Name: Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Keşfedin, hücre içi sinyal iletimini upconversion nanopartikül aracılı kinaz fotoaktivasyonuyla uzaktan tetiklemeyi. Bu yöntem, fototoksisite olmadan canlı hücrelerde enzim aktivasyonu sağlar ve onkojenezdeki sinyal yollarını incelemek için güvenli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Nano bilim ve teknoloji programı Academia Sinica ve Bilim Bakanlığı ve Tayvan teknoloji finansman için (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) teşekkür ederim.

Not: detaylı alt yapısı değiştirilmek üzere upconversion destekli photoactivation protokolünü açıklar, sentetik bir yordam oluşturmak için PKA-UCNP, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) silis kaplı UCNP Kafesli ve PKA-UCNP örnekleri, UV ve Nur photolysis Kur, hücre hazırlık, PKA-UCNP mikroenjeksiyon, photoactivation çalışma ve stres fiber REF52 hücreleri boyama Kafesli.
 1. Fluorimeter Kur Upconversion spektrum ölçümü için <ol><li>lazer küvet orta üzerinde odaklanmıştır Floresans Spektrometre küvet sahibinin yanında 4 X objektif lens yükleyin.</li>
	<li>Yer tunable 0,5 - 8 W 980 nm lazer diyot karşı objektif lens 90°. 
	Dikkat: Operatör lazer Emanet bilgiye sahip ve NIR lazer gözlük giymek gerekiyor.</li>
	<li>Tam Yansıma ayna objektif lens ve lazer ışık yolu kavşak yükleyin. Bir siyah anodize metal plaka spektroskopisi uyarma pencerenin engellemek için ve iç parçaları korumak için yerleştirin.</li>
	<li>Bir parlak upconversion ışın görüntülenmeyecektir ve ayna yükleme için en iyi ışık hizalamayı ayarlamak için kullanılabilecek şekilde yer silis kaplı UCNP çözüm (0.2 - 0.6 mg/mL) küvet küvet tutucu içinde.</li>
	<li>Düşük Devresel_ödeme voltaj ayar moduyla ışıldama spektroskopisi geçin (sinyal çok zayıf ise bir daha yüksek ayarı ayarlayın). Aynaya burada ışın küvet orta ve Devresel ödeme en güçlü sinyali alır en iyi hizalama ayarlamak.</li>
	<li>İstenen güç ayarı ile uyum sonra upconversion spektrum ölçmek. Bir termal kazık güç ölçüm kalibrasyon eğrisi üzerinde lazer güç kaynağı elektrik geçerli okumaya karşı lazer güç oluşturmak için kullanın. Sürekli lazer performans performans kalibre edilmiş Aralık içinde olduğundan emin olmak için kontrol edin.</li>
</ol> 2. Mikroskop kurulum Not: aşağıdaki Kurulum mikroskoplar iki katmanlı optik yol ile donatılmış için çalışır. Kullanıcı bir uyarma ışık kaynağı anahtarı NIR lazer ve aynı bağlantı noktasını paylaşan halide lamba yapmak için geri limanda yüklemeye çalışırsa, örnek Isıtma azaltmak için tasarlandığından Kolimatör arka limanda önemli ölçüde NIR engeller. Kullanıcı zor bir seçim yapmak zorundadır: Kolimatör aklında bulunsun ve çok düşük upconversion verimlilik acı veya Kolimatör kaldırmak ve uyarma için epifluorescence ışık yoğunluğunu kurban.
 Not: ışık yolunu düzeni değiştirilmiş spectrofluorometer mikroskobu upconversion ışıma ve Nur photolysis modu ve epifluorescence ve UV photolysis modu ve deneysel kurulum için gösteren bir kesit diyagram Bu deneme için kullanılan Şekil 2 ' de gösterilmiştir.
<ol><li>Equip Floresans mikroskobu ile metal halide ışık Kılavuzu, arkasına yönetmen limanda 
	Not: Bu yoldaki üst katmanlı hafif olduğu yerde bir küp taret, bir küp konum alt katmanı ışık yolu gelen NIR için izin vermek için boş olması gerekir</li>
	<li>Açık yan-port kolimatör ile sağdaki Port bir akort 8,0 0,5 W 980 nm lazer diyot yükleyin. 
	Not: 10 X objektif lens kullanıldığında bu lazer ışık spot için yaklaşık 500 µm çapında büyütür. Bu Kolimatör kaldırma bir mikrometre menzilli hafif yerinde olur ve NIR hücre ışınlama pratik yapar. Bu Kolimatör NIR-saydamdır.</li>
	<li>Dikroik ayna (850-nm kısa-pass) ve alt katmanı ışık yolunu bir uyarma filtresi (950 nm uzun-pass) yüklemek</li>
	<li>Bir UCNP çözüm Nur ışık spot görselleştirmek için kullanın. Lazer NIR hizalama bitirmek için görüş alanı içinde ışık demeti ortalamak için konumunu ayarlamak.</li>
</ol> 3. Hazırlanması ve karakterizasyonu, Kafesli PKA-UCNP inşa <ol><li>Incubate rekombinant PKA (9 µM) ile 0,5 mM 2-1-2 h 25 için arabellek (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl ve 10 mM MgCl 2; pH 8,5) caging içinde nitrobenzylbromide (NBB) ° C. yavaşlaması 10 mM dthiothreitol (DTT) ile aşırı NBB ve sonra karşı 4-(2-hydroxyethyl) diyaliz piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) arabellek (10 mM, pH 7.5) aşırı reaktifler ve tuzları kaldırmak için. 
