Name: Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin akış sitometresi ile primer sıçan retinal ganglion hücrelerinin izolasyonunu. Bu standart yöntem, retinal dejeneratif hastalıklarda görme keskinliği kaybının mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir kaynak sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik video yardımı için Mikrobiyoloji, İmmünoloji ve Biyokimya Bölümü&#39;nden Kıdemli Illustrator Sayın Tim Higgins&#39;e teşekkür etmek istiyorlar; Matthew W. Wilson&#39;la tartışmalar ve Jablonski ve Morales-Tirado laboratuvarlarının üyeleri, yararlı yorumları için teşekkür eder. Bu çalışma, Alcon Araştırma Enstitüsü Genç Araştırmacı Ödülü (VMM-T), Tennessee Araştırma Vakfı (VMM-T) Üniversitesi, Ulusal Göz Enstitüsü EY021200 (MMJ), Gerwin Kardeşliği (VMM-T) tarafından desteklendi; Gerwin Ön Doktora Arkadaş Grubu (ZKG), Savunma Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (VMM-T) ve Körlüğü Önleme Araştırması&#39;ndan Sınırsız Hibe.

<ol><li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li>
<li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li>
<li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head%3A+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li>
<li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li>
<li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li>
<li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+number%2C+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li>
<li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li>
<li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li>
<li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li>
<li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li>
<li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li>
<li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional%2C+cellular%2C+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li>
<li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%3A+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li>
<li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li>
<li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li>
<li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).</li>
<li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Ophthalmol+Strabismus%22%5BJournal%5D)">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li>
<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936(2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62(2016).</li>
<li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5%2Fbrn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li>
<li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+%28RGC%29+loss+in+aging+DBA%2F2NNia+glaucomatous+mice%3A+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57%2FBL6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li>
<li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li>
<li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li>
<li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads%3A+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li>
<li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold%3A+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li>
<li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen%3A+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
</ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

FACS, hücre popülasyonlarını saflaştırmak için tercih edilen bir tekniktir. Diğer izolasyon yöntemleri arasında bağışıklık kazandırma, manyetik boncuklar ve kompleman sabitleme tükenmesi bulunur. FACS&#39;nin bu diğer metodolojilere göre avantajı, değişik derecelerde yoğunluk gösteren hücre yüzeyi markörlerinin eşzamanlı tanımlanmasına dayanır. Molekülün flüoresan yoğunluğu protein ifade miktarı ile orantılıdır. Şimdiye dek, RGC&#39;lerin izolasyonu kullanılan izolasyon yöntemine bakılmaksızın sadece Thy1 (CD90) pozitif...

