Sıçan Memesi Bezinde Dallanma Yoğunluğunun Nicelleştirilmesi Sholl Analiz Yöntemini Kullanarak Bütünüyle Tutturulur

Bu bilgisayar destekli yöntemin genel amacı, meme bezi bütün bağlama (whole-mount) görüntülerine modifiye edilmiş bir Sholl analizi uygulayarak, kemirgenlerde iki önemli gelişimsel gösterge olan meme bezi dallanma yoğunluğunu ve dallanma azalmasını objektif olarak ölçmektir. Bu yöntem, kimyasal maruziyetlerin meme bezi gelişimini nasıl değiştirebileceği gibi meme bezi biyolojisi alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, meme bezi gelişiminin temel özelliklerini objektif olarak ölçmek için açık kaynaklı yazılımlar kullanmasıdır.

Bu prosedür için, sabit bir büyütmede glandüler epitelyumu gösteren bütün mount görüntüleri hazırlayın. Başlamak için ImageJ'de bir görüntü açın. Ardından, serbest el (freehand) aracını seçin.

Bezi epitelin etrafını çizin ve çevresindeki alanı temizleyin. Ardından, lenf düğümünün etrafını çizin ve görüntünün bu kısmını kesme komutuyla kaldırın. Görüntünün arka planı siyahsa, beyaza dönüştürülmelidir.

Düzenle, ardından Seçenekler ve sonra Renkler'e tıklayın. İletişim kutusunda, arka plan seçenekleri açılır menüsünden beyazı seçin. Arka plan siyah kalmaya devam etse bile, görüntü işlenirken beyaz olarak kabul edilecektir.

Şimdi, renk kanallarını üç adet sekiz bitlik gri tonlamalı görüntüye ayırın. Ardından, genellikle mavi kanal olan, en iyi kontrasta sahip kanalı seçin. Şimdi, seçilen renk kanalından arka planı çıkarın.

Ardından, istenen parametrelerin seçilmesine ve değişikliklerin önizlenmesine geçin. Diyalog kutusundaki açık renkli arka planı kontrol edin ve önizleme yapın, ardından istenen kontrast elde edilene kadar piksel sayısını ayarlayın. Ek kontrast gerekirse, Unsharp Mask seçeneğini kullanın.

İletişim kutusundaki Önizleme'yi (Preview) kontrol edin ve istenen kontrast elde edilene kadar piksel yarıçapını ve maske ağırlığını ayarlayın. Keskinleştirme maskesi (unsharp mask) filtresini uyguladıktan sonra, filtre tarafından oluşturulan kenarlığı kaldırın. Araç çubuğundaki çift kırmızı ok düğmesine tıklayın ve Çizim Araçlarını (Drawing Tools) seçin.

Ardından, Silgi aracını seçin. Silgi aracı düğmesine sağ tıklayarak çapını ayarlayın, ardından kenarlığı silmek için farenin sol düğmesine basılı tutun. Silme işlemi sırasında yalnızca bir seviye Geri Al işlemine izin verilir, bu nedenle dikkatli olun.

Filtrelerden birini uyguladıktan sonra, geri kalan gürültüyü manuel olarak temizleyin. Orijinal görüntünün bir kopyasına bakarak ve önce araç çubuğundaki çift kırmızı ok düğmesine tıklayıp çizim araçlarını seçerek belirlenen gürültüleri kaldırın. Ardından silgi aracını seçin.

Silgi aracı düğmesine sağ tıklayarak çapını ayarlayın. Ardından, gürültüleri silmek için sol fare düğmesini basılı tutun. Silme işlemi sırasında yalnızca bir seviye geri alma işlemine izin verildiğinden dikkatli olun.

Ardından, görüntü eşiğini ayarlayın. Bezin görüntüsünü iyileştirmek için minimum ve maksimum eşik değerlerini ayarlamak üzere kaydırıcıları hareket ettirin. Daha sonra, Uygula'ya tıklayın.

İki yöntemden birini kullanarak ek gürültüleri otomatik olarak giderin. İlk seçenek despeckle komutunu kullanmaktır. İkinci seçenek ise remove outliers komutunu kullanmaktır.

Bu işlem, bir piksel kullanıcı tarafından tanımlanan bir eşik değerinden daha fazla saptığında, o pikseli yalnızca hemen çevresindeki piksellerin medyanı ile değiştirir. Şimdi, karşılaştırma için orijinal görüntüyü kullanarak, eşikleme ve gürültü giderme ile kaldırılan bezsi epitel kısımlarını yeniden oluşturun. Görüntüyü yeniden oluştururken, görüntünün bütünlüğünü korumak için bunu dikkatli ve minimum düzeyde yaptığınızdan emin olun.

Çizim araçlarından sprey kutusu aracını seçin. Araç boyutunu ayarlamak için sprey kutusu aracı düğmesine sağ tıklayın, ardından farenin sol düğmesini kullanarak bezin eksik bölümlerini dikkatlice doldurun. Sonrasında, Sholl analizi için bezin iskeletleştirilmiş bir görüntüsünü oluşturun.

Öncelikle, görüntüyü ikili (binary) formata getirin. Ardından, görüntüyü iskeletleştirin. Bu işlem, görüntü tek piksellik bir şekle indirgenene kadar ikili görüntünün kenarlarındaki pikselleri tekrar tekrar temizler.

Şimdi, eşikleme ve iskeletleme tarafından oluşturulan boşlukları kapatmak için görüntüyü bir kez genişletin. Ardından, "farklı kaydet" komutunu kullanarak görüntüyü yeni bir dosya olarak kaydedin. Son olarak, iki görüntüyü üst üste bindirerek iskelet görüntüsünün orijinalle olan doğruluğunu kontrol edin.

Resim ekleme iletişim kutusunda, iskelet resmini seçin ve opaklığını %30 olarak ayarlayın. Ardından, ileride başvurmak üzere bindirme katmanını yeni bir resim olarak kaydedin. Başlamak için, bir iskelet resmi açın ve resmi ikili (binary) formata dönüştürün. Şimdi, resim ölçeğini tanımlayın.

Milimetre başına piksel sayısını girin, ardından hem bilinen mesafeyi hem de piksel en-boy oranını bir olarak ayarlayın, uzunluk birimi için milimetreleri girin ve ölçeği tüm görüntülere uygulamak için genel seçeneği etkinleştirin. Ardından, çizgi çizim aracını kullanarak Sholