Cpf1'i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

Aşağıdaki videolar, CRISPR ile ilişkili protein olan Cpf1'i kullanarak DNA parçalarını birleştirmek için C-Brick standardını kullanma prosedürünü detaylandırmaktadır. Bu yöntem, sentetik biyoloji alanında DNA düzeneğinin gelişimini ilerletebilir. Karmaşık genetik devrelerin inşasını kolaylaştırmak gibi.

Bu yöntemin ana avantajı, diziden bağımsız olması ve DNA yapılarının yinelemeli montajına izin vermesidir. Bu yöntem için ilk olarak, Cpf1'in tek siRNA ve katalitik DNA tarafından yönlendirildiğini fark ettiğimizde ortaya çıktık. Bu nedenle, DKN'ler oluşturuluyor.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Shi-Yuan Li olacak. CrRNA şablonlarını onarmak için, tek tek oligonükleotidleri RNaz içermeyen suda 10 mikromolar konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne, ekteki belgede ayrıntılı olarak açıklandığı gibi üst iplikçik oligonükleotidi, alt iplikçik oligonükleotidi ve 10x tavlama tamponu ekleyin.

Toplam hacmin 50 mikrolitre olduğundan emin olun. Bu tablo, her biri üst iplikçik T7-F ile ayrı ayrı eşleştirilmesi gereken altı farklı alt iplikçik oligonükleotidini göstermektedir. Küçük harfler, crRNA'nın kılavuz dizisine kopyalanacak diziyi temsil eder.

PCR tüpünü bir termocycler'a yerleştirin. Tavlama programını beş dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ilk denitrasyon ile çalıştırın ve ardından dakikada bir santigrat derece azalma ile 95 ila 20 santigrat derece arasında bir soğutma yapın. Tavlamayı takiben, tavlanmış ürünü 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde RNaz içermeyen su, T-7 transkripsiyon tamponu, NTP karışımı, rekombinant RNaz inhibitörü ve T-7 RNaz polimeraz ile birleştirerek hemen transkripsiyon gerçekleştirin.

Reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Ertesi gün, kopyalanan RNA'yı saflaştırmak için bir RNA temizleme ve konsantrasyon kiti kullanın. RNA'yı ölçmek için bir UV-Vis spektrofotometresi kullanın.

Ardından, RNA'yı 10 mikromolar konsantrasyona seyreltin. Numuneler hemen kullanılmayacaksa, 80 santigrat derecede saklayın. C-Brick parçalarının yapımı çeşitli yöntemlerle gerçekleştirilebilir.

Videonun bu bölümünde, üç kromoprotein kaseti, cjBlue, eforRed ve amilGFP, dikişsiz montaj yöntemi kullanılarak birleştirilecektir. Kromoprotein kasetlerinin PCR amplifikasyonu için oligonükleotidleri tasarlayarak ve sipariş ederek başlayın. Oligonükleotidler geldiğinde, bunları ultra saf suda 10 mikromolar konsantrasyona kadar tekrar süspanse edin.

Ardından, PCR reaksiyonlarını ayarlamak için 0.2 mililitre PCR tüplerini buzun üzerine yerleştirin. Ultra saf su, iki XPCR tamponu, DNTP'ler, ileri ve geri primerler, kromoprotein şablonu ve yüksek kaliteli DNA polimeraz ekleyin. Tüpleri doğrudan termocycler'a yerleştirin ve programı çalıştırın.

Numuneleri hemen kullanın veya dondurun ve 20 santigrat derecede saklayın. Amplifikasyonun ardından, PCR ürünlerini bir kit kullanarak saflaştırın. Ardından, C-Brick standart vektörünü BamH1 ile sindirmek için tüpe ultra saf su, plazmid, 10x tampon ve BamH1 ekleyin.

Bir su banyosunda 37 santigrat derecede iki saate kadar inkübe edin. Bir jel temizleme kiti kullanarak doğrusallaştırılmış vektörü saflaştırın. Temizlemenin ardından, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde doğrusallaştırılmış vektörü, PCR ürününü, 5x dikişsiz montaj tamponunu ve dikişsiz montaj enzimini dikişsiz bir montaj kitinden birleştirin.

Toplam hacmin 10 mikrolitre olduğundan emin olun. Bunu 30 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Kuluçka işleminden sonra numuneleri hemen kullanın veya buz üzerinde dondurun ve 20 santigrat derecede saklayın.

90 mikrolitre e coli DH10B'ye 10 mikrolitre yapı ekleyin. Kimyasal bir dönüşüm gerçekleştirin. Daha sonra, dönüştürülmüş hücreleri bir LB plakasına yayın ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, beş mililitrelik sıvı LB tüplerinde kültürlemek için birkaç klon seçin ve bunları gece boyunca 220 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir plazmit hazırlama kiti kullanarak plazmidi çıkarın. Ardından, Sanger dizilimi ile doğru klonları tanımlayın.

