Name: Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Öğrenin, akış sitometresi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminden mikroglia ve monosit türevi makrofaj alt popülasyonlarını izole etme ve belirteçlerini analiz etme yöntemini. Bu teknik nöroimmünoloji araştırmaları için güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer ve Bpifrance&#39;in hibeleriyle desteklendi. Laboratuarımızda ayrıca Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie ve &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) programı desteklenmektedir. CELIS hücre kültürü çekirdeğinin desteğine teşekkür ediyoruz.

Burada açıklanan tüm yöntemler, ICM Enstitüsünde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından ve Darwin Fransız Etik Hayvan Komitesi tarafından onaylanmıştır ve 01407.02 protokolüyle kapsanmıştır. 1. Hazırlık <ol><li> Sindirim kokteylini her fare için aşağıdakileri birleştirerek 1.5 mL&#39;lik bir tüp içerisinde hazırlayın: 1 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS); 13 wunsch / mL&#39;de (stok çözeltisi) 123 uL sindirim enzimi (materyal tablosuna bakınız), son konsantrasyon: 1.6 w / sn; Ve 100 mg / mL&#39;de (stok çözeltisi) 5 uL DNaz I (bakınız tablo), nihai konsantrasyon 0.5 mg / mL. </li></ol> 2. Perfüzyon ve Diseksiyon <ol><li> Fareleri ölümcül bir pentobarbital dozu (400 mg / mL&#39;de 100 μL) ile euthanize edin. </li><li> Hayvanı yatırın ve vücudu% 70 etanol ile ıslatın. </li><li> Göğüs boşluğunu açığa çıkarmak için ventral cildi, xyphoid prosesin hemen altındaki ince makaslarla kesin.y. </li><li> Diyaframa bir kesi yapın ve kalbi ortaya çıkarmak için (ve diğer organları kesmekten kaçınmak için) rostral yönde kaudal bir şekilde ince makasla göğüs kafesinin yanal yönlerini kesin. Sol ventrikül (LV) ve sağ atriyumun (RA) tanımlanması. </li><li> LV&#39;nin içine 25 G iğne ile bir kelebek kateteri takın. İnce makaslarla RA&#39;ya bir kesi yapın ve kan akışının başlangıcında, damarlardan hücreleri ve kanları çıkarmak için 20 mL PBS ile LV boyunca 10 mL / dakika akış oranında perfüzyona başlayın; Başarılı bir perfüzyon akciğerlerin ve karaciğerin kanlanması nedeniyle göğüs gerilmesi ile belirtilir. </li><li> Hayvanı orta makasla dekapatlayın. Omurga sütununu ince makaslarla parçalara ayırın ve omuriliğin ventral tarafındaki karın duvar kaslarını çıkararak ve kuyruk tabanındaki vertebral kolonu keserek vücudundan ayırın. </li><li> PBS içeren bir 10 mL&#39;lik şırınga yerleştirin ve bel desteğine 200 ml&#39;lik bir pipet yerleştirin.Omurga kolu ve omurili servikal taraftan boşaltın. NOT: 200 mcL pipet ucu en geniş ucunda (yaklaşık 1 cm) makasla kesilir ve daha önce PBS ile dolu 10 mL şırıngaya sıkıca yerleştirilir. </li><li> Kafatasının üstündeki cildi çıkarın ve beyni ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Kafatasının tabanına bir makas bıçağı takın ve sagital sütürü takiben kafatayı kesin. Kesime küçük forseps yerleştirin ve kafatasını hafifçe kaldırın. Fare kafasından beyni ayırın ve koku ampulünü ve serebellumu çıkarın. </li><li> Sindirim kokteyli (1. adımdan itibaren) 1.128 mL PBS içeren 1.5 mL&#39;lik bir tüp içerisinde beyin ve omurilik toplayın. </li></ol> 3. Hücre Ayrışımı <ol><li> Küçük makasla 1-2 mm 3 parçaya ( Şekil 1. ) 1,5 mL tüpün (adım 2.9) beyin ve omurili ince şekilde kesin. </li><li> Öğütülmüş dokuları içeren 1.5 mL tübü bir incuba&#39;da 30 dakika inkübe edin37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile yıkayın. NOT: Bu adımda yoğunluk derecesini hazırlayın. </li><li> Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 20 ml 0.5 M EDTA (stok solüsyonu), nihai konsantrasyon 10 mM, 1.5 mL tüp ekleyin. </li><li> 5 mL pipetle aşağı yukarı pipetle hafifçe hücre süspansiyonu yapın. </li><li> 10 mL şırınganın pistonu kullanarak 50 mL&#39;lik bir tüpteki hücre süspansiyonunu bir naylon ağ (70 um gözenek boyutu) üzerinden geçirin. </li><li> Naylon örgüyü 20 mL% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS) -PBS ile yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında (18 ° C) 7 dakika boyunca (300 xg) santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyon ile atın ve sonraki adıma geçin. Süpernatantı çıkartırken son derece dikkatli olun; Pelet rahatsız etmeyin, pellet, aspirasyon pipetiyle kolaylıkla aspire edilebilir. </li></ol> 4. Yoğunluk Dereceli <ol><li> Yoğunluk gradyan ortamına uygun miktarda 10x PBS ekleyerek yoğunluk gradyanı ortam stok solüsyonu hazırlayın. NOT: Dokuz parçalı yoğunluk gradyanı ortamına bir parça 10X PBS ekleyin. </li><li> Stok yoğunluğu gradyan ortamını Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi farklı yüzdeler için 1x PBS ile seyreltin. </li><li> 4 mL% 30 yoğunluk gradyan ortamı ile pelletini (adım 3.7&#39;den) tekrar süspansiyon haline getirin ve 15 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. </li><li> 15 mL&#39;lik tüpün altına bir Pasteur pipeti yerleştirin ve yavaşça% 37&#39;lik yoğunluk derecesi ortamının 4 mL&#39;sini altına yerleştirin. