Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

Bu yöntemin genel amacı, iki veya daha fazla hücreler arası bağlantı proteininin hücreler içinde birlikte lokalize olup olmadığını belirlemek ve ko-immünopresipitasyon yoluyla fiziksel etkileşimlerini daha fazla değerlendirmektir. Bu yöntem, normal gelişimde kavşakların oynadığı roller ve meme kanseri gibi hastalıklar da dahil olmak üzere meme bezi alanının biyolojisindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vivo olarak protein-protein etkileşimi hakkında nispeten düşük bir maliyetle önemli bilgiler sağlayabilmesidir.

Ko-immünofloresan boyama yapmak için, dondurucudan uygun mikroskobik slaytları alın. Bölümleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde dört formaldehite batırarak hemen sabitleyin. Ardından, slaytları oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuzlu suya batırın.

Bir sonraki adıma geçene kadar slaytları orada bırakın. Piyasada bulunan bir hidrofobik bariyer veya su itici bir laboratuvar kalemi kullanarak slaytın her bir bölümünü daire içine alın. Hemen dokuya PBS damlaları ekleyin ve prosedürün geri kalanı için slaytı bir insan histoloji odasına yerleştirin.

Her doku bölümünü 100 ila 200 mikrolitre yüzde üç Sığır Serumu Albümin-Tris-Tamponlu Salin,% 0.1 polisorbat-20 ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edin. Numuneler bloke edilirken, antikorları TBS% 0.1 polisorbat-20 içinde seyrelterek birincil ve ikincil antikor çözeltilerini hazırlayın. Bloke edici çözeltiyi aspirasyon ile çıkardıktan sonra, bölümleri seyreltilmiş primer antikorun 100 ila 200 mikrolitresinde oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.

Daha sonra birincil antikor çözeltisini aspirasyon ile çıkarın ve bölümleri beş dakika boyunca 250 ila 500 mikrolitre TBS% 0.1 polisorbat-20 ile yıkayın. Yıkamayı iki kez tekrarlamadan önce yıkama solüsyonunu aspirasyon ile çıkarın. Yıkama solüsyonunu aspire edin ve bölümleri 100 ila 200 mikrolitre uygun Floro-4 konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.

İkincil antikor çözeltisini aspirasyon ile çıkardıktan sonra, bölümleri beş dakika boyunca 250 ila 500 mikrolitre TBS% 0.1 polisorbat-20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu çıkarın ve iki kez tekrarlayın. İlgilenilen sonraki proteinler için uygun birincil ve ikincil cisimler kombinasyonunu kullanarak bu adımları tekrarlayın.

Son yıkamanın çıkarılmasının ardından, bölümü milileter DAPI başına 100 ila 200 mikrolitre bir miligram ve TBS% 0.1 polisorbat-20 ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek çekirdek boyamayı gerçekleştirin. DAPI solüsyonunu aspire edin ve slaytları suda çözünür, floresan olmayan bir montaj ortamı ve kapak kızakları kullanarak monte edin. Slaytları en az sekiz saat boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabına düz bir şekilde yerleştirin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi floresan mikroskobik görüntülemeye devam edin. 500 ila 1000 mikrogram lizat toplayın ve her 1.5 mililitrelik tüpte her biri 200 mikrolitrelik bir son hacme PBS'de seyreltin. İlgilenilen antijene karşı antikoru ilk lizat tüpüne ekleyin ve buz üzerinde tutun.

Tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede düşük hızda bir tüp silindirli karıştırıcı üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, ön yıkama için yeni 1,5 mililitrelik tüplere 50 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Boncukları içeren tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa doğru hareket etmesine izin verin.

200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak saklama tamponunu boncuklardan çıkarın. 500 mikrolitre PBS% 0.1 polisorbat-20 ekleyerek boncukları yıkayın ve tüpleri 10 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. Ardından, tüpleri manyetik standa geri koyun ve boncukların mıknatısa doğru hareket etmesine izin verin.

200 mikrolitrelik bir pipetle pipetleyerek fazla yıkama tamponunu çıkarın. Lizat antikor reaksiyon kompleksini boncuklara ekleyin ve silindir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpleri manyetik standın üzerine yerleştirin ve boncukların mıknatısa doğru hareket etmesine izin verin.

200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, lizatı aspire edin ve atın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. 500 mikrolitre PBS ekleyerek, tüpleri manyetik standa yerleştirerek ve sıvıyı daha önce olduğu gibi çıkararak boncukları iki kez yıkayın. Yıkama adımları sırasında girdaplaşmayı önleyin ve numuneleri buz üzerinde tutun.

Boncukları girdap oluşturmadan PBS %0.1 polisorbat-20 ile bir kez yıkayın ve son yıkama tamponunu 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak atın. Elde etmek için, tüplere 20 mikrolitre 0.2 molar asidik glisin ekleyin ve bunları silindir karıştırıcı üzerinde yedi dakika çalkalayın. Birkaç saniye yüksek hızda santrifüjledikten sonra, süpernatanı taze, buz gibi soğuk bir tüpte toplayın.