	Not: Caging çözüm pH 8.5 için 7,5 HEPES pH 7.5 için sonraki immobilizasyon tepki ile diyaliz sırasında indirilir.</li>
	<li>Mix lanthanide tuzları-Y(CH3CO2) 3 hidrat (% 99.9, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hidrat (% 99.9, 0.2533 g, 0.60 mmol) ve Tm (CH 3 CO 2) 3 hidrat (% 99.9, 0.0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) ve oleik asit (12 mL), 115 ° C 30 dk için karışım ısı ve onları 50 ° c için serin Daha sonra methanolic bir çözüm (20 mL) 0.2 g (5.0 mmol) tepki karışımı NaOH Pelet dağıtılması ve 0.2964 g (8 mmol) sonication 15 dakika süreyle tarafından amonyum florür artırmak reaksiyon ısısı UCNP çekirdeği (β-NaYF 4 almak için 300 ° c : %1.0 Tm 3 + / %30 Yb 3 +) nano tanecikleri.</li>
	<li>Çekirdek nano tanecikleri (25 mg) CO-520 (0.5 mL) ile Siklokekzan (10 mL) içinde çözülür. Amonyak (wt % 30 v/v, 0,08 mL) ve tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) ekleyin ve oda sıcaklığında silis kaplı β-NaYF 4 12 h için sürekli karıştırmaya uygulayın: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + çekirdek nano tanecikleri.</li>
	<li>PKA kuluçkaya (6 nmol) veya PKA Kafesli (6 nmol) ile UCNP (1 mg) 15 PKA Elektrostatik etkileşimler yoluyla UCNP silika kaplı üzerinde hareketsiz 3 h için 4 ° C'de HEPES tampon (10 mM, pH 7.5).</li>
	<li>PVDF filtre (0,45 µm), 4 ° C'de 10 dakika için 17.000 x g, santrifüj kullanarak karışımı filtre ve Pelet HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) kapsayan %0,1 protein sabitleyici arıtılmış PKA-UCNP kompleksi elde etmek için yapılan redisperse. Santrifüj kapasitesi 17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika ve süpernatant 1.5 mL tüp içinde Bradford tahlil için toplamak.</li>
	<li>Analiz UCNP parçacıklar PKA ikame düzeyde geri hesaplamak için sınırsız PKA adım 3.5 Bradford tahlil ile kaydedilen süpernatant içinde hangi normalde sahip bir ikame düzeyde ~ PKA 4,5 nmol parçacık mg başına. 
	Not: Bradford tahlil granül, yüksek düzey ve istikrarlı protein immobilizasyon desorpsiyon olmadan öneriyor bir güçlü mavi renk ortaya çıkarır, süpernatant kısmını Kafesli iken PKA-UCNP çözüm bir renk benzer HEPES tampon () gösterir şekil 4 c-4e).</li>
</ol> 4. Karakterizasyonu Not: kinaz tahlil pyruvate kinaz belirli etkinliğini ölçmek için kullanılır. Kısacası, pyruvate kinaz ve laktat dehidrogenaz bağlandı, peptid, fosforilasyon NADH oksidasyon içinde sonuçlanır. İkinci oluşumu, NADH Absorbans 340 azalma ölçerek izlenir nm.
<ol><li>Belirleme etkinlik PKA ve PKA-UCNP 4-morpholinepropanesulfonic asit (BEZLERİ, 100 mM, pH 7.5), içeren tahlil karışımı 60 µL toplam birimindeki KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenozin trifosfat (ATP, 1 mM), β - Nikotinamid adenin dinükleotit, azaltılmış formu (NADH, 0.8 mM), magnezyum klorür (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0.4 mM) ve pyruvate kinaz/laktat dehidrogenaz karışımı (30/40 birim PK/karaciğer).</li>
	<li>NADH Absorbans PKA çözüm (2 µL) tahlil karışıma ilavesi sonra zamanla azalma ölçmek. Doğrudan ölçülen kinaz etkinliği yansıtmak üzere çizgisinin eğimini hesaplayın.</li>
	<li>PKA-UCNP 15 aktivite ve yerel PKA özel etkinlik ve hesaplanan PKA tutar kaplı yüzey çarpma ürün ile de uyumlu olması genel faaliyet ölçmek.</li>
</ol> 5. Photolysis kurulum <ol><li>banaışığın tüm gücü termal kazık sensör kullanarak kaynakları ve güç yoğunluğunu hesaplamak ure (PD = güç (W) / alan (cm 2)) 18 dayalı ışık spot alan üzerine.</li>
	<li>Bir 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15 ile ticari bir sistemde vitro UV photolysis deneyler yapmak.</li>
	<li>İçin UV photoactivation mikroskop sahnede aydınlatmak uyarma hafif ticari küp 15 tarafından filtre ile PKA-UCNP çözüm. 
	Not: Güç yoğunluğu objektif lens odak olmadan ~ 15 mW/cm 2 ' dir.</li>
	<li>Mikroskop sahnede vitro NIR photoactivation için özelleştirilmiş upconversion filtre/ayna ayarları alt katmanı ışık yolu üzerinde dikroik ayna (850 nm kısa-pass), yüklü ile 980 nm lazer kullanarak PKA-UCNP çözüm aydınlatmak ve bir uyarma filtresi (950 nm uzun-pass). 
	Not: 4 X objektif lens odaklanan önce 5 W/cm 2 çıkış güç yoğunluğu azalır. Güç yoğunluğu olduğu tahmin edilmektedir ~ 68 W/cm 2 4 X objektif lens odak sonra.</li>