RGC&#39;ler terminal olarak diferansiye edilmiş nöronlardır ve bu nedenle deney için birincil hücreler gerekir. Birincil sıçangil retinal gangliyon hücrelerinin (RGC&#39;lerin) izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol geliştirilmesi, RGC&#39;nin sağlık ve dejenerasyon mekanizmalarını in vitro ortaya koymak için temel teşkil etmektedir. Bu, RGC işlevini desteklemek ve ölümlerini en aza indirmek için potansiyel terapiler üretmek isteyen araştırmalar için özellikle önemlidir. RGC&#39;lerin dejenerasyonu, glokom, diyabetik retinopati ve normal yaşlanma gibi retinal dejeneratif hastalıklarla ilişkilidir. RGC kaybına neden olan spesifik hücresel mekanizmalar belirsiz olmasına rağmen, bir dizi risk faktörü tanımlanmıştır. Optik sinir başındaki oksijenasyon yetersizliği 1 , 2 , 3 RGC ölümüne 4 neden olur ve uyarıcı ve ben aktivasyonu arasındaki homeostazın bozulması gibi davranırBireysel RGC&#39;lerde nhibitor reseptörler 5 , 6 . Bir dizi zorluk, derinlemesine çalışmalar için bu hücrelerin kullanımına yönelik ilerlemeyi engeller. İlk olarak, bir sıçangil retinasında bulunan RGC sayısı azdır. RGC&#39;ler toplam retinal hücrelerin% 1&#39;inden azını oluşturmaktadır 7 , 8 , 9 . İkincisi, RGC&#39;ye özgü belirteçlerin çoğunda hücre içi proteinler 10 , 11 , 12&#39;dir . Bu işaretleyicilere dayanan seçim, hücreleri canlı olmamakla birlikte, işlevsel analizlerin yapılmasını engellemektedir. Sonunda, mevcut protokoller uzun sürmektedir ve standardizasyon eksikliği 13,14&#39;tür. Erken RGC izolasyon protokolleri bağışıklama yöntemlerine dayanıyordu. Barres ve ark. 15 Klasik bağışıklığı uyarladıAnasyon tekniğiyle birleştirildi ve bir hücre yüzeyi markörü olan anti-timosit antijenine (aka Thy1) immünopozitifliğe dayalı pozitif seçilimden önce retin hücrelerinin hacminden monositleri ve endotel hücrelerini hariç tutan ikinci bir adım ekledi. Yıllar sonra, Hong ve ark. RGC&#39;leri yüksek saflıkta izole etmek için hücre ayırma stratejileri ile manyetik boncuk izolasyon teknikleri kombine edilmiştir 16 . Manyetik boncukların kullanımı halen birçok bilimsel uygulamada kullanılmaktadır. Birlikte, manyetik boncuklar ve akış sitometri protokolleri izole edilmiş hücrelerin saflığını geliştirdi. Bununla birlikte, bu saflaştırma sistemleri henüz ayrılmış retinadan sıçangiller RGC&#39;lerin izolasyonu için standardize edilmemiştir. Akış sitometresi, hücre süspansiyonlarının optik ve floresans özelliklerini ölçen güçlü bir analitik yöntemdir. Hücreler hem niceliksel hem de niteliksel olarak yüksek duyarlılıkla analiz edilir ve hücre halkının çok boyutlu bir analizini sağlartirme. Hücresel ayrımcılık, iki ana fiziksel özellik üzerine kuruludur: hücre boyutu veya yüzey alanı ve taneciklilik veya iç karmaşıklık 17 . Benzer uyarılma dalga boylarına ve farklı emisyonlara sahip olan florokromlarla etiketlenmiş antikorları birleştirerek çok boyutlu bir analiz yapılabilir. Akış sitometrisi hızlı, tekrarlanabilir ve hassas. Multitpe lazerler, akış sitometrisiyle tek hücrelerin çok boyutlu analizlerine izin verir. Bu nedenle, sitolojik örneklerin incelenmesi için çekici bir metodoloji. Floresan aktive hücre ayırma (FACS), bireysel hücreleri farklı alt popülasyonlara ayırmak için akış sitometrisi ile tanımlanan çok boyutlu fenotipik farklılıkları kullanır. Son on yılda, nöronlar da dahil olmak üzere hücre seçimi için potansiyel biyolojik belirteç olarak çoklu yüzey ve hücre içi proteinler tespit edilmiştir. RGC&#39;leri sıçanlardan ayırmaya çalışan ilk çalışmalar, Thy1&#39;i ganglion celi olarak kullandıL işaretleyici. Ne yazık ki Thy1, diğer CD90, diğer kemirgen türleri 18 , 19 , 20&#39;de birden fazla izoforma sahiptir ve çoklu retinal hücre tipleri 19 , 20 tarafından ifade edilir, bu da RGC&#39;ler için spesifik olmayan bir belirteç yapar. CD48 adlı bir diğer yüzey markörü makrofajlar ve mikroglialar da dahil olmak üzere retinanın monositik popülasyonlarında bulunur. Bu iki yüzey markörünü kullanarak, modifiye edilmiş bir RGC imza-Thy1 + ve CD48 negatif hücreleri- 15 , 16 , 21 , 22 geliştirildi . Maalesef, bu iki seçim ölçütü, oldukça zenginleştirilmiş bir RGC popülasyonu seçmek için yeterli değildir. Bu karşılanmamış ihtiyacı gidermek için, çok tabakalı pozitif ve negatif seçim kriterlerine dayanan bir flow sitometri protokolü geliştirildi.Primer murin RGC&#39;leri zenginleştirmek ve saflaştırmak için bilinen hücre yüzeyi belirteçleri.