Her tüp için yıkama ve elüsyon adımlarını tekrarlayın. Ardından, 40 mikrolitrelik ayrıştırılmış numuneye 10 mikrolitre 4x tampon ekleyin. Ayrıştırılmış numunelere, rengi maviye dönene kadar her seferinde bir damla olmak üzere hemen bir molar Tris ekleyin ve ardından sonraki tüplere geçin.

Ayrıştırılan numuneleri 70 ila 90 santigrat derecede 10 dakika kaynatın. Hazırlanan lizatları ve çökeltilmiş numuneleri bir SDS-PAGE akrilamid jel içinde yan yana yükleyin. Jeli, yaklaşık 95 dakika boyunca veya göç eden proteinlerin kenarı jelin dibine ulaşana kadar 100 voltta çalışan tamponda çalıştırın.

Daha sonra, jelleri standart bir protokol kullanarak bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın. Ardından, zarı yüzde beş kuru süt TTBS'de düşük hızda bir külbütör üzerinde bir saat boyunca bloke edin. Çökeltmenin başarılı olup olmadığını belirlemek için, çökelen proteine karşı ilk antikoru kullanarak zarı araştırın.

Üretici tarafından önerilen konsantrasyonda yüzde beş kuru süt TTBS ile seyreltin. Membranı gece boyunca dört santigrat derecede yavaş çalkalama ile sallanan bir platformda inkübe edin. Ertesi gün, membranı yüksek çalkalama ile sallanan bir platformda TTBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, zarı, TTBS içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş uygun ikincil antikorda, yavaş çalkalama ile sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Yüksek çalkalama ile sallanan bir platformda TTBS ile her biri beş dakika boyunca üç ila altı yıkama yapın. Membranı ticari olarak temin edilebilen bir luminol çözeltisi ile inkübe ederek ikincil antikorun sinyalini analiz edin ve üreticinin talimatlarını izleyin.

Bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak sinyali tespit edin. Etkileşen proteinleri tanımlamak için, aynı leke üzerinde uygun antikorları kullanarak bu adımları tekrarlayın. Boşluk bağlantısı, aderans bağlantı noktası ve sıkı bağlantı bileşenlerinin meme bezinde birlikte etkileşime girip giremeyeceğini belirlemek için ko-immünofloresan testleri yapıldı.

Ko-immünofloresan testi, adherens bileşkesinin ayrılmaz bir proteini olan beta-katenin ve bir boşluk kavşağı proteini olan Connexin 26'nın, sarı renkle yansıtıldığı gibi, laktasyonun yedinci gününde farelerin meme bezlerinde hücre zarında birlikte lokalize olduğunu göstermektedir. Hücre çekirdekleri mavi DAPI boyama ile görselleştirilir. Hamileliğin 18. gününde meme bezlerinden kriyoseksiyonlar kesildi ve yeşil renkle gösterilen sıkı bir bağlantı proteini olan Claudin 7, kırmızı ile gösterilen bir aderens bağlantı proteini olan E-Cadherin ve mercan mavisi ile gösterilen bir boşluk bağlantı proteini olan Connexin 26 için immünofloresan olarak boyandı.

Çekirdekler mavi DAPI ile boyandı. E-Cadherin ve Claudin 7 kolokalizasyonu sarı ila açık turuncu renkte görüntülenirken, Connexin 26'nın E-Cadherin ve Claudin 7 ile kolokalizasyonu beyaz noktalı boyama ile sonuçlandı. Hangi eklem proteinlerinin hücre zarında birbirine karıştığını ve fiziksel olarak birbirine bağlandığını bulmak için, emziren farelerden alınan meme bezi dokuları kullanılarak ko-immünopresipitasyon gerçekleştirildi.

Sonuçlar, boşluk bağlantısının bir bileşeni olan Connexin 43'ün E-Cadherin ve Claudin 7 ile etkileşime girdiğini, ancak Claudin 3 ile etkileşime girmediğini gösterdi. Bu sonuçlar karşılıklı immünopresipitasyon ile doğrulandı. E-Cadherin immünopresipite edildiğinde, Connexin 43 ve Claudin 7 ile etkileşime girdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dört ila sekiz slayt için ko-immünofloresan için iki gün içinde yapılabilir ve uygun şekilde yapılırsa slaytlar ertesi gün görüntülenebilir. Ko-immünofloresan prosedürünü denerken, örtüşmeyen dalga boylarına sahip farklı boşluklarda yükseltilmiş farklı Floro 4 konjuge antikorlarını seçmeyi ve ko-immünopresipitasyon için kullanılan antikorlarla uyumlu uygun protein A veya G manyetik boncukları seçmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, murin meme bezlerindeki hücreler arası kavşakların etkileşimini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.