</ol> 6. Numune hazırlama ve mikroenjeksiyon PKA-UCNP kompleksi hücre <ol><li>örnekler 0,45 µm filtreden PKA immobilizasyon (Adım 3.5) sonra ön filtre.</li>
	<li>Kuluçkaya L-15 Orta kuluçka makinesi dışında istikrarlı pH denetimi için mikroenjeksiyon döneminde bulunduğu hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS). 
	Not: mikroenjeksiyon tamamlama onaylamak için yerel PKA-UCNP, Kafesli PKA-UCNP veya pegile UCNP (7,5 mg/mL) 15 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine ile (TAMRA) Co enjekte (10 µM) içinde hücrelere.</li>
	Mikroenjeksiyon sonra sitozolik konsantrasyonu 1-3 mikron PKA - fizyolojik konsantrasyon aralığı PKA enjeksiyon Cilt 1/10 hücresel birimin varsayım ile bir hücre için öyle ki, konsantrasyon PKA-UCNP parçacıkların <li>ayarlamak .</li>
	<li>(Adım 6.2) hücreye mikroenjeksiyon gerçekleştirmek bir microinjector aygıtı kullanarak tek eksenli hidrolik micromanipulator ( şekil 3) ile birleştiğinde.</li>
	<li>Kullanmak microinjector tarafından uygulanan basınç izlemek için dijital bir basınç göstergesi çalışma aralığı (~ 50-200 inç) ve mikroenjeksiyon için tazminat basınç sağlamak için özelleştirilmiş bir baskı odası dağıtıcı valf mühür. Geri bir çektirmenin kullanarak İğneyi çek.</li>
	<li>200-300 ms ve kültür orta geri tepme iğne kılcal eylem tarafından önlemek için 15 inç tazminat basınçta bir enjeksiyon süresi ile 50 ila 75 hPa arasında enjeksiyon basıncı korumak.</li>
	<li>Bir dış çapı 40 x objektif lens ile fotoğraf çekmek tarafından onaylanabilir 1,3 ve 1,5 µm arasında olması için iğne ucu açıklıklar inceleyin.</li>
	<li>Yıkama 2 mL % 10 içeren L-15 Orta hücrelerle FBS mikroenjeksiyon sonra. Hücresel Floresans görüntüleme mikroenjeksiyon tamamlama onaylamak için 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamine (TAMRA) üzerinden gözlemlemek.</li>
</ol> 7. Photoactivation, Kafesli PKA-UCNP kullanarak UV veya Nur ışık yaşayan hücrelerde <ol><li>için UV photoactivation PKA-UCNP mikroenjeksiyon sonra 3,5 µm çanak üzerinde REF52 hücrelerin büyümesine, onları mikroskop sahnesinde yerini ve onlara göre filtre UV ışığıyla ışınlatayım küp için objektif lens odak olmadan 3 dak. 
	Not: confluency 2-3 günde 90 %'e ulaştığımızda hücrelerin % 10 içeren DMEM muhafaza REF52 FBS %5 CO 2 kuluçka ve hücreleri 37 ° C'de subcultured.</li>
	<li>İçin NIR photoactivation PKA-UCNP mikroenjeksiyon sonra aydınlatmak 980 nm lazer alt katmanı filtre/ayna ayarlardan hücrelerdeyse 5,4 adımda anlatıldığı gibi. 
	Not: Güç yoğunluğu çıkışı 10 X objektif lens odak 5 W/cm 2 öncedir ve 10 x objektif lens odak sonra 300 W/cm 2 olduğu tahmin edilmektedir. Upconversion yüksek foton yoğunluğu, özellikle büyük bir anti-Stoke kayma gerektiğinde gerektiren bir süreçtir. Bu nedenle, odaklanan photoactivation sırasında gereklidir.</li>
	Daha büyük bir ışık yer (650 µm x 520 µm) gerektiğinde, <li>Nur ile 15 dk. izin ver bir kolimatör ile 10 x objektif lens tarafından her 5 dk ışınlama sonra 5 dk karanlık aralığı için odaklı Isıtma önlemek için bu hücreleri ışınlatayım. 
	Not: bir yüksek uzaysal çözünürlüklü (hücre altı ışık spot) gerektiğinde, 40 X objektif lens ışık Kılavuzu çıkış sonunda yüklü bir iğne deliği ile bir hücre altı boyut ışık yer (5 µm x 4 µm) oluşturmak için kullanın. Bu durumda, 1 s radyoterapi NIR photoactivation fotonlar yüksek akı nedeniyle yeter.</li>
	<li>Sonra UV veya Nur photolysis, hücreleri 37 ° C'de kuluçka %5 CO 2 hücresel yanıt-e doğru oluşturmak için tam orta 1 h için yeniden elde etmek için izin verir. Daha sonra 1 ml % 4 paraformaldehyde/fosfat-tamponlu tuz (PBS) 20 dk için daha fazla boyama önce düzeltmek. 
	Dikkat: Paraformaldehyde çok zehirli olduğunu; Cilt, göz veya müköz membranlarda temasından kaçının. Ölçme ve hazırlık sırasında toz nefes kaçının.</li>
</ol> 8. Görselleştirme stres Fiber dağılmasına neden NIR Photoactivation yanında <ol><li>sonra fiksasyon, Alexa 594-phalloidin kullanın (boyama için PBS 200 µL için 5 µL 6.6 µM hisse senedi çözüm Ekle; oda sıcaklığında 25 min için kuluçkaya) leke ve stres lifleri görselleştirin. Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) görüntülerini bir filtre seti kullanarak görselleştirmek.</li>
	<li>4 5 min için hücreleri kuluçkaya &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oda sıcaklığında. Boyama sonra PBS ile örnekleri yıkama ve stres lifleri ve çekirdekleri floresan görüntülerini de ayrı ayrı vurmak.</li>
</ol>