C-Brick yollarının inşasının, reaktif PCI uygulamasıyla veya T4 DNA ligaz ortamının ligasyona hemen sindirilmesindeki kısıtlama ile de gerçekleştirilebileceğini bilin. Daha sonra, C-Brick vektörünü Cpf1 ile sindirmek için, RNaz içermeyen su, 10x Cpf1 tamponu, plazmid, rekombinant RNaz inhibitörü ve Cpf1'i 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. T1 ve T2 bölgelerine yabancı bir DNA parçası yerleştirmek için, bir mikrolitre crRNA T2 ekleyin ve tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra tüpü su banyosunda tutarak bir mikrolitre crRNA T1, bir mikrolitre Cpf1 ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Önce crRNA T2 eklenir, çünkü iki tanıma bölgesi vektör DNA'sına daha yakındır. T1 bölgesindeki Cpf1 bağlanması, T2 bölgesinin yatağını etkileyebilir.

Ayrıca, T2'nin sitesi T2 bölgesinin yerini alıyorsa, önce crRNA T1'in eklenmesi durumunda T2'nin sitesi bozulurdu. Bir mikrolitre ısıya duyarlı alkalin fosfataz ekleyin ve tüpü 37 santigrat derece su banyosunda bir saat daha inkübe edin. Agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak vektörü saflaştırın.

Numuneleri hemen kullanın veya dondurun ve 20 santigrat derecede saklayın. İlgilenilen DNA fragmanını Cpf1 ile sindirmek için, RNaz içermeyen su, 10x Cpf1 tamponu, plazmit, rekombinant RNaz inhibitörü ve Cpf1'i 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. T1 ve T2 bölgelerine yabancı bir DNA parçası yerleştirmek için, tüpe bir mikrolitre crRNA T1 ve bir mikrolitre crRNA T3 ekleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, agaroz jel elektroforezi yapın ve bir jel temizleme kiti kullanarak parçayı saflaştırın. Numuneleri hemen kullanın veya dondurun ve 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, C-Brick vektöründeki yabancı DNA fragmanını bağlamak için, doğrusallaştırılmış vektörü ve DNA fragmanını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.

10x T4 DNA Ligaz Tamponu ve T4 DNA Ligaz ekleyin. Ardından, 22 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Numuneleri hemen kullanın veya dondurun ve 20 santigrat derecede saklayın.

E coli DH10B yetkili hücrelerine 10 mikrolitre ligasyon ürünü ekleyin ve kimyasal bir dönüşüm gerçekleştirin. Daha sonra, dönüştürülmüş e coli'yi LB plakalarına yayın ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 5 mililitrelik sıvı LB tüplerine birkaç klon ekleyin ve gece boyunca 220 rpm ve 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Bir plazmit hazırlama kiti kullanarak plazmidi çıkarın. Ardından, Sanger dizilimi ile doğru klonları tanımlayın. Yeni bir C-Brick montajı turu gerçekleştirin.

Numuneyi kullanarak, çatlak klonları olarak adlandırılan klonlar, daha fazla C-Brick yinelemeli montajı için yeni bir C-Brick vektörü veya DNA parçası olarak kullanılabilir. Üç kromoprotein kaseti, cjBlue, eforRed ve amilGFP, bu videoda anlatıldığı gibi birleştirildi. Bir plaka üzerinde yetiştirilen e coli'de üç kromoprotein eksprese edildi.

Kromoprotein içermeyen negatif kontrol bakterileri dördüncü plakada gösterilmiştir. Daha sonra, daha fazla renk oluşturmak için iki renk ifade kaseti C-Brick standardıyla daha da birleştirildi. Üç kromoprotein ve üç birleştirilmiş çift kromoprotein, sıvı LB ortamında büyütülen e coli'de eksprese edildi.

Birden altıya kadar ifade edilen yapılar şunlardır: eforRed, bir, amilGFP, iki, cjBlue, üç, amilGFP artı eforRed, dört, eforRed artı cjBlue, beş ve amilGFP artı cjBlue, altı. Tek bir plaka üzerindeki veya tek bir mikrosantrifüj tüpündeki renkli bakteriler, tek bir dizi doğrulanmış klondan kültürlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, siRNA hazırlığı ve Cpf1 temizleme için tüm materyallerin RNaz içermemesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hala tavsiye ediyorum, bu taktik, sentetik biyoloji alanındaki araştırmacıların metabolik yolların genetik bir vitrinini oluşturmaları için bir yol olarak yardımcı oldu. Bu videoyu izledikten sonra, C-Brick standardını kullanarak bir DNA yolunun nasıl birleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.