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi 4 mL% 70 yoğunluk dereceli ortam ekleyin. </li><li> Degrade oda sıcaklığında (18 ° C) 40 dakika boyunca (800 xg) santrifüjleyin. Santrifüjün az veya hiç frenle durduğundan emin olun, böylece ara faz rahatsız edilmez. NOT: Boru katmanlı görünecektir. % 70 -% 37 yoğunluk gradyan arayüzünde tabakalanmış hücreler, mononükleize edilen immün hücrelerdir (mikroglia ve makrofaj alt popülasyonları); Üst düzeyler sırasıyla hücre döküntüsü ve miyelindir ( Şekil 2 ). </li><lI&gt; Bir transfer pipeti kullanarak hafifçe miyelin tabakasını çıkarın. </li><li> Temiz bir 15 mL tüp içine makrofaj alt popülasyon hücreleri içeren 3-4 mL% 70-37 yoğunluk gradiyent ara fazı toplayın. </li><li> PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın, toplam hacmi 15 mL. Hücrelerin bulunduğu yoğunluk gradyan ortamının PBS ile en az üç kez seyreltildiğinden ve fren &quot;açık&quot; konumdayken 7 dakika (500 xg, 4 ° C) santrifüje tabi tutulduğundan emin olun. </li><li> Hücre etiketleme veya diğer fonksiyonel testler için hücre pelletini 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin. </li></ol> 5. Akış Sitometrisi için Hücre Etiketleme <ol><li> Hücreleri (adım 4.10) bir akış sitometri tüpüne aktarın. </li><li> Adım 4.10&#39;da elde edilen her bir hücre örneğine 1 μL sabitlenebilir ölü hücre lekesi reaktifi ekleyin. Işıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Hücreleri bir kez 2 mL PBS ve 5 dakika boyunca santrifüjle yıkayın (300 xg, 4 ° C). </li><li> Süpernatıtıyı çıkarın ve hücre peletini400 uL PBS% 1 BSA,% 0.1 azid. </li><li> Fc reseptörlerini bloke etmek için 100 uL hücreye 1 μg CD16 / CD32 antikoru ekleyin. Buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin, ışığa karşı korunun. </li><li> İntraselüler boyama için hücre permeabilization için birincil antikor karışımı PBS% 1 BSA,% 0.1 azid veya PBS% 1 BSA,% 0.1 azid,% 0.25 saponin hazırlayın. </li><li> Birincil antikor karışımı (2x) 100 uL ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun. NOT: Optimum sonuçların elde edilmesi için deney yapılmadan önce tüm antikorlar titrasyona tabi tutulmalıdır. </li><li> 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 5 dakika boyunca santrifüjleyin (300 xg, 4 ° C). Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Birincil antikorlar doğrudan bir floroforla konjuge edilmediyse 100 uL ikincil bir antikor ekleyin ve ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ° C&#39;de 300 xg&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Tamir etOda sıcaklığında 15 dakika oda sıcaklığında 100 μL% 1 PFA ile yıkanır. NOT: Dikkat: PFA toksiktir. Duman kabininde kullanın ve kişisel koruyucu ekipman giyin. </li><li> 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ° C&#39;de 300 xg&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> 200 uL PBS ile hücre topağı tekrar süspansiyon ve akış sitometri edinimi ve analizi devam edin. Şekil 3&#39;deki geçiş stratejisini izleyin. </li></ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).</li>
<li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages%3A+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocyte-derived+macrophages%3A+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).</li>
<li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CNS+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li>
<li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li>
<li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25107477">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression%2C+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li>
<li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li>
<li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX%283%29CR1%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li>
<li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li>
<li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer%27s+disease+models%3A+effects+of+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia%3A+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li>
<li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22079990">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
<li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li>
<li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-associated+microglia+and+macrophages%2Fmonocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li>
<li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecekleri bir şeyleri yok