<ol><li>Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Controlled+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Light-Controlled Tools.</a> Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).</li>
<li>Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+Chemistry+of+Life%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Applications+of+%22Caged%22+and+Related+Photoresponsive+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds.</a> ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).</li>
<li>Pavlovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Delivery+and+Photochemical+Release+of+a+Caged+Inositol-pyrophosphate+Induces+PH-domain+Translocation+in+Cellulo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo.</a> Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).</li>
<li>Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Wavelength+Photoactivation+of+cAMP-+and+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways.</a> ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).</li>
<li>Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+One-+and+Two-Photon+Uncaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA.</a> ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).</li>
<li>Warther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Uncaging%3A+New+Prospects+in+Neuroscience+and+Cellular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology.</a> Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).</li>
<li>Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+of+Confocal+and+Caging+Technologies%3A+Selective+Three-Color+Communication+with+Profluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters.</a> Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).</li>
<li>Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-selective+cleavage+of+photoprotecting+groups%3A+strategies+and+applications+in+dynamic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems.</a> Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).</li>
<li>Chien, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light+Photocontrolled+Targeting%2C+Bioimaging%2C+and+Chemotherapy+with+Caged+Upconversion+Nanoparticles+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).</li>
<li>Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light-Mediated+Photoactivation+of+a+Platinum+Antitumor+Prodrug+and+Simultaneous+Cellular+Apoptosis+Imaging+by+Upconversion-Luminescent+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).</li>
<li>Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR+Light+Controlled+Photorelease+of+siRNA+and+Its+Targeted+Intracellular+Delivery+Based+on+Upconversion+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).</li>
<li>Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+UV-Blocking+Polymer+Shell+Prevents+One-Photon+Photoreactions+while+Allowing+Multi-Photon+Processes+in+Encapsulated+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).</li>
<li>Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+Construction+of+Hollow+Upconversion+Nanoparticles+for+Protein+Harvesting+and+Near-Infrared+Light+Triggered+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release.</a> Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).</li>
<li>Gao, H. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Near-Infrared-Activatable+Enzyme+Platform+To+Remotely+Trigger+Intracellular+Signal+Transduction+Using+an+Upconversion+Nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle.</a> ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).</li>
<li>Wehbi, V. L., Taskén, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+for+cAMP-Mediated+Immunoregulation+in+T+cells+-+Role+of+Anchored+Protein+Kinase+A+Signaling+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Fluorescence+Approaches+Shed+Light+on+Intracellular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs.</a> Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).</li>
<li>Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep22433">Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect.</a> Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).</li>
<li>Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0014579388807816">Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells.</a> FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).</li>
<li>Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).</li>
<li>Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote-control+Photorelease+of+Caged+Compounds+Using+Near-infrared+Light+and+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).</li>
<li>Garcia, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR-triggered+Release+of+Caged+Nitric+Oxide+Using+Upconverting+Nanostructured+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials.</a> Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).</li>
<li>Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NIR-responsive+and+sugar-targeted+polypeptide+composite+nanomedicine+for+intracellular+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy.</a> Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Daha önce Hofmann ve iş arkadaşlarınızla dramatik morfolojik değişiklikler ücretsiz PKA19mikroenjeksiyon sonra REF52 hücrelerde gözlendi buldum. Başka bir çalışmada, Lawrence grup Kafesli PKA vivo içindeharekete geçirmek, morfolojik değişiklikler ve UV photolysis20' ye tabi ne zaman stres lifleri dağılması olabilir gösterdi. Daha önce upconverted UV ışığı birkaç UCNP destekli, kafes, küçük moleküler bioeffectors21,<sup class="xref...

