Beyin Ekstraselüler Alanının Hacim Fraksiyonu ve Kıvrımını Nicelleştirmek için Tetrametilamonyum ile Gerçek Zamanlı İyontoforez

Bu prosedürün genel amacı, beyin dokusundaki hücre dışı boşluğun hacim, fraksiyon ve kıvrımlılığını ölçmektir. Bu yöntem, hücre dışı boşluk ile fizyoloji ve hastalık arasındaki ilişkiye ilişkin temel soruları yanıtlar. Bu tekniğin temel avantajı, hücre dışı boşluğun iki önemli parametresinin gerçek zamanlı karakterizasyonuna izin vermesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, iyontoforetik mikroelektrotun deneyler sırasında özelliklerini değiştirme eğilimi göstermesi ve deneyler sırasında sıklıkla sorun giderme gerektirmesi nedeniyle mücadele edecektir. Başarılı bir kayıt elde etmek için iyon seçici bir mikroelektrotun, bir iyontoforetik elektrotun birden fazla adımda hassas bir şekilde manipüle edilmesi gerektiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu işleme başlamak için, tetrametilamonyum veya TMA içeren ACSF'yi daldırma odasından dakikada iki mililitre hızla geçirin.

Sıcaklık kontrol cihazını istenen bir sıcaklığa ayarlayın ve deney süresince ACSF'yi %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürtün. Ardından, toprak elektrodunu bir tutucuya monte edin ve ucunu daldırma odasından geçen ACSF'ye daldırın. Daha sonra gözenekli kabı daha önce hazırlanmış %0.3 agaroz içeren TMA ile doldurun ve daldırma odasına yerleştirin.

Şimdi, bir mikromanipülatörün pipet tutucusuna bir iyontoforez mikroelektrodu sabitleyin. İyontoforez mikroelektrot telini iyontoforez ünitesinin baş aşamasına bağlayın. Ardından, kalibre edilmiş bir ISM'yi ikinci mikromanipülatöre sabitleyin ve ISM'yi baş aşamalarına bağlayın.

Daha sonra Wanda ve Walter programlarının bulunduğu bilgisayarı açın. Wanda GUI'de Kalibre Et'e tıklayın. Ardından, Kalibrasyon kutusunda, ISM kalibrasyonu sırasında ölçülen voltajları doldurun ve Verileri Sığdır'a tıklayın.

Bunu takiben, tıklayın Kabul etmek içinde Kalibre et Oluşturulan eğimi ve paraziti otomatik olarak ana GUI'ye aktarmak için kutu. GUI'nin sol tarafında, tüm deneysel parametrelerin ilgili girişlerde ayarlandığından emin olun. Ardından, agar kabına bir sıcaklık probu yerleştirin.

Ölçülen sıcaklığı, GUI'nin Ölçüm Elektrodu kutusundaki Sıcaklık girişine kaydedin. Ardından, mikroelektrotları agarozun en az 1.000 mikrometre derinliğine indirin ve kabın içinde ortalayın. 10X objektif kullanarak bunları mikroskop altında görselleştirin.

İki kanallı amplifikatörde, referans ve ISM kanalları arasında çıkarmayı ayarlamak için ISM kanal konektörünü manuel olarak voltaj çıkarma çıkışına getirin. Uçları üç yönlü eksende de birbirinin üzerine ortalayın. Ardından, mikromanipülatör kontrol kutuları üzerindeki her iki mikroelektrotun göreceli konumlarını sıfırlayın ve mikroelektrotların doğru ve hassas bir şekilde ortalandığından emin olun.

Ardından, ISM 120 mikrometreyi iyontoforez mikroelektrodundan bir eksende uzaklaştırın. Ardından, GUI'de Al'a tıklayarak bir kayıt başlatın ve programın tam bir kayıt için çalışmasına izin verin. Bu prosedürde, bilgisayarda Walter programını açın.

Zero Records From (Şuradan Sıfır Kayıt) menüsünde, Wanda tarafından oluşturulan kayıtları okumak için Wanda Voltoro düğmesine tıklayın. Bir sonraki açılır pencerede, okunacak bir veya daha fazla kaydı seçin ve Aç'a tıklayın. One Write Excel menüsünde, Sayfa 1.3'e tıklayın ve kayıtların grafiği otomatik olarak çizilene kadar istemleri izleyin.

Montaj prosedürüne başlamak için, İki Seçenek menüsünde, kayıt seç düğmesine tıklayın. Ardından, şekil iki açılır penceresinde, artı işaretlerini işlenecek ilk kaydın üzerine getirmek için fareyi kullanın ve kaydı seçmek için farenin herhangi bir düğmesine basın. Bundan sonra, menüdeki fit eğrisine tıklayın ve verilerin doğru bir şekilde oturmasını sağlamak için en az 20 uydurma yinelemesi kullanın.

Ardından, tüm veri noktalarını sığdırmak için tümünü seçin ve devam'ı seçin. Program görüntülenen eğriye uyacaktır. Ardından, yedi sonuç menüsünde Excel'i tıklatarak sonucu uygun elektronik tablo programına yazma seçeneğini belirleyin.