Mikroglia ve MDM&#39;nin MSS&#39;de farklı işlevlere ve fenotiplere sahip oldukları gösterildi ve bu nedenle bu makrofaj alt popülasyonlarının tanımlanması ve analizi, nörolojik hastalıkları daha iyi anlamak için gereklidir 9 , 18 , 25 . İki belirteç (CD11b ve CD45) kullanılarak yapılan akış sitometrisi analizi, her alt popülasyon arasındaki ayrımı mümkün kılar ( Şekil 3C ). Bu strateji daha önce M...

Mikrogram, merkezi sinir sisteminin (MSS) parenkimal dokuya ait makrofajlarıdır. İki önemli fonksiyonel rol oynuyorlar: Bağışıklık savunması ve SSS homeostazisinin korunması. Kemik iliğindeki hematopoietik kök hücrelerden sürekli olarak yenilenen MDM&#39;den farklı olarak, mikroglial hücreler embriyonik gelişme sırasında beyinde koloni oluşturan yolk kesesinden (YS) kaynaklanan ilkel hematopoietik progenitör hücrelerden ayırırlar 1 , 2 , 3 . Kemirgenlerde, transkripsiyon faktörü Myb, tüm kemik iliği kaynaklı monositlerin ve makrofajların gelişiminde çok önemli bir rol oynamaktadır, ancak YS türevi mikroglia için bu faktör gerekli değildir ve farklılaşma, transkripsiyon faktörü PU.14&#39;e bağımlıdır. Sağlıklı CNS&#39;de, mikroglia, çevrede sürekli olarak örnek olan dinamik hücrelerdir, scaPatojenleri veya doku hasarını işlemek için nning ve survey 5 . Bu tür sinyaller algılanması, yaralanmanın çözüm yolunu başlatır. Mikroglia, hızlıca ayrılmış bir morfolojiden amoeboid bir fogositoza ve ardından pro-veya anti-inflamatuar sitokinler gibi çeşitli mediatörlerin salınmasını izler. Böylece, mikro çevreye bağlı olarak aktive edilmiş mikroglia farklı priming durumlarından 6 oluşan bir spektrum kazanabilir. Mikroglia, birçok nörolojik rahatsızlığın gelişimini ve ilerlemesini derinden etkilemektedir. Alzheimer hastalığının (AD) 7 , Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 8 , Multipl Skleroz (MS) 9 veya Parkinson hastalığının (PD) 10 kemirgen modellerinde mikroglia&#39;nın zararlı nörotoksisite indükleyen ya da etki eden iki rol oynadığı gösterilmiştir Nöroprotektif bir tarzda, bağımlı olanSpesifik hastalık, hastalık evresi ve hastalığın sistemik bağışıklık bölmesinden 7 , 8 , 9 , 10 , 11 etkilenip etkilenmediği. Yukarıda belirtilen hastalıklarda gözlenen CNS lezyonlarının çoğunda sadece parankimal mikrogram değil aynı zamanda perivasküler ve meningeal makrofajların yanı sıra CNS-sızıntılı MDM de dahil olmak üzere heterojen bir myeloid hücre popülasyonu bulunur. Bu hücre tipleri, yaralanma ve onarım ile ilişkili patofizyolojik mekanizmalara farklı şekilde katkıda bulunabilir 7,12,13,14,15. Bu hastalık modellerini inceleyen araştırmacılar için mevcut zorluk, periferik monositlerin ve makrofajların MSS&#39;ye sızdığını ve eğer öyleyse distBu hücrelerden ikamet eden mikrogliaları kucaklayın. Aslında mikroglial hücreler çok plastiktir; Aktive edildiğinde, mikrogram genellikle periferik monositler ve makrofajlar tarafından eksprese edilen belirteçleri yeniden ifade eder. Bu nedenle, konu, yerleşik mikroglianın sızma monositleri ve makrofajları ayırt edebilen belirteçlerin belirlenmesine dayanır. Bu popülasyonların beyin dilimleri üzerindeki immünohistolojik uygulamaları ile ayrımcılık spesifik antikorların olmaması nedeniyle sınırlıdır. Bununla birlikte, akış sitometrisi analizi, çeşitli belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirmek ve hücre popülasyonlarını (örneğin, lenfositler, makrofajlar / MDM CD11b + CD45 yüksekleri ve mikroglia CD11b + CD45 med ) ayırmak için etkili bir teknik yanı sıra hücre alt popülasyonları 16 , 17 , 18 . Bu protokol,Optimize edilmiş, enzimatik bir doku ayrışması ve bir yoğunluk gradiyentli santrifüjleme kullanarak nörolojik hastalık modellerinde fare CNS&#39;den alınan mononükleer hücreler; Hem de flow sitometri kullanarak CNS&#39;de mikroglia ve MDM popülasyonlarını ayırt etmek için bir yöntem. Bir diğer yaklaşım, miyelin&#39;i yok etmek ve spesifik antikorlara 19 , 20 , 21 konjuge edilmiş manyetik boncuklar kullanarak hücreleri saflaştırmaktır. Anti-miyelin manyetik boncuklar kullanan miyelin giderimi daha pahalıdır ve canlılığı ve izole edilmiş hücrelerin verimi 22&#39;yi etkiler. Bu adım ve mikroglianın izleyen immünomanyetik ayrımı, spesifik bağışıklık hücre popülasyonları 21 , 22 için ileri araştırmaları sınırlandırır. Bu prosedürler, hastalık gelişiminde makrofaj alt popülasyonlarının incelenmesi için kolay bir yol sağlar veMakrofaj fenotipleri ve aktivasyon durumlarındaki ilaç etkilerini veya gen modifikasyonlarını belirlemek.