Photoactivated (Örneğin, Kafesli PKA proteinler) olabilir kimyasal olarak değiştirilmiş proteinlerin kimyasal Biyolojide invaziv olmayan hücreler arası biyokimyasal süreçler1,2 işlemek için gelişmekte olan bir alanı olarak geliştirilmiştir ,3. Bunlar aktif hale getirildiğinde bir uyarıcı mükemmel kronolojik zamanmekansal çözünürlük sağlar gibi ışık kullanarak proteinler Kafesli. Ancak, UV ışığı istenmeyen morfolojik değişiklikler, Apoptozis ve DNA hasarı hücreleri4,5' e neden olabilir. Bu nedenle, tasarım son gelişmeler photocaging gruplarının photocleavage fototoksisite, de derin doku penetrasyonu6,7artırmak olarak azaltmak için dalga boyu daha uzun veya İki fotonlu uyarma üzerine etkinleştirme hakkında odaklan. Bioeffectors iki uzun dalgaboyu bize uygun uncaging dalga boylarında (Yani, kanalları) seçmek seçime bağlı olarak izin verdiği yanıt caging grupları etkinleştirmek veya mevcut7daha fazla caging gruplarıdır. Bu yararlı özellikleri göz önüne alındığında, yeni kırmızı ışık photocaging grupları ters yönde çalışmalarında çok önemli biyolojik araştırmalar reaksiyonlar hücresel aktiviteler8denetleme mekanizmalarının sondalama arasında değişen fotokimyasal yöntemleri geliştiriyor. Yine de, bir iki fotonlu caging normalde erimiş Aromatik halka yapısı nedeniyle çok hidrofobik grubudur ve görünür ışık caging ile aromatik ligandlar normalde Organometalik grubudur. Bu hidrofobik/aromatik özelliği etkinleştirme sitesi enzim/protein denatures ve fiil ve photolysis hala kimyasal düzeyde2 işe bile işlevi, kaybolmasına bioeffector bir protein veya enzim, ne zaman uygun değil ,9.
UCNPs Nur uyarma ışık UV için dönüştürmek etkili dönüştürücüler vardır. UCNPs bu benzersiz ve ilginç özelliği sorunları ele almak üzere gerçekçi kararlar photoactivation ile ilişkili ve kontrollü serbest bırakmak-in küçük moleküller, sisplatin türevleri11 folik asit10, dahil tetiklenen teklif etti , DNA/siRNA12, kopolimer veziküller13ve içi boş parçacıklar14. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde, proteinler ve enzimler UCNP destekli photoactivation defa test edilmemiştir. Kırmızı ışık veya NIR fotoaktif için bir enzim kullanarak başarılı bir dava yok çünkü biz kimyasal olarak değiştirilmiş Kafesli enzim kompleksi silis kaplı ile oluşan bir protein/enzim yapısı NIR tetiklemeli aktivasyonu gerçekleştirmek için istemde, UCNP15lanthanide katkılı. Bu çalışmada, UCNP bir hızla tepki sinyal iletim kinaz Kafesli PKA şeklinde ile Birleşik. PKA glikojen sentez ve siklik adenozin fosfat (kampı) yönetmelik sitozol16üzerinden dış uyaranlara yanıt hücre iskeleti düzenlenme denetler. Biz NIR ışınlama sonra hücresel bir deneyde zamansal ve mekansal davranış enzim harekete geçirmek fizibilite okudu. Bu photoactivation UCNP destekli platform photoactivate için yeni bir yöntem NIR kullanarak bir enzimdir ve geleneksel UV ışınlama2,4tarafından neden olduğu hücre istenmeyen sinyal iletim yanıtından önler.
Çok büyük bioeffectors translocate zordur (örneğin, proteinler) hücresel hareketlilik denetlemek için hücre zarı arasında. Parçacık immobilize protein endositoz ile sitozol translocate daha kolay olabilir, ancak endositoz bozulabilir veya endosomal tuzak ve bunun sonucunda lizozomal bozulması2,4yolu ile bozulmuş. Kafesli protein membran translocation sonra hala işlevsel olsa bile, translocated tutarları hücresel yanıt2,17tetiklemek için yeterli olmayabilir. Keskin aksine, mikroenjeksiyon büyük bioeffectors hücre sitoplazma için teslim etmek için bir doğrudan ve nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, UCNP etkisiz hale bioeffector upconverted ışık etkinleştirilmesini gerektirir. Bu nedenle, optik araçları daha fazla ölçmek, görselleştirmek ve upconversion ışık yararlanmak için değişiklik gerektirir. Bu çalışmada, kafese kapatılmış bir PKA-UCNP kompleksi teslim mikroenjeksiyon ve aşağıdaki temel spektroskopisi ve mikroskopi değişiklikleri için NIR photoactivation kullanarak bir hücreye ayrıntılı olarak açıklanır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Sigma</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>İtriyum asetat&nbsp; hidrat</td><td>Sigma</td><td>326046</td><td>Y(C<alt>2</alt>H<alt>3</alt>CO<alt>2</alt>)<alt>3</alt> ve orta nokta; xH<alt>2</alt>O</td></tr><tr><td>Tulyum(III) asetat hidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH<alt>3</alt>CO<alt>2</alt>)<alt>3</ alt > ve orta nokta; xH < alt > 2 < / alt > O</td></tr><tr><td>İterbiyum (III) asetat tetrahidrat</td><td>Sigma</td><td>326011</td><td>Yb (C < alt > 2 < / alt >H < alt >3< / alt > O < alt > 2 < / alt >) <alt > 3< / alt > ve orta nokta; 4H < alt > 2 < / alt >O</td></tr><tr><td>1-Oktadesen</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>Oleik asit</td><td>Sigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>Metanol ve nbsp;</td><td>macron</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum florür</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&nbsp; CO-520</td><td>Sigma</td><td>238643</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksan</td><td>J.T.Baker</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit (%28 - %30)</td><td>J.T.Baker</td><td>972101</td><td>Amonyak</td></tr><tr><td>Tetraetil ortosilikat (TEOS)</td><td>Sigma</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroksimaleimid (NHM)</td><td>Sigma</td><td>226351</td><td>PKA aktivite bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>Domuz kollajeninden Prionex protein stabilizatör çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>Protein stabilizatör çözeltisi</td></tr><tr><td>2-nitrobenzil bromür (NBB)</td> <td>Sigma</td><td>107794</td><td>PKA kafes reaktifi</td></tr><tr><td>8- (4-Klorofeniltio) adenosin 3 & prime ;, 5 & prime ; -siklik monofosfat sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>C3912</td><td>8-CPT-cAMP</td></tr><tr><td>Piruvat Kinaz / Laktik Dehidrojenaz tavşan kasından elde edilen enzimler</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK / LDH</td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat disodyum</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td>ATP</td></tr> <tr><td>ve beta; -NADH dipotasyumdan indirgenmiş</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvat</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Coomassie Protein Test Reaktifi, 950 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Bradford tahlil reaktifi</td></tr><tr><td>cAMP'ye bağımlı protein kinaz</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>PKA aktivite kontrolü</td></tr><tr><td>pET15b-PKACAT plazmid</td><td>Addgene</td> <td># 14921</td><td></td></tr><tr><td>pKaede-MC1 plazmid</td><td>CoralHue</td><td>-V0012</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Hücresi kültür ortamı</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 Orta</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>01-115-1A</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>ACROS</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Çekirdek boyama boyası</td></tr><tr><td>Alexa 594-phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>F-aktin boyama boyası</td></tr><tr><td>5(6)-Karboksitetrametilrodamin &</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 Borular / Nominal filtre derecesi MWCO 12.000 - 14.000 Da</td><td>Membran Filtrasyon Ürünleri, Inc.</td><td>1430-33</td><td>Diyaliz membranı</td></tr><tr><td>Millex-HV Şırınga Filtre Ünitesi, 0.45 & m, PVDF, 13 mm, gama sterilize</td><td>EMD Milipore</td><td>SLHVX13NL</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dinamik Işık Saçılımı/Zetapotansiyel Zetasizer nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Spektrofotometre</td><td>Agilent Technologies</td><td>10075200</td><td>Cary Tutulması&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Agilent Technologies</td><td>10068900</td><td>Cary 50&nbsp;</td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm uzun geçiren filtre&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>850 nm dikroik ayna kısa geçişli</td><td>Chroma</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>RT3 renkli CCD sistemi</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Aydınlatma</td><td>ÖNCEKİ</td><td>Lümen 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm Kızılötesi diyot lazer</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED Spot Işık Kaynağı</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>200 mW/cm'de UPH-056-365 nm LED ile2</td></tr><tr><td>Termal kazık sensörü</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Hücre İçi Mikroenjeksiyon Dağıtım Sistemleri</td></tr><tr><td>PC-10 İğne çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>MANOMETRE Dijital basınç göstergesi</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>Tek eksenli Yağ Hidrolik Mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 Santrifüj, Soğutmalı</td><td>Termo Bilimsel</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre içi sinyal iletimi upconversion nanopartikül aracılı kinaz photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanopartikül (UCNP)-aracılı photoactivation için uzaktan kontrol bioeffectors derin doku penetrasyon ile çok daha az fototoksisite ile yeni bir yaklaşımdır. Ancak, piyasada mevcut araçları kolayca upconversion uygulama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, ticari araç değiştirerek bu araştırma için esastır. Bu yazıda, ilk geleneksel fluorimeter ve floresan mikroskop foton upconversion deneyler için uyumlu olmaları için değişiklikler göstermektedir. Biz o zaman bir yakın kızılötesi (Nur) sentezi tarif-UCNP kompleksi immobilize Kafesli protein kinaz A katalitik alt birimi (PKA) tetiklenir. Mikroenjeksiyon ve Nur photoactivation yordamlar için parametre de raporlanır. Kafesli PKA UCNP REF52 fibroblast hücreleri microinjected sonra geleneksel UV ışınlama için önemli ölçüde üstün olduğunu, NIR ışınlama PKA sinyal iletim yolu canlı hücreler içinde etkili bir şekilde tetikler. Buna ek olarak, pozitif ve negatif kontrol deneyleri stres lifleri dağılması için önde gelen PKA kaynaklı yolu özellikle NIR ışınlama tarafından tetiklenir onaylayın. Böylece, UCNP protein-modified kullanımı UV ışığı doğrudan maruz kaçınılmalıdır ışık modülasyonlu hücresel deneyler uzaktan denetlemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Kafesli enzim-UCNP yapı tasarım şekil 1' de gösterilmiştir. PKA enzim 2-nitrobenzyl bromür ile etkin olmayan bir kafese kapatılmış PKA oluşturmak için ilk tepki gösterdi ve sonra Elektrostatik UCNP yüzeyinde immobilize. UCNPs upconverted ışık yayarlar ve sonuç olarak photolytically o-nitrobenzyl grupları Cys 199 ve Cys 343, aktif PKA üreten ayırmak. TEM görüntüleri ve Bradford tahlil PKA ve Kafesli PKA UCNPs yüzey immobilize ve UV photoactivation sonra Kafesl...