<table><tbody><tr><td>Anti-fare CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Klon MC-480</td></tr><tr><td>Anti-fare CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Klon HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-fare CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Klon VC1.1</td></tr><tr><td>Anti-fare CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Klon 30-H12</td></tr><tr><td>Parlak Menekşe 421 Keçi Anti-fare IgG BioLegend</td><td></td><td>405317</td><td>Klon Poly4053</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Anti-fare CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III bloğu, Klon 93</td></tr><tr><td>Zombi Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Canlı hücre / Ölü hücre ayrımı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>ABD menşeli</td></tr><tr><td>AbC Toplam Antikor Kompanzasyon Boncuk Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Çok tür Ig</td></tr><tr><td>Nörobazal Orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Kültürden önce ortama serum ekleyin.</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Tuzlu su çözeltisi</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZ-PT Model</td><td>Stereo Mikroskop</td></tr><tr><td>Sorvall Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>RT Taban Plakasında gerçekleştirilen tüm santrifüjler&nbsp;</td></tr> &<tr><td>ndash; Diseksiyon</td><td>Tavası Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>Bir balmumu plakası da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12; inç</td></tr><tr><td>İris Makas, Düz</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12; inç</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konik tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>Polipropilen tüpler</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konik tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Polipropilen tüpler</td></tr><tr><td>BD FACS Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>Polipropilen tüpler</td></tr><tr><td>40 mm tabaklar</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Doku kültürü tedavi 70</td></tr><tr><td>& mu; m naylon süzgeç</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>steril</td></tr><tr><td>40 &mu; m naylon süzgeç</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>steril</td></tr><tr><td>&nbsp; BD 10 mL şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>İğnesiz Tek Kullanımlık Şırınga</td></tr><tr><td>Havaneli</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>steril</td></tr><tr><td>Buğday Şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>Astarsız</td></tr><tr><td>BD 30 G iğne</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>1 inç</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Parlak Çizgi Cam Sayma Odası</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hemositometre</td></tr><tr><td>Gibco Tripan mavisi% 0.4 Çözelti</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Canlılık</td></tr><tr><td>Boyası Eppendorf tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>EVOS Floid Hücre Görüntüleme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>20X objektif ile Floresan Görüntüleme</td></tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>%70 Etanol yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS Pipet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS Pipet</td></tr><tr><td>Rafı LTS 1000 mL > GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Mavi Raf Steril</td></tr><tr><td>Uç Rafı LTS 250 mL & ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Yeşil Raf Steril Uç</td></tr><tr><td>Rafı LTS 20 mL & GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Kırmızı Raf Steril Uçlar</td></tr><tr><td>FACSAria II Hücre Sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>LSR II Sitometre</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml; ller hücreleri</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrositler</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Anakrin, Yatay</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Retinal Pigment Epitel</td></tr> <tr><td>HücreleriGad2</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm01545399_m1</td><td>Ev bakımı gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Yatay</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Yatay</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Fotoreseptörler</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm01219406_m1</td><td>Yatay</td></tr> <tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolar, Amakrin</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Retinal Ganglion Hücreleri</td></tr><tr><td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrositler</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Yatay</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amakrin</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Retinal Ganglion</td></tr> <tr><td>HücreleriRom1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Fotoreseptörleri</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Retinal Pigment Epitel</td></tr> <tr><td>hücreleriSlc1a3</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrositler</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00488345_m1</td><td>Retinal Ganglion Hücreleri</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Mm00727586_s1</td><td>Retinal Ganglion</td></tr> <tr><td>HücreleriVim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; ller hücreleri</td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR Reaktifi</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA İzolasyonu</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Sentez Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>cDNA sentezi</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>Ön Amplifikasyon adımı</td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fiksasyon / Geçirgenleştirme Tamponu</td></tr><tr><td>BD Perm / Yıkama</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Geçirgenleştirme Çözeltisi</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-86815</td><td>hücre içi antikor</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td></td><td>GTX110483 hücre içi antikor</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-8429</td><td>hücre içi antikor</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>hücre içi antikor</td></tr></tbody></table>

akış sitometresi ile primer sıçan retinalı ganglion hücrelerinin (rgc) İzolasyonu

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Nörodejeneratif hastalıklar genellikle etkilenenler üzerinde yıkıcı bir etkiye sahiptir. Retinal gangliyon hücresi (RGC) kaybı, normal yaşlanmaya ek olarak diyabetik retinopati ve glokom da dahil olmak üzere bir dizi hastalıkta rol oynar. RGC&#39;lerin önemine rağmen, bugüne kadar, retina içindeki çok çeşitli hücrelerin yalnızca küçük bir yüzdesini oluşturmaları nedeniyle kısmen çalışmak son derece zor olmuştur. Buna ek olarak, mevcut izolasyon yöntemleri canlı olmayan hücreler üreten RGC&#39;leri belirlemek için hücre içi işaretleyicileri kullanır. Bu teknikler aynı zamanda uzun izolasyon protokollerini de içerdiğinden, RGC&#39;leri elde etmek ve izole etmek için pratik, standartlaştırılmış ve güvenilir yöntemlerin eksikliği vardır. Bu çalışma, hem pozitif hem de negatif seçim kriterlerine dayanan bir protokol kullanarak, farelerin retinasından birincil RGC&#39;lerin izole edilmesi için etkili, kapsamlı ve güvenilir bir yöntem açıklamaktadır. Sunulan yöntemler, RGC&#39;lerin ilerideki çalışmalarına olanak tanır;Nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel RGC kaybından kaynaklanan görme keskinliğinde azalma.

