Biyotiplerin Bakımında ve Türevinde Kullanılan Laboratuvar Teknikleri Klinik ve Çevresel İzolatlar

Bu tekniğin genel amacı, yürütülmesi basit olan ve herhangi bir araştırmacının Vibrio cholerae'nin belirli bir klinik veya çevresel izolatını karakterize etmesine yardımcı olabilecek bir protokol koleksiyonu sağlamaktır. Bu yöntem, herhangi bir Vibrio cholerae izolatının spesifik genotipik ve fenotipik özellikleri, özellikle de klinik önemi olanlar gibi bakteriyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, herhangi bir araştırmacının klinik veya çevresel Vibrio cholerae izolatlarını güvenilir bir şekilde karakterize etmek ve ayırt etmek için bu tahlil koleksiyonunu kullanmasına izin vermesidir.

Birlikte, bu tahliller, alternatif olarak veya maliyetli emek yoğun deneylere ve Vibrio cholerae klinik ve çevresel izolatlarının karakterizasyonuna ek olarak kullanılmak üzere sistematik bir yaklaşım sağlar. Bu yöntem, Vibrio cholerae biyotiplerinin karakterizasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer enterik bakterilerin biyokimyasal ve metabolik yeteneklerini karakterize etmek için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, en iyi sonuçları elde etmek için gerekli inkübasyon süreleri biyokimyasal tahliller arasında farklılık gösterdiğinden, zaman yönetimi ile mücadele edeceklerdir.

Lekelenme ve bıçaklama protokollerinin görsel gösterimleri kritik öneme sahiptir, çünkü sıçrama genellikle çapraz kontaminasyona yol açabilir ve kültürler arasında birleşmeyi önlemek için maksimum boşluk gereklidir. Steril 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde en az 8.600 xG'de santrifüjleme ile iki dakika boyunca 1.8 mL sıvı gece kültürünü peletleyerek protokole başlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini pipetleme yoluyla 900 mcL taze Luria-Bertani veya LB suyunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, kültüre 900 mcL steril %60 hacim-hacim gliserol ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. Karışımı steril 2 mL'lik bir kriyojenik tüpe aktarın ve stok kültürünü 80 santigrat derecede saklayın. Stoğu steril bir aşılama halkası ile kullanmak için, az miktarda donmuş stoğu çıkarın ve LB agar plakaları üzerinde tek koloniler elde etmek için bakterileri çizgileyin.

Kültürlerin tamamen çözülmesini önlemek için donmuş stoğu kullanımdan hemen sonra 80 santigrat dereceye geri koyun. Plakaları kapak tarafı aşağı bakacak şekilde 37 santigrat derecede 12-16 saat inkübe edin. Önceden hazırlanmış plakayı edinin.

4 mL sıvı LB suyunu steril 10 mL'lik bir kültür tüpüne tek bir koloni ile aşılayın, tek bir koloninin yüzeyine sterilize edilmiş bir halka ile dokunun ve koloniyi sıvı et suyuna aktarın. Daha sonra, kültürü 37 santigrat derecede 12-16 saat boyunca 225 rpm'de bir çalkalayıcı inkübatörde havalandırma ile inkübe edin. Gece boyunca kültürü sıvı LB suyunda hazırlayın.

Ertesi gün, kültürü peletleyin ve hücre peletini 1.8 mL 1x fosfat tamponlu salin veya PBS içinde yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Üçüncü yıkamayı 1.8 mL 1x PBS'de son bir yeniden süspansiyon ile takip edin.

Ardından, ilgili ortamda 1 mcL yıkanmış kültürü tespit etmek için bir pipet ucu kullanın. Gece boyunca kültürden elde edilen hücre peletini yıkayın. Yıkanmış sıvı kültüre bir aşı bıçağı sokarak motilite agar plakalarını aşılayın ve ortama dikey olarak bıçaklayın.

Agarı bıçaklarken aşılama bıçağının bükülmediğinden emin olun. Her aşılama arasında, bir Bunsen brülörü kullanarak tel bıçağı sterilize edin. Plakaları kapak tarafı yukarı bakacak şekilde 37 santigrat derecede 14-24 saat inkübe edin.

14 saat sonra, kültürlerin aşırı büyümesini önlemek için motilite plakalarını yakından izleyin. Önceden hazırlanmış gece kültüründen 10 mcL'yi steril bir kültür tüpünde 4 mL MR-VP suyuna pipetleyerek 4 mL Metil Kırmızı Voges-Proskauer veya MR-VP suyunu aşılayın ve 37 santigrat derecede 12-16 saat boyunca 225 rpm'de bir çalkalayıcı inkübatörde havalandırma ile inkübe edin. Daha sonra, steril kültür tüplerinde MR-VP gece kültürünün 1 mL alikotlarına sırasıyla 1 mcL Alfa-naftol hacmi başına %5 ağırlık ve hacim başına 50 mcL %40 ağırlık potasyum hidroksit ekleyin.

Ardından, tüpleri kısaca girdaplayın. Renk değişimi oluşana kadar tüplerin oda sıcaklığında dört saate kadar beklemesine izin verin. Biyotip referans suşları ve temsili El Tor varyantları, V.Cholerae klinik ve çevresel izolatlarının biyotip arka planlarını ayırt etmek için PCR baz genetik taramalarına ve fenotipik testlere dahil edildi.

Vahşi tip klasik O395, klasik ctxB ve tcpA sekanslarını gösterdi. Tersine, vahşi tip El Tor suşları N16961 ve C6706, El Tor ctxB ve tcpA dizilerini gösterdi. MQ1795 ve BAA-2163, 0395 ile karşılaştırılabilir klasik biyotip ctxB alt birimini içerir.

Yine de her iki El Tor varyantı, El Tor biyotip arka planının göstergesi olan tcpA'yı içeriyordu. Polimiksin B ile takviye edilmiş LB agar plakaları üzerinde büyütüldüğünde, vahşi tip klasik biyotip suşu 0395, polimiksin B'ye duyarlılık gösterirken, vahşi tip El Tor biyotip suşu direnç gösterdi. Temsili El Tor varyant suşları, antibiyotiğe benzer direnç gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, bu makalede özetlenen çoklu tahlil tanımlama sistemini kullanarak Vibrio cholerae biyotiplerini nasıl ayırt edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. BSL-2 patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve tüm malzemelerin ve atık ürünlerin uygun şekilde taşınması ve bertaraf edilmesinin kurumsal, yerel, eyalet ve federal düzenlemelere göre uygulanması gerektiğini unutmayın. Bu yazıda listelenen protokollere ek olarak, Vibrio cholerae izolatlarının daha fazla karakterizasyonu, biyofilm oluşumu ve otoaglütinasyon gibi diğer fenotipik özelliklerin araştırılmasıyla elde edilebilir.