<table><tbody><tr><td>5 aylık Fareler</td><td>Janvier</td><td>C57BL / 6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberaz TL Araştırma Sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından sindirim enzimi Deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17-0891-01</td><td>Yoğunluk gradyan orta</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci boyutu 70 ve mikro; m Naylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Pistonlu şırınga 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeti 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tüp</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistiren yuvarlak tabanlı boru</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin çözeltisi %30</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit %32 Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15714-S</td><td>Dikkat -Toksik</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Sıçan anti-fare CD11b (klon M1 / 70)</td> <td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b K İzotip Kontrolü PerCP-Siyanin5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Sıçan anti-fare CD45 (klon 30-F11)</td> <td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Sıçan IgG2b, &kappa; İzotip Kontrolü RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-fare TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Eşek anti-tavşan IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD16 / CD32 Saflaştırılmış</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Fare Fc</td></tr><tr><td>Blok Sabitlenebilir Ölü Hücre Leke Kitleri</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Fare CCR2 APC konjuge Antikor</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG2B APC-konjuge İzotip Kontrolü</td><td>R& D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Fare CX3CR1 PE konjuge Antikor</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>Keçi IgG PE konjuge Antikor</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Hücre analizörü</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Veri Analiz Yazılımı</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Standart Model Forseps</td><td>FST</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Makas</td><td>FST</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometresi ile merkezi sinir sisteminden mikroglia ve monosit türevi makrofajların analizi

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Birçok çalışma, merkezi sinir sistemi (CNS) patolojilerinde bağışıklık hücrelerinin, özellikle makrofajların rolünü göstermiştir. CNS&#39;de iki ana makrofaj popülasyonu vardır: (i) MSS&#39;nin yerleşik makrofajları olan ve embriyogenez sırasında sarı kese öncülerinden türetilen mikroglia ve (ii) sızıntı yapabilen monosit türevi makrofajlar (MDM) Hastalık sırasında MSS&#39;dir ve kemik iliği progenitörlerinden türemiştir. Her makrofaj alt popülasyonunun rolü, incelenen patolojiye göre değişir. Dahası, histolojik belirteçler veya bu makrofaj alt popülasyonları için kullanılan ayırt edici kriterler üzerinde fikir birliği bulunmamaktadır. Bununla birlikte, akış sitometrisi ile CD11b ve CD45 markörlerinin ekspresyon profillerinin analizi, mikrogliayı (CD11b + CD45 med ) MDM&#39;den (CD11b + CD45 yüksek ) ayırmamızı sağlar. Bu protokolde, yoğunluk gradyanı santrifüjününVe akış sitometri analizi bu CNS makrofaj alt popülasyonlarını karakterize etmek için ve yakınlarda yayınladığımız gibi bu hücreler tarafından ifade edilen birkaç ilgi işaretçisini incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle bu teknik, nörolojik hastalıkların fare modellerinde makrofajların rolünü daha iyi anlayabilir ve ayrıca bu hücreler üzerindeki ilaç etkilerini değerlendirmek için de kullanılabilir.

Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve antikor boyama işleminden sonra hücreler bir akış sitometresinde tutuldu ve aşağıdaki gibi bir morfolojik geçiş stratejisi kullanılarak analiz edildi. Tek hücrelerin çiftleşmelerden ayırt edilmesi için, İleri-Dağılmış-Alan (FSC-A) ve İleri-Dağılmış Yükseklik (FSC-H) karşılaştırması için bir ilk kapı tanımlanmıştır ( Şekil 3A ). Tek hücreler daha sonra göreceli hücre büyüklüğü ve hücre parçacıklığına ( <strong clas...

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Bu deneyin genel amacı, merkezi sinir sistemi veya MSS içindeki makrofaj alt popülasyonları tarafından eksprese edilen çeşitli belirteçleri değerlendirmektir. Bu yöntem, nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, MSS'ye giren makrofajların ayrımı ve MSS makrofajlarının fenotiplerinin neler olduğu gibi sorulara yanıt aranmaktadır. Bu tekniğin temel avantajları, çok sayıda yüksek saflıkta makrofaj alt popülasyonunun izole edilebilmesi ve makrofaj alt popülasyonu hücre belirteçlerinin miktarlığının belirlenebilmesidir.Torasik boşluğu açığa çıkarmak için ince bir makas kullanarak ksifoid çıkıntının hemen altındaki ventral deriyi kesin. Diyaframda bir insizyon yapın ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesinin lateral kısımlarını kaudalden rostral yöne doğru kesin. Sol ventrikül ve sağ atriyumu belirledikten sonra, sol ventriküle 25 gauge iğneli bir kelebek kateter yerleştirin.Sağ atriumda bir insizyon yapın ve kan akışı başlar başlamaz kateter aracılığıyla dakikada on mililitre hızla 20 mililitre PBS perfüzyonuna başlayın. Başarılı bir perfüzyon, kan yer değiştirdikçe akciğerlerin ve karaciğerin renginin açılmasıyla belirtilecektir. Ardından, o

analysis-microglia-monocyte-derived-macrophages-from-central-nervous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

Kaynak: Hidmark, A. S.,  et al. {{}}Tek Bir Siyatik Sinirlerde ve Dorsal Kök Ganglionunda İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 27}} (2017).  Bu video, fare siyatik sinirlerinde ve dorsal kök gangliyonlarında (DRG'ler) bağışıklık hücrelerini analiz etmek için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. İşlem, bağışıklık hücrelerinin florofor ve biyotin etiketli antikorlarla etiketlenmesini, hücrelerin stabilize edilmesini ve geçirgenleştirilmesini ve...

Fare Sinir Dokularındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Kantitatif analiz fare siyatik sinir içinde hücre içeriğinin doku kıtlığı nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı doku sindirim ve sinir bağışıklık hücre gruplarından bireysel farelerin Akış Sitometresi Analizi için yeterli hücre sağlar hazırlık için bir yöntemi açıklar.

Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Yaralı omuriliklerde mikroglia (MG) ve periferik infiltre makrofajları (Mø) tanımlamak zordur. Bu protokolde, sırasıyla M1 benzeri MG, M2 benzeri MG, M1 benzeri Mø ve M2 benzeri Mø'yu tanımlamak için akış sitometrisi (FCM) kullanıldı. Bu teknoloji, MG ve Mø'nun rolünü anlamak için diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarına da uygulanabilir.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Yaralı Omurilikteki Mikroglia ve Periferik İnfiltre Makrofajların Belirlenmesi

Burada, mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak iskemik inme sonrası immün hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimlerin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar ve diğer nörodejeneratif hastalıkları incelemek için uyarlanabilir ve inme patolojisindeki immün yanıtları anlamamızı geliştirir.

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Öğrenin, akış sitometresi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminden mikroglia ve monosit türevi makrofaj alt popülasyonlarını izole etme ve belirteçlerini analiz etme yöntemini. Bu teknik nöroimmünoloji araştırmaları için güvenilir bir çerçeve sunar.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Daha fazla video keşfet