<html> RGC&#39;lerin derinlemesine incelenmesi, düşük frekansları ve izolasyonları için sağlam ve standartlaştırılmış bir metodolojinin olmaması da dahil olmak üzere birçok faktör tarafından engellenmektedir. Şekil 1 , retina izolasyonu için kullanılan metodolojiyi göstermektedir. Enükleasyon prosedüründeki değişiklikler, enükleasyon in vivo deneyin bir parçası olup olmadığı gibi analiz türüne dayanır 27 . Bu protokoldeki enük...

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC&#39;ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC&#39;lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Bu prosedürün genel amacı, zenginleştirilmiş homojen bir primer fare retinal ganglion hücresi popülasyonu izole etmektir. Bu yöntem, yaşlı popülasyonlarda ve retinal dejeneratif hastalık popülasyonlarında görsel keskinliğin azalmasının altında yatan mekanizmalar hakkında, retinal ganglion hücresi alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, zenginleştirilmiş primer fare retinal ganglion hücrelerinin izolasyonu için hızlı, görünür, tekrarlanabilir ve standardize edilmiş bir protokol sunabilmesidir.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, o sırada laboratuvarımda lisansüstü öğrencisi olan ve bu çalışmanın birinci yazarı olan Sumana Chintalapudi'nin, günlük dergi toplantımızda Krishna Murtheadol'ün 2013 tarihli bir makalesini sunmasıyla edindik; söz konusu çalışma, başlangıçta ölümsüzleştirilmiş bir sıçan retinal ganglion hücresi hattı olarak üretilen RGC five hücre hattının artık sıçan kökenli olmadığını ve RGC fenotipine sahip olmadığını açıkça ortaya koymuştu. Bu durumun, kendi laboratuvarımız da dahil olmak üzere görme araştırmaları topluluğunun erişebildiği kaynaklarda büyük bir boşluk bıraktığı bizim için aşikâr hale geldi. Sumana ve ben Dr. Morales-Tirado ile iletişime geçtik ve üçümüz birlikte, canlı ve yüksek derecede zenginleştirilmiş RGC'leri izole etmek için yeni bir yöntem geliştirdik.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaklardır; çünkü bu yöntemin amacı, ya primer hücreler olarak kültüre edilebilen ya da bir hücre hattı olarak ölümsüzleştirilebilen, canlı ve yüksek düzeyde zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonu izole etmektir. Bu nedenle, izole edilmeye çalışılan hücrelere zarar vermemeye çok dikkat edilmelidir. Ayrıca, hücre ayıklama yönteminin parametreleri, izole edilmeye çalışılan spesifik hücrelere göre uyarlanmalıdır.Her iki yöntem de özel beceri setleri gerektirir. Prosedürleri, Dr. Jablonski'nin laboratuvarından araştırma görevlisi Dr. Xiang Di Wang ve benim laboratuvarımdan doktora adayı Bay Zach Goldsmith gösterecektir. Gözü enükleasyonla çıkarmak için, öncelikle forsepsi göz küresinin altına yerleştirin.Optik siniri kavrayın ve yukarı doğru çekin. Göz küresi, optik sinir bütünlüğü korunmuş şekilde enükle edilecektir. Gözü buz üzerindeki bir PBS şişesine yerleştirin ve diğer gözü enükle yapın.Tüm gözler toplandıktan sonra, bir gözü diseksiyon mikroskobu altında taze PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve optik sinirin tabanından göz küresini dikkatlice kavramak için pens kullanın. Gözü pensle tutmayı kolaylaştırmak için, aköz hümörün boşalmasını sağlamak amacıyla keskin 30 gauge bir iğne ile korneayı delin. Korneayı pensle tutarak, kornea dokusunda makasla küçük bir insizyon yapın ve kornea ile sklerayı nazikçe sıyırmak için pensi kullanın.Göz küresi yarıya kadar soyulduğunda, retinayı ve lensi dışarı çıkarmak için pens kullanın. Retinayı, bir biyogüvenlik kabini içerisinde PBS ve %1 FBS içeren küçük 40 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve her yıkama için taze PBS artı FBS ile retinayı üç kez yıkayın. Tüm gözler yıkandıktan sonra, 12 adede kadar retinayı PBS ve FBS ile nemlendirilmiş steril 70 mikronluk bir naylon süzgecin üzerine yerleştirin ve dairesel hareketler kullanarak, 10 mililitrelik bir şırınga pistonunun arka ucuyla retinaları