İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Bu prosedürün genel amacı, proteomik analiz için uygun olan insan kardiyak mitral kapağından proteinleri verimli bir şekilde çıkarmaktır. Bu yöntem, kalp kapak hastalığı alanındaki patojenik mekanizmaların ortaya çıkarılmasına potansiyel olarak yardımcı olabilir, yeni tanısal ve prognostik hastalık belirteçlerinin ve umarım terapötik hedeflerin tanımlanmasına olanak tanır. Bu protokolün temel avantajı, birçok analitik uygulama ile uyumlu verimli bir ekstraksiyon iş akışı sağlamasıdır.

Sonuçlar, kardiyak mitral kapak proteumunun daha kapsamlı bir karakterizasyonudur. Ayrıca, bu protokol, insan kapağına yakın bir benzerlik gösteren ve kapak fonksiyonu değerlendirmeleri için deneysel modelde kullanılan domuz mitral kapağı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Deneysel prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Stefania Ghilardi olacak.

İnsan mitral kapağını hazırlamak için, dört ila 12 saat boyunca soğuk iskemi altında olan ekilmiş bir kalple başlayın. Temiz odada, kalbi taşıma çantasından çıkarın ve sterilize edilmiş bir kovaya koyun. Ardından, kalbi bir biyogüvenlik kabinine aktarın.

Orada, tek kullanımlık bir neşter kullanarak, sol ve sağ ventriküller seviyesinde, tepeden yaklaşık dört santimetre uzakta, ana eksene dik olarak kesin. Ardından kalbi steril bir örtünün üzerine yerleştirin. Ardından, sol atriyal çatıya erişmek için yükselen aort ve pulmoner arteri kenara çekin.

Sol atriyal çatıda, mitral kapağı ortaya çıkarmak için sol kulak kepçesinin etrafını kesmek için forseps ve pena kullanın. Mitral kapak tamamen sol ventrikülde bulunur. Böylece, büyük mitral broşürü ve küçük mitral broşürü ortaya çıkarın.

Anterolateral ve posteromedial komissürler, anterior ve posterior alanın boarderini tanımlar. Şimdi, makas ve travmatik olmayan forsepslerle sol atriyum ve mitral kapağı çevreleyen ventrikül duvar kalınlığını inceleyin. Bu diseksiyon sırasında mitral aort kapak sürekliliğini tanımlayın.

Daha sonra, posterior broşürü kaplayan komissürleri keserek anterior mitral kapak broşürünü posterior mitral kapak broşüründen ayırın. Prosedür tamamlandığında, kabinin masasını %70 izopropil alkol solüsyonu ve %6 hidrojen peroksit solüsyonu ile sterilize edin. Şimdi, mitral kapağın arka broşürünü tuzlu suyla yıkayın.

Ardından, valfi her biri bir santimetre kareden daha az olan küçük parçalar halinde kesin. Parçaları tek tek alüminyum folyoya sarın ve sıvı nitrojen ile dondurun. Protein ekstraksiyonuna başlamak için, sıvı nitrojenden bir numuneyi çıkarmak için forseps kullanın ve hemen kuru buzun üzerine yerleştirin.

Numunenin çözülmesine izin vermeyin. Ardından, sıvı nitrojenle doldurulmuş bir dewar şişesine harcı, ilgili havaneli ve numuneyi yerleştirin. Numuneyi dondurmak ve öğütücü sistemini soğutmak için sıvı nitrojenin kullanılması çok önemlidir.

Bu adım biyolojik bozulmayı önler ve verimli tozlamaya izin verir, ancak güvenli kullanım için teknik eğitim gerektirir. Flaş donduktan sonra, havan ve havan tokmaklarını kuru buz içeren polistiren bir kutuya koyun. Ayrıca kuru buzun üzerine bir spatula yerleştirin.

Ardından, numuneyi folyodan çıkarın ve harcın içine yükleyin. Ve daha büyük havaneli üzerine yerleştirin. Havaneli döndürmek için bir tornavida kullanarak numuneyi 15 ila 20 kez öğütün.

Öğütme sırasında, numuneyi soğutulmuş bir spatulanın ucuyla karıştırın. Büyük havaneli kullandıktan sonra daha küçük bir havaneli ile öğütme işlemini tekrarlayın. İnce bir toz elde etmek, verimli protein ekstraksiyonu için kritik öneme sahiptir.

Şimdi, toz haline getirilmiş numuneyi, kütlesi bilinen 15 milileter bir santrifüj tüpüne boşaltın. Daha sonra kalan malzemeyi soğuk bir spatula kullanarak harcın içine fırçalayın. Numunenin bulunduğu tüpü kuru buz üzerinde tutun ve numunenin kütlesini hızlı bir şekilde belirleyin.

Ardından, numuneyi bir cam homojenizatör tüpüne boşaltın. Ardından, her 10 miligram numune için 200 mikrolitre üre tamponu ekleyin. Bunu yaparken, tüpte kalan kalıntıları üre tamponu alikotu ile durulayarak geri kazanın.

Şimdi numuneyi 1.500 rpm'de çalışan motorlu bir PFTE havaneli kullanarak homojenize edin. Havaneli 10 kez döndürme hareketiyle numunenin üzerine yavaşça bastırın. Ardından, viskoz sarı süpernatanı bir cam pipet kullanarak temiz bir 1.7 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Şimdi kalan numune üzerinde yarısı kadar üre kullanarak homojenizasyonu tekrarlayın. Süpernatanı kurtarın ve önceki koleksiyonla birleştirin. Ardından, tüpü 30 dakika boyunca bir tüp döndürücüye yerleştirin.

30 dakika sonra, tüpü soğuk bir santrifüje yükleyin ve numuneyi yarım saat boyunca 13.000 G'de döndürün. Ardından, süpernatanı kurtarın. Ve Bradford protein tahlilini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

Öngörülen protokolü uyguladıktan sonra, protein ekstraktı bazı ek tedavilerden sonra çeşitli yöntemler kullanılarak incelenmiştir. Mitral kapak dokusunda iki boyutlu elektroforez, sıvı faz izoelektrik odaklama, sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi ve 2D sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi ile toplam 422 protein tanımlandı. 422 protein, Gen Ontolojisi analizi kullanılarak sınıflandırıldı.

Hücre dışı bölgeler, beklenen birkaç proteini ve diğer hücre içi ve hücre yüzeyi proteinlerini içeriyordu. Bunların birçoğu ilk kez mitral kapaklarda tanımlandı. Mitral kapaklarda daha önce tanımlanmayan bu tür dört proteinin varlığı, üç benzersiz numunedeki antikorlarla doğrulandı.

Proteinler Septin-11, Dört buçuk LIM alanı protein bir, Dermatoponin ve alfa kristalin B'dir.Bu videoyu izledikten sonra, proteinlerin tanımlanması ve niceliklerinin belirlenmesi için kardiyak mitral kapaktan nasıl çıkarılacağını iyi anlamalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol uygun şekilde gerçekleştirilirse neredeyse iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yüksek protein bütünlüğüne sahip proteinlerden en yüksek verimi elde etmek için, numunelerin herhangi bir transfer sırasında çözülmemesi hayati önem taşır.