyin ve ardından dördüncü sekmedeki örneklerin LacZ değerlerine karşılık gelen interpolasyon yapılmış x-ekseni değerlerini bulun. Örneklerin östrojen eşdeğeri veya EEQ değerlerini görmek için beşinci sekmeye tıklayın.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde, EEQ değerlerini orijinal örnek kütlesine göre standardize edin. Gösterilenler, mayanın 17 beta-estradiol ile 17 saatlik inkübasyonundan sonraki standart eğri örnekleridir. Makalede tartışılan nedenlerden dolayı, CPRG genellikle ONPG'den daha iyi bir substrat seçeneğidir.

Önceki gözlemlerle uyumlu olarak, ER Beta eksprese eden mayalarla yapılan analizler, ER Alpha eksprese eden mayalarla yapılan analizlerden on kattan fazla daha hassastı. Bu nedenle, östrojenik aktivite ER Beta eksprese eden mayalarla daha sık tespit edildi. Çalışmanın ek bir amacı, lisans laboratuvar dersi programıyla uyumlu inkübasyon sürelerini test etmekti.

17 saatlik inkübasyon sonrası altı günlük bir soğutma süresi uygulandığında, soğutulmuş plakalardan elde edilen standart eğriler, soğutulmamış plakalardan elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzeydeydi. Dört parametreli lojistik regresyon modelleri kullanılarak tahmin edilen parametrelerin standart hataları, soğutulmuş plakalar için soğutulmamış plakalara göre daha düşüktü. Bu nedenle, plakaların altı gün boyunca soğutulması hatayı azaltmakta ve EEQ tahminlerinin doğruluğunu artırmaktadır.

Bu teknikten yeterince deneyim kazanıldıktan sonra, işlem iki adet üç ila dört saatlik seansta tamamlanabilir. Prosedürü uygularken, 17 saatlik inkübasyon süresinden önce gerçekleştirilen tüm adımlarda steril teknik uygulamayı hatırlamak, dikkatli ve doğru pipetleme yapmak ve şekil 1'de sunulan plaka düzenini takip etmek önemlidir. Bu prosedürün ardından, östrojenik etkinin ek mekanizmalarını ve tüm organizma üzerindeki etkilerini araştırmak için in-vivo hayvan deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından maya östrojen taraması; gıda, bitki dokuları ve kişisel bakım ürünleri gibi çevresel örneklerdeki östrojenik ligandları ölçmek için düşük maliyetli bir yöntem olarak kabul görmüştür. Bu videoyu izledikten sonra kişisel bakım ürünlerinden basit ekstraksiyonların nasıl yapılacağı, mayanın nasıl kültüre edileceği, standart dilüsyon eğrilerinin nasıl hazırlanacağı, 96 kuyucuklu plakada YES analizinin nasıl yürütüleceği ve ilgili hesaplamaların nasıl tamamlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Estradiol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipmanların kullanımı ile uygun bertarafın sağlanması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.