nazikçe parçalayın.Tüm hücreler disosiye edildiğinde, süzgeci polipropilen bir toplama tüpünün üzerine yerleştirin ve hücreleri süzgeçten geçirerek toplama tüpüne filtrelemek için bir P1000 pipet kullanın. Süzgeci PBS ve FBS ile durulayarak yıkama sıvısını toplama tüpünde birleştirin. Retina başına nihai hacmi bir mililitre çözeltiye tamamlayacak kadar PBS artı FBS ekleyin ve hücreleri santrifügasyon yoluyla toplayın.Ardından, eğer immünlekeleme hemen yapılacaksa, pelleti retina başına bir mililitre ortam konsantrasyonunda FBS eklenmiş PBS içinde yeniden süspande edin. Alternatif olarak, nöral hücre ortamında yeniden süspande edilen hücreleri yatay pozisyonda dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Retinal hücreleri immünlekelemek için, retinal hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve pelleti bir fax tüpünde 50 mikrolitre taze FBS eklenmiş PBS içinde yeniden süspande edin.İşaretsiz negatif kontrol için beş kez 10⁶ hücreyi ayırın. Ardından, her tüpteki spesifik olmayan FC reseptör bağlanmasını, 10⁶ hücre başına bir mikrolitre anti mouse CD 16 32 antikoru ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bloke edin. Bloklama inkübasyonunun sonunda, hücrelere ilgilenilen antikor kokteylini nazikçe pipetleyerek ekleyin ve ışıktan korunmuş şekilde buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.Ardından hücreleri, PBS ve FBS ile hazırlanan nihai hacimdeki formülde iki kez yıkayın. Hücreleri, ışıktan koruyarak buz üzerinde 30 dakika boyunca uygun bir sekonder antikor ile işaretleyin ve ardından az önce gösterildiği gibi PBS artı FBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri saymak için peletleri taze PBS ve FBS içinde tekrar süspande edin.Kompansasyonu ayarlamak için, florafor başına bir adet steril fax tüpüne üç damla polistiren mikroküre ve her tüpe ilgili floraforun bir mikrogramını ekleyin. Mikroküreleri oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 15 dakika inkübe edin. Ardından mikroküreleri üç mililitre PBS ve FBS ile yıkayın ve süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın.Mikroküre peletlerini 250 µL PBS ve FBS içinde yeniden süspande edin ve işaretlenmemiş örnek tüpünü akış sitometresine yerleştirin. Akış sitometresi yazılımında deney (experiment), kompanzasyon kurulumu (compensation set up) seçeneklerini belirleyin ve kompanzasyon kontrollerini oluşturun. Görüntülenen listeden florafor spesifik kontrollerini ekleyin ve Tamam'a (OK) tıklayın. İleri saçılan (forward scattered) ve yan saçılan (side scattered) ışığı doğrulayın ve başlangıç popülasyonunu kapılayın (gate).Ardından negatif kontrol tüpünü sitometreye yerleştirin ve yükle (load) düğmesine tıklayın. İlgi duyulan popülasyonun veya P1'in görüntülendiğini doğrulayın ve popülasyonu seçin. P1 kapısına (gate) sağ tıklayın ve kompanzasyonu hesapla (calculate compensation) seçeneğini belirleyin.Ardından veri kaydet'e tıklayın. Kayıt tamamlandığında, tüpü çıkarmak için boşalt'a tıklayın ve kompanzasyon kontrollerini ayarlamak için bir sonraki kontrol tüpünü yerleştirin. Tüm kontrol örnekleri kaydedildiğinde, ilk deneysel tüp için ileriye saçılma ile yan saçılma grafiği oluşturun ve P1 popülasyonunu kapılayın.Ardından, yan saçılım yüksekliği ile yan saçılım genişliği pseudo renkli grafiğini açın ve tekil hücreleri kapılayın. Tekil hücreleri kullanarak, ileri saçılım yüksekliği ile ileri saçılım genişliği grafiği oluşturun ve dubletleri dışlamak için kapılama yapın. Daha sonra, monositleri ayıklamak için bir CD48 ile CD90.2 pseudo renkli grafiği oluşturup CD90.2 pozitif CD48 negatif hücreleri kapılayın ve bunu, herhangi bir amakrin hücre kontaminasyonunu gidermek için bir CD57 ile CD15 pseudo renkli grafiği ile takip edin.Şimdi, sıralama düzeni sayfasında örnek için toplanacak popülasyonları tanımlayın ve hücreleri sıralayın. Sıralamanın sonunda, izole edilen hücre popülasyonunun saflığını doğrulamak için 2,5 × 10⁴ hücreli bir alikot kullanın. Retinaların hücre süzgecinden geçirilmesinin ardından, hücre izolasyon prosedürü sırasındaki aksonotomi nedeniyle retinal ganglion hücreleri karakteristik morfolojilerini kaybetmiş olsa bile, birçok iç retinal hücre görselleştirilebilir.Klasik boya negatif, CD48 negatif yüzey fenotipi, fare retinal ganglion hücrelerini tanımlamak ve izole etmek için yeterli değildir; çünkü bu hücreler amakrin, müller, bipolar, horizontal fotoreseptör ve retinal pigment epitelyal hücrelerle ilişkili genleri eksprese ederler. Sıralanan hücreler ayrıca synuclein gamma, BRN3A, TUJ1 ve RBPMS gibi retinal ganglion hücresi ile ilişkili hücre içi markerları da eksprese etmekte olup, bu markerların hücre içi lokalizasyonu görüntüleme akış sitometrisi ile doğrulanmıştır. Sıralanan hücrelerin bir kısmı, in vitro hücre kültüründen sonra retinal ganglion hücresi morfolojisi sergilemeye başlar.Ayrıca, yüksek derecede zenginleştirilmiş ayrıştırılmış hücre popülasyonunun kantitatif PCR analizi, retinal ganglion spesifik hücre içi markerları kodlayan genlerde birçok kat artış olduğunu ortaya koymaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütülürse altı saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken; hücre süspansiyonunuzu steril tutmayı, antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için hücre süspansiyonundaki FC reseptörlerini bloke etmeyi ve hücre ayrıştırma detaylarını veya stratejisini hücre ayrıştırıcı operatörü ile görüşmeyi hatırlamanız önemlidir.Bu prosedürün ardından, gen ekspresyon profillemesi hakkında ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Hücre ayırıcı gibi özel ekipmanlarla çalışmanın, son derece uzmanlaşmış bir operatör gerektirdiğini unutmayın. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, görme alanı araştırmacılarının retinal ganglion hücrelerindeki hayatta kalma ve ölüm mekanizmalarını anlamalarına ve görme yetisinin korunması için yeni terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olan yolu açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, birincil fare retinal ganglion hücrelerinden zenginleştirilmiş homojen bir popülasyonun nasıl izole edileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Bu video, akış sitometrisi kullanarak murin primer retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) izole etme prosedürünü gösterir. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel RGC'lerin kaybından kaynaklanan görme keskinliğindeki büyük düşüşü daha iyi anlamak amacıyla RGC'lerin gelecekteki çalışmalarına izin verir.

Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralaması Kullanılarak Murin Retinal Ganglion Hücrelerinin İzole Edilmesi

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Bu protokol, tüm retina montajlı fare retinasını izole etme ve tüm retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) etiketlemek için immün boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklar. İşlemi, yapay zeka tabanlı yazılım kullanılarak RGC'lerin görüntülenmesi ve otomatik olarak sayılması takip eder ve bu da tüm fare retinasındaki RGC'leri ölçmek için basit, hızlı ve doğru bir yöntem sağlar.

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Bu makale, neonatal Sprague-Dawley (SD) sıçanlarından primer retinal Müller hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Prosedür, göz kürelerinin enükleasyonunu, retina dokusunun diseksiyonunu, hücrelerin çıkarılmasını ve tanımlanmasını ve sonraki hücre kültürü için temel hususları içerir.

Sprague-Dawley (SD) Sıçanlarından Primer Retinal Müller Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin akış sitometresi ile primer sıçan retinal ganglion hücrelerinin izolasyonunu. Bu standart yöntem, retinal dejeneratif hastalıklarda görme keskinliği kaybının mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir kaynak sunar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Daha fazla video keşfet