Bu protokol için Kafesli protein kinaz A (PKA), hücresel sinyal iletim bioeffector bir nanopartikül yüzey üzerine immobilize sitozol microinjected ve upconverted UV yakın kızılötesi (Nur) ışınlama ışığı sayesinde inducing aşağı akım stres fiber dağılma sitozol içinde.

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

Bu deneyin amacı, yakın kızılötesi ışınlama kullanarak enzimin fotoaktivasyonunun fizibilitesini göstermektir. Kafeslenmiş protein kinaz A, hücrelere mikroenjeksiyonla aktarılan yukarı dönüştürücü nanopartiküllerin yüzeyine immobilize edilmiştir ve yakın kızılötesi ışınlama sonrası canlı hücrelerde kinazla tetiklenen yanıt gözlemlenmiştir. Geleneksel fotoaktivasyon, fototoksik UV ışığı gerektirir ve kaçınılmaz olarak istenmeyen kimyasal reaksiyonları ve benzer yanıtları eş zamanlı olarak tetikler; ancak, yakın kızılötesi ışınlama gibi dostça seçeneklerimiz, düşük enerjisi nedeniyle reaksiyonu tetiklemez.Yukarı dönüştürücü nanoparçacık, doğrudan UV ışınlaması olmaksızın parçacık yüzeyine yakın bir kimyasal reaksiyonu tetiklemek için, biyouyumlu düşük enerjili yakın IR fotonlarını yüksek enerjili UV fotonlarına etkili bir şekilde dönüştürebilir. Kinazlar onkogenezde kilit bir rol oynar; bu teknik, UV fototoksisitesinden ve yan reaksiyonlarından kaynaklanan girişimci gürültüyü çok daha düşük tutarak daha fazla sinyal iletim bilgisini incelememize yardımcı olabilir. Genel olarak, bu alana yeni giren kişiler, yukarı dönüştürme uygulaması için cihazların ve optik düzeneğin modifiye edilmesinde zorluklarla karşılaşacaktır.Başlamak için, lazerin küvetin ortasına odaklanabilmesi için florospektrometrenin küvet tutucusunun yanına 4x objektif lensi yerleştirin. Ayarlanabilir bir 980 nanometre lazer diyotu, objektif lense 90 derece açıyla yerleştirin. Objektif lens ile lazerin ışık yolu kesişimine tam yansıtıcı bir ayna kurun.İç aksamı korumak için spektrometrenin eksitasyon penceresini kapatacak anodize metal bir plakayı yerleştirmeyi unutmayın. Ardından, tutucuya silika kaplı yukarı dönüşümlü (upconversion) nanoparçacık çözeltisi içeren bir küvet yerleştirin. Lazer açıldığında parlak bir yukarı dönüşümlü ışın görülebilir.Hizalamalar sırasında en düşük PMT voltajı ile spektroskopi cihazını lüminesans moduna getirin. PMT'nin en güçlü sinyali alabilmesi için ışının küvetin ortasından geçmesini sağlayacak şekilde ayna ve lazer kademelerini ayarlayın. Dikroik bir ayna ve uyarım filtresi taktıktan sonra, alt katman ışık yoluna 980 nanometre bir lazer diyot yerleştirin.Odak düzlemindeki NIR ışınlama alanının yayılmasına ve genişlemesine yardımcı olmak için lazer ile ayna arasına bir kolimatör ekleyin. Ardından, yakın kızılötesi ışını görselleştirmek için bir yükseltme (upconversion) nanopartikül çözeltisi kullanın. Hizalamayı tamamlamak için yakın kızılötesi ışık ışınını merkezlemek amacıyla lazer tablasının konumunu ayarlayın.Metin protokolünde açıklandığı gibi caged-PKA sentezini gerçekleştirin ve caged-PKA/UCNP'yi demobilize ederek caged-PKA/UCNP oluşturun. UV fotolizinden önce her iki konstrüktün aktivitesini ölçmek için, analiz karışımına iki µL PKA çözeltisi eklendikten sonra analiz karışımındaki NADH absorbansındaki azalmayı zamanla ölçün. Ölçümü PKA/UCNP için tekrarlayın.Ardından, PKA'nın aktive edilebildiğinden emin olmak için, buzlu su banyosunda, caged-PKA ve caged-PKA/UCNP örneklerine santimetrekare başına 200 milliwatt UV fotoliz uygulayın. PKA aktivitesi, bir piruvat kinaz laktat dehidrogenaz enzim eşleşmeli testi ile belirlenir. PKA çözeltisinin eklenmesinden sonra, NADH absorbansındaki azalma zamanla ölçülür.İnkübatör dışında stabil pH kontrolü sağlamak amacıyla, mikroenjeksiyon süresince hücreleri %10 fetal bovine serum içeren L15 ortamında inkübe edin. İğne çekiciyi, daha sonra yapılacak uç açma işlemi için çapı yaklaşık 1.5 mikron olan konik şeklinde bir uç oluşturacak şekilde ayarlayın. Ucu açmak için, iğneyi mikroenjektöre yerleştirin, iğne ucunu bir lamın kenarına temas ettirin ve mikroskop tablasındaki hafif bir düğmeyi kullanarak işlemi gerçekleştirin.Bu titreşim kuvveti, ucu hafifçe kırmak ve açıklığı genişletmek için yeterlidir. İğne açıklığının dış çapının 1,3 ile 1,5 mikron arasında olduğundan emin olmak için inceleme yapın; bu durum 40x objektif lens kullanılarak alınan mikroskop görüntüleri ile doğrulanabilir. Ardından, enjeksiyon basıncını 50 ile 75 hektopaskal arasında, basınçlı aralığı 200 ile 300 milisaniye olarak ayarlayın ve ortamın iğneye geri akmasını önlemek için sabit kompanzasyon basıncını 15 ile 30 hektopaskal olarak belirleyin.Kafesli-PKA/UCNP kompleksini TAMRA boyası ile iğnenin arka konumuna yükleyin. Yüklenen iğne daha sonra, 30 ila 45 derecelik bir açıyla tek eksenli hidrolik mikromanipülatör üzerine yerleştirilir. Örnek yüklemesinden sonra hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için iğneyi mikroskop altında kontrol edin.İğneyi besiyerine daldırdıktan sonra, enjeksiyon basıncı uygulandığında boyanın hızla salındığını ve dengeleme basıncı sürekli uygulandığında boyanın yavaşça salındığını onaylamak için floresan moda geçin. Ardından, hücre mikroenjeksiyonuna başlamak için faz kontrastlı parlak alan moduna geçin. Başarılı enjeksiyonlarda membran şok dalgası gözlemlenebilir.Hücreleri iki kez yıkayın ve başarıyla mikroenjekte edilen hücreleri tespit etmek için enjekte edilen hücrelerde beraber enjekte edilen TAMRA floresansını kontrol edin. UCNP girişi olan ancak beraber enjekte edilen boya sinyali olmayan hücreler, enjeksiyon sırasında hücre membranının yırtıldığını gösterir ve sonraki deneylerden hariç tutulmalıdır. Hücreleri, 10x objektif lens ile odaklanmış alt katman ışık yolundaki 980 nanometre lazer diyot ile 15 dakika boyunca ışınlayın.Isınmayı önlemek için her beş dakikalık ışınlama sonrası beş dakikalık bir karanlık ara verin. Saniyeler hatta saniyenin altındaki süreler gibi daha kısa bir aktivasyon süresi gerekiyorsa, daha yüksek odaklanmış foton yoğunluğu için basitçe 40x objektif lensine geçiş yapın. Fotoliz ve hücre toparlanmasının ardından, hücreleri daha sonra yapılacak alexa 594 boyamasından önce, PBS içindeki bir mililitre veya %4 paraformaldehit ile 20 dakika boyunca fikse edin.Son olarak, NIR ile indüklenen stres lifi disintegrasyonunu görselleştirin. NIR ışınlamasından sonra, beyaz oklarla belirtilen caged-PKA/UCNP mikroenjekte edilmiş hücreler, yukarı dönüştürme emisyonu gösterir. Başarılı bir PKA NIR fotoaktivasyonunun neden olduğu stres lifi disintegrasyonu, daha fazla f actin açığa çıkarır ve sonuç olarak UCNP yakınında güçlü yeşil boyama ile sonuçlanır.Hücrelerin mikroenjeksiyon işlemine tabi tutulduğu ancak karanlıkta bırakıldığı negatif kontrolde, stres liflerinde herhangi bir parçalanma görülmez. NIR fotoaktivasyonu sonrası f aktin maruziyet seviyesi, alexa 594 ile boyanabilir ve ardından image J ile nicelleştirilebilir. Kırmızı ok boyunca f aktin boyanmasının yoğunluk eğrileri çizilmiş olup, bu eğriler NIR kaynaklı PKA aktivitesi ile ilişkilendirilebilen stres lifi parçalanmasına dair nicel bilgiler sağlamıştır. Mikroenjeksiyona alışıldıktan sonra bu teknik, hazırlık ve caged-PKA/UCNP kalite kontrolü dahil olmak üzere bir gün içinde tamamlanabilir.Enstrüman modifikasyonlarımız ve deneylerimiz için sunduğumuz talimatlarla, istenen reaksiyon; geleneksel titrasyon yöntemlerinde kullanılan UV ışığı gibi yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte, ancak fototoksisite riski olmadan ve bulaşıcı olmadığı için yakın IR ile tetiklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre uyumlu yakın IR ışığı kullanarak enzim nanoparçacık kompleksinin mikroenjeksiyon yoluyla bir hücreye nasıl iletileceği ve enzimin nasıl fotoaktive edileceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Bu teknik, hücrenin UV fototoksisitesini tolere edemediği durumlarda, canlı hücrelerde uzaysal-zamansal çözünürlük için istenen enzimatik reaksiyonu tetiklemek amacıyla ışık kullanması gereken kimyasal biyoloji alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır.Bu prosedürü takiben, spasyo-temporal fotoaktivasyon gerektiren ek soruları yanıtlamak için yükseltme nanopartikülüne diğer biyolojik etkileyiciler ilişkilendirilebilir. Eğer biyolojik etkileyici hücre dışı çalışıyorsa, mikroenjeksiyona bile gerek yoktur. Yakın IR fotoaktivasyon platformu, dokularda daha fazla penetrasyon derinliği sağlayabilir ve bu nedenle, istenen reaksiyonları belirli bir zamanda ve konumda tetiklemek için küçük hayvanlarda uygulanabilir.

