Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Bu deneyin amacı, yakın kızılötesi ışınlama kullanarak enzimi fotoaktif hale getirmenin fizibilitesini göstermektir. Kafesli protein kinaz A, hücrelere mikro enjekte edilen yukarı dönüşüm nanopartiküllerinin bu yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirilir ve yakın kızılötesi ışınlamadan sonra canlı hücrelerde kinaz kaynaklı yanıt gözlenir. Geleneksel fotoaktivasyon, fototoksik UV ışığı gerektirir ve kaçınılmaz olarak, istenmeyen kimyasal reaksiyonu ve benzer tepkiyi birlikte indükleyecektir, ancak dostça seçeneklerimizde, yakın kızılötesi ışınlama gibi, düşük enerjisi nedeniyle reaksiyonu tetikleyemez.

Yukarı dönüştürme nanoparçacığı, doğrudan UV ışınlaması olmadan parçacık yüzeyine yakın bir kimyasal reaksiyonu tetiklemek için IR fotonun yakınındaki biyo-dostu düşük enerjiyi yüksek enerjili UV fotonuna etkili bir şekilde dönüştürebilir. Kinaz onkogenezde önemli bir rol oynar, bu teknik, UV fototoksisitesi ve yan reaksiyonundan çok daha düşük parazit gürültüsü ile daha fazla sinyal iletim bilgisini incelememize yardımcı olabilir. Genel olarak, bu alanda yeni olan kişiler, yukarı dönüştürme uygulaması için aletleri değiştirmede ve optik kurulumda zorluklarla karşılaşacaktır.

Başlamak için, florospektrometrenin küvet tutucusunun yanına 4x objektif bir lens takın, böylece lazer küvetin ortasına odaklanabilir. Objektif merceğine 980 derece ayarlanabilir bir 90 nanometre lazer diyotu yerleştirin. Tam bir yansıma aynası ve objektif lens ile lazerin ışık yolu kesişimini takın.

İç kısımları korumak için spektrometrenin uyarma penceresini engellemek için anotlanmış bir metal plaka yerleştirmeyi unutmayın. Ardından, tutucuya silika kaplı yukarı dönüştürme nanopartikül çözeltisinden oluşan bir küvet yerleştirin. Lazer açıldığında parlak bir yukarı dönüştürme ışını görselleştirilebilir.

Spektroskopiyi, hizalamalar sırasında en düşük PMT voltajı ile lüminesans moduna geçirin. PMT'nin en güçlü sinyali alması için ayna ve lazer aşamalarını, ışın küvetin ortasından geçecek şekilde ayarlayın. Bir dikroik ayna ve bir uyarma filtresi taktıktan sonra, alt kademe ışık yoluna 980 nanometrelik bir lazer diyot takın.

Odak düzlemindeki NIR ışınlama alanını dağıtmaya ve büyütmeye yardımcı olmak için lazer ve ayna arasına bir kolimatör ekleyin. Ardından, yakın kızılötesi ışını görselleştirmek için bir yukarı dönüştürme nanoparçacık çözeltisi kullanın. Hizalamayı tamamlamak için yakın kızılötesi ışık huzmesini ortalamak için lazer aşamasının konumunu ayarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi kafesli PKA/UCNP oluşturmak için kafesli PKA sentezi gerçekleştirin ve kafesli PKA/UCNP'yi devre dışı bırakın. UV fotolizinden önce her iki yapının aktivitesini ölçmek için, tahlil karışımına iki mikrolitre PKA çözeltisi eklendikten sonra zaman içinde tahlil karışımındaki NADH emicilerindeki azalmayı ölçün. PKA/UCNP için ölçümü tekrarlayın.

Daha sonra, PKA'nın aktive edilebildiğinden emin olmak için bir buzlu su banyosunda kafesli-PKA ve kafesli-PKA/UCNP'nin santimetre karesi başına 200 miliwatt'ta UV fotolizi gerçekleştirin. PKA aktivitesi, bir piruvat kinaz laktat dehidrojenaz enzimine bağlı test ile belirlenir. NADH emicilerinde bir azalma ile, PKA çözeltisinin eklenmesinden sonra zamanla ölçülür.

İnkübatörün dışında stabil pH kontrolü için mikroenjeksiyon süresi boyunca hücreleri L15 ortamı içeren% 10 fetal sığır serumunda inkübe edin. İğne çekiciyi, daha sonra uç açmak için yaklaşık 1.5 mikron çapında koni şeklinde bir uç için yapılandırın. Ucu açmak için, iğneyi mikroenjektöre takın, iğne ucunu bir sürgünün kenarıyla temas ettirin ve mikroskop aşamasında hafif bir düğme ile takip edin.

Bu titreşim kuvveti, ucu hafifçe kırmak ve açıklığı büyütmek için yeterlidir. 1.3x objektif lens kullanılarak mikroskop görüntüleriyle doğrulanabilen 1.5 ila 40 mikron arasında bir dış çapa sahip olduğundan emin olmak için iğne açıklığını inceleyin. Ardından, enjeksiyon basıncını 200 ila 300 milisaniyelik basınçlı bir aralıkla 50 ila 75 hektopaskal arasında ayarlayın ve iğneye orta geri akışı önlemek için sabit dengeleme basıncını 15 ila 30 hektopaskal olarak ayarlayın.