Excel dosyasına bir ad verin. İyontoforez mikroelektrodunun işlevselliğini belirlemek için kullanılacak olan üretilen verileri not edin ve kaydedin. İyontoforez mikroelektrodu deney için uygun görülürse, Wanda GUI'deki TransportNum uç alanındaki tüm denemelerden elde edilen ortalama taşıma sayısını kaydedin.

Bu prosedürde, kayıt odasına 400 mikrometre kalınlığında bir beyin dilimi yerleştirin ve akan ACSF'ye tamamen daldırıldığından emin olun. Ardından, hem iyontoforez mikroelektrodunu hem de ISM'yi beyin dilimindeki ilgi alanının üzerine taşıyın. Her iki elektrotu da akan ACSF'ye, ancak dilimin üzerine daldırın.

Ardından, hem referans hem de iyon algılama kanallarının voltajını sıfır milivolta ayarlayın. Her iki kanaldaki voltajın stabilize olmasını bekleyin. Grafik kaydedicide, ISM'nin iyon algılama kanalında ölçülen voltajı işaretleyin.

Ardından, ISM ve iyontoforez mikroelektrotlarını dilimin 200 mikrometre derinliğine ve birbirinden 120 mikrometre uzağa yerleştirin. Akan ACSF'de ve beyinde ölçülen TMA sinyalleri arasındaki voltaj farkını hesaplayın ve bu değeri Wanda GUI'nin Ölçüm Elektrodu kutusundaki Temel Volt Milivolt alanına girin. GUI'nin sol tarafında, tüm deneysel parametrelerin doğru girildiğinden emin olun.

Tıkla kaydı başlatın Satın almak ve tam bir kayıt almasına izin verin. Her iki mikroelektrotu da dilimden çıkardıktan sonra, şimdi ölçülen voltaj ile önceki ölçümü arasındaki herhangi bir değişikliği belirlemek için grafik kaydediciyi kullanın. Beyinden gelen kayıtları analiz etmek için, Walter programını kullanarak agaroz veri analizi prosedürlerini tekrarlayın.

Walter menüsünde Excel'i tıklatarak verileri elektronik tablo programına yazın. Ardından, beyin ECS'sinin hacim fraksiyonunu, beyin ECS'sinin kıvrımlılığını ve spesifik olmayan boşluğu kaydedin. Taşıma numarasını kontrol etmek için agarozda yeni kayıtlar alın ve taşıma numarasını almak için Walter programındaki prosedürleri tekrarlayın.

Elektronik tabloyu inceleyin ve taşıma numarasının, beyin ölçümlerinden önce elde edilen taşıma numarasından %10'dan fazla değişip değişmediğini kontrol edin. Eğer öyleyse, iyontoforetik mikroelektrot ile elde edilen veriler güvenilir değildir. Bu adımda ölçülen taşıma numarası, beyin ölçümlerinden önce elde edilenle yakından eşleşmelidir, aksi takdirde hacim fraksiyonu doğru olarak kabul edilemez.

Wanda Kalibrasyonu kutusunda girdi olarak yeni elde edilen ISM kalibrasyon verilerini kullanın ve eğim değerinin önceki kalibrasyondan %10'dan daha az farklı olup olmadığını kontrol edin. Burada gösterilen, agarda elde edilen ve TMA'nın konsantrasyon eğrisini gösteren tek bir denemeden elde edilen temsili verilerdir. Ve bu, Walter'daki veri işlemeden elde edilen uygun bir eğridir.

Takılan eğrideki verilerin örtüşmesi, Walter tarafından yapılan eğri uydurmanın bu denemede difüzyonu doğru bir şekilde modellediğini göstermektedir. İşte beyinde deney yapmadan önce agar ölçümlerinin tablosu. İşte kontrol ve deneysel koşullar altında bir fare beyin diliminde alınan ölçümlerin bir özeti.

Hipoosmolar bir zorluk sırasında alfa azalırken, kıvrımlılık beklendiği gibi arttı. Alfa, geri kazanım koşullarında kontrol değerlerini aştı. Ve işte beyinde yapılan deneylerden sonra yapılan agra ölçümlerinin tablosu.

Deneyden önceki ve sonraki ortalama taşıma sayıları birbirlerinin %10'u içindeydi ve bu da beyinde kaydedilen değerlerin güvenilir olduğunu gösteriyordu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür iki gün boyunca 14 saat içinde gerçekleştirilebilir. Birinci gün, BGY'ler üretilir ve kalibre edilir.

İkinci günde, ISM'ler yeniden kalibre edilir ve gerçek zamanlı iyontoforez gerçekleştirilir. Bu prosedürü denerken, öncelikle elektrotlarınızın aralıklarında kesin olmak önemlidir. İkinci olarak, bir deneyi yalnızca iyontoforetik mikroelektrotun taşıma sayısı deney boyunca sabit kalırsa kabul etmek önemlidir.

Hücre dışı boşlukta küçük katyonların difüzyonunu karakterize eden bu prosedürü takiben, hücre dışı boşlukta büyük mikromoleküllerin nasıl hareket ettiği sorusuna cevap vermenizi sağlayan bütünleştirici optik görüntüleme yöntemi gibi diğer teknikleri uygulamaya devam edebilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, sağlık ve hastalıkta canlı beyinde beyin hücre dışı boşluk hacmini ve kıvrımlılığını ölçmek için gerçek zamanlı iyontoforez yönteminin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.