an-integrated-system-to-remotely-trigger-intracellular-signal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Organik boya molekülleri ve oleik asit kaplı yukarı dönüştürücü nanopartiküller suda çözünür değildir. Bu protokol, organik boya moleküllerinin transferini ve partiküllerin başlangıçtaki hidrofobik çözücülerinden suya yukarı dönüştürülmesini sağlayan bir 'tak ve çalıştır' yöntemini tanımlar.

A &#39;Tak ve&#39; Yöntem, bir Amfifilik Polimer, Organik maddeler ve upconverting Nanopartiküller İçeren Su dağılabilir Nanoassemblies oluşturma

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Küçük moleküllü bir substratı oksitleyen bir lusiferaz enzimi tarafından yayılan biyolüminesans ışığı, bir lusiferin, fotosensoriyel proteinleri aktive etmek için kullanılabilir, böylece ışık stimülasyonuna başka bir boyut ekler ve hücrelerde zamansal ve mekansal ölçeklerde çok sayıda ışık aracılı fonksiyonun manipülasyonunu sağlar.

Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

Bu protokol, hücresel dağılımını ve ışık stimülasyonuna tepkisini doğru bir şekilde izlemek için cAMP sensörlerinin ve optogenetik bir protein olan bPAC-nLuc'un transfekte edilmesini içerir. Bir nokta tarama sistemi kullanarak bir cAMP yanıt haritası oluşturmaya yönelik yenilikçi yaklaşım, farklı alanlarda optogenetik proteinlerle yapılan araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir.

Bir Işık Stimülasyon Izgarası Kullanarak Bir Optogenetik Proteinin Hücresel Dağılımının Haritalanması

Keşfedin, hücre içi sinyal iletimini upconversion nanopartikül aracılı kinaz fotoaktivasyonuyla uzaktan tetiklemeyi. Bu yöntem, fototoksisite olmadan canlı hücrelerde enzim aktivasyonu sağlar ve onkojenezdeki sinyal yollarını incelemek için güvenli bir alternatif sunar.

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem (Video) | JoVE Journal

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Daha fazla video keşfet