Kafesli PKA/UCNP kompleksini iğnenin arka konumuna TAMRA boyası ile yükleyin. Yüklenen iğne daha sonra 30 derece ila 45 derece arasında bir açıyla bir eksenli hidrolik mikromanipülatör üzerine kurulur. Numune yüklendikten sonra kabarcık oluşmadığından emin olmak için iğneyi mikroskopla kontrol edin.

İğneyi ortama daldırdıktan sonra, enjeksiyon basıncı uygulandığında boyanın patlama salınımını ve sürekli olarak kompanzasyon basıncı uygulandığında boyanın yavaş salındığını doğrulamak için floresan moduna geçin. Ardından, hücre mikroenjeksiyonunu başlatmak için faz kontrastlı parlak alan moduna geçin. Başarılı enjeksiyonlarda membran şok dalgası gözlenebilir.

Hücreleri iki kez yıkayın ve başarılı bir şekilde mikroenjekte edilen hücreleri bulmak için enjekte edilen hücreleri birlikte enjekte edilen TAMRA floresansı açısından kontrol edin. UCNP kabulü olan ancak birlikte enjekte edilen bir boya sinyali olmayan hücre, hücre zarının enjeksiyon sırasında yırtıldığını ve daha sonraki deneylerden çıkarılması gerektiğini gösterir. Hücreleri, 15 dakika boyunca 10x objektif lens tarafından odaklanan alt kademe ışık yolunda 980 nanometre lazer diyot ile ışınlayın.

Isınmayı önlemek için her beş dakikalık ışınlamadan sonra beş dakikalık bir karanlık aralık bırakın. Saniyeler ve hatta alt saniyeler gibi daha kısa bir aktivasyon süresine ihtiyaç duyulursa, daha yüksek odaklı foton yoğunluğu için 40x objektif lense geçmeniz yeterlidir. Fotoliz ve hücre geri kazanımını takiben, hücreleri 20 dakika boyunca PBS'de bir mililitre veya% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından daha fazla alexa 594 boyama takip etti.

Son olarak, NIR kaynaklı stres lifi parçalanmasını görselleştirin. NIR ışınlamasından sonra, beyaz oklarla gösterildiği gibi kafesli-PKA / UCNP ile mikroenjekte edilen hücreler, yukarı dönüşüm emisyonu gösterir. Başarılı bir PKA NIR fotoaktivasyonunun neden olduğu stres lifi parçalanması, daha fazla f aktin açığa çıkarır ve sonuç olarak UCNP yakınında güçlü yeşil lekelenme ile sonuçlanır.

Hücrelerin mikroenjekte edildiği ancak karanlıkta kaldığı negatif bir kontrol, stres liflerinin parçalanmadığını gösterir. NIR fotoaktivasyonundan sonra f aktin maruziyeti seviyesi, alexa 594 ile boyanabilir, ardından içinde ve görüntü J ile ölçülebilir. Kırmızı ok boyunca f aktin boyamanın yoğunluk eğrileri çizildi ve NIR ile indüklenen PKA aktivitesi ile ilişkilendirilebilecek stres lifi parçalanmasının kantitatif bilgisi sağlandı. Mikroenjeksiyona aşina olduktan sonra, bu teknik, kafesli-PKA / UCNP'nin hazırlanması ve kalite kontrolü dahil olmak üzere bir gün içinde yapılabilir.

Cihaz modifikasyonlarımız ve deneylerimiz için talimatlarımızla, istenen reaksiyon, titrasyon yöntemleri için geleneksel UV gibi oldukça uzamsal zamansal çözünürlükte yakın IR tarafından tetiklenebilir, ancak fototoksisite olmadan bulaşıcı değildir. Bu videoyu izledikten sonra, enzim nanopartikül kompleksinin mikroenjeksiyon yoluyla bir hücreye nasıl verileceğini ve IR ışığının yakınında çan uyumlu çan kullanarak enzimi fotoaktif hale getireceğinizi iyi anladığınızı umuyoruz. Bu teknik, kimyasal biyoloji alanındaki araştırmacıların, hücre UV fototoksisitesini tolere edemediğinde, mekansal zamansal çözünürlük için canlı hücrelerde istenen enzimatik reaksiyonu tetiklemek için ışığı kullanması gereken araştırmacıların yolunu açtı.

Bu prosedürü takiben, uzamsal zamansal fotoaktivasyon gerektiren ek soruları yanıtlamak için diğer biyo etkileyiciler, yukarı dönüşüm nanoparçacığı ile ilişkilendirilebilir. Biyo efektör hücre dışı çalışıyorsa, mikroenjeksiyona bile gerek yoktur. Yakın IR fotoaktivasyon platformu ayrıca dokuda daha fazla penetrasyon derinliği sağlayabilir ve bu nedenle belirli bir zamanda ve yerde istenen reaksiyonları tetiklemek için küçük hayvanlarda uygulanabilir.