Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Bu deneyin genel amacı, merkezi sinir sistemi veya CNS içindeki makrofaj alt popülasyonları tarafından ifade edilen çeşitli belirteçleri değerlendirmektir. Bu yöntem, nöroimmünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin CNS'nin baş dönmesi yapmaya çalışırken aptalca makrofajlar ve makrofajlarda CNS'nin fenotipleri nelerdir. Bu tekniğin ana avantajları, çok sayıda yüksek oranda saflaştırılmış makrofaj alt popülasyonunun izolasyonunun yanı sıra makrofaj alt popülasyon hücre markörünün bir araya getirilmesidir.

Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için ksifoid sürecinin hemen altındaki ventral cildi kesmek için ince makas kullanarak başlayın. Diyaframda bir kesi yapın ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesinin yan yönlerini kaudal ila rostral yönde kesin. Sol ventrikülü ve sağ atriyumu belirledikten sonra, sol ventriküle 25 gauage iğneli bir kelebek kateter yerleştirin.

Sağ atriyumda bir kesi yapın ve kan akmaya başlar başlamaz kateterden dakikada on mililitre hızında 20 mililitre PBS sıkmaya başlayın. Başarılı bir bolluk, kanın yer değiştirmesi nedeniyle akciğerlerin ve karaciğerin beyazlatılması ile gösterilecektir. Ardından, omurgayı incelemek için ince makas kullanın.

Omurganın ventral tarafındaki karın duvarı kas sistemini eksize etmek ve omurgayı hasat edilirken çıkarmak için kuyruğun tabanındaki vertebral sütunu kesmek. Omurganın bel tarafına modifiye edilmiş 200 mikrolitrelik pipet ucu ile donatılmış on mililitrelik bir PBS şırıngası yerleştirin. Sonra omuriliği servikal tarafta yıkayın.

Kafatasının üzerindeki cildi çıkarın ve makasın bir ucunu kafatasının tabanına yerleştirin. Sagital dikişi takiben kafatasını kesin. Sonra kesiğe küçük forseps yerleştirin ve kafatasının üst kısmını yavaşça çıkarın.

Beyni fare kafasından ayırın ve koku ampulünü ve beyinciği çıkarın. Daha sonra beyni ve omuriliği, bir nokta bir, iki sekiz mililitre sindirim kokteyli içeren bir nokta beş mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Hücreleri ayırmak için, beyni ve omuriliği bir ila iki milimetre küp parçaya ince bir şekilde kesmek için küçük makas kullanın ve parçaları 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş Karbondioksite yerleştirin.

Kuluçka süresinin sonunda, 20 mikrolitre sıfır nokta beş molar EDTA ile sindirimi durdurun, ardından beş mililitrelik bir pipetle hafifçe ezin. Elde edilen hücre süspansiyonunu, kalan beyin veya omurilik dokusunu nazikçe yumuşatmak için on mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak 70 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Süzgeci 20 mililitre yüzde beş FBS ve PBS ile durulayın.

Ve filtrelenmiş hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Ardından, peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücrelerin yoğunluk gradyanı ayrımı için, peleti dört mililitre yüzde 30 yoğunluk gradyan ortamı ile askıya alıyoruz ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarıyoruz.

Dört mililitre yüzde 37 yoğunluk gradyan ortamının altına nazikçe yerleştirin, ardından yüzde 37 yoğunluk gradyan ortamının altına dört mililitre yüzde 70 yoğunluk gradyan ortamı koyun. Hücreleri ayırmak için tüpü tezgah üstü bir santrifüje aktarın. Mikroglia ve makrofaj hücreleri, yüzde 70 ve 37 yoğunluklu gradyan katmanlarının arayüzünde olacaktır.

Tüp tabakalı görünecektir. Miyelinin üst tabakasını dikkatlice çıkardıktan sonra, mikroglia makrofaj interfaz tabakasının üç ila dört mililitresini 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra bağışıklık hücrelerini 15 mililitre PBS'de üç santrifüjle yıkayın ve son yıkamadan sonra peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Makrofaj alt popülasyon belirteç ekspresyonunu değerlendirmek için, hücreleri beş mililitrelik bir akış sitometrisi analiz tüpüne aktarın, ardından bir mikrolitre sabitlenebilir ölü hücre lekesi reaktifi ekleyin. Buz üzerinde 30 dakika bekledikten sonra, ışıktan korunarak, numuneleri iki mililitre PBS'de yıkayın ve peleti deneysel analiz tüpü başına 400 mikrolitre faks tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri uygun sayıda beş mililitre akış sitometrisi analiz tüpüne bölün.

Daha sonra, ışıktan korunarak buz üzerinde 10 ila 15 dakikalık bir inkübasyon için 100 mikrolitre hücre başına bir mikrogram CD 16 CD 32 bloke edici antikor kokteyli ile spesifik olmayan FC reseptör bağlanmasını bloke edin. Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre uygun primer antikorlarla etiketleyin, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için, ışıktan korunarak. İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki mililitre PBS'de dört kez yıkayın.

Daha sonra, ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika boyunca 100 mikrolitre uygun ikincil antikorlar ekleyin, ardından gösterildiği gibi PBS'de dört yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, peletleri 100 mikrolitre yüzde bir paraformaldehit içinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ışıktan koruyarak nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri PBS'de dört kez yıkayın.

Son peletleri 200 mikrolitre taze PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Beyin ve omurilikten türetilmiş mikroglia ve monosit kaynaklı makrofajlar, CD 11 B ve CD 45 ekspresyonlarına göre tanımlanır. CX3CR1 ve Tmem119'un CD 11 B pozitif CD 45 orta mikroglial hücreler tarafından ekspresyonu, bu hücre popülasyonunun, bu belirteçlerin hiçbirini eksprese etmeyen, ancak CCR2'yi eksprese eden CD 11 C pozitif CD 45 yüksek monosit türevi makrofajlardan daha fazla ayırt edilmesini sağlar.

Yoğunluk gradyanı ayrımından sonra, hücrelerin yüzde 85 ila 95'i hala canlı. Yoğunluk gradyan izolasyonunun yokluğunda, makrofaj alt popülasyonları, makrofaj olmayan hücrelerin ve miyelin kalıntılarının varlığı nedeniyle ileri iki taraflı bir saçılma grafiğinde tanımlanamaz. Anti-Tmem119 antikoru tarafından tanınan epitop hücre içi olduğundan, bu önemli mikroglial hücre belirtecinin etiketlenmesi için geçirgenlik gereklidir.

Bununla birlikte, geçirgenleşmenin hücre büzülmesine neden olduğunu, makrofaj alt popülasyonlarının ileri ve yan saçılma analizi ile daha küçük görünmesine neden olduğunu unutmayın. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, yoğunluk derecesini çok dikkatli bir şekilde ayarlamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, makrofaj alt popülasyon sinyal yolları hakkında ek soruları yanıtlamak için kantitatif rt-PCR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların, nörolojik hastalıkların fare modelinde makrofaj alt popülasyonunun aktivasyonunu araştırmalarının yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ile makrofaj alt popülasyonları olarak ya test yapmalı ya da bu geleneği takip etmelisiniz.

Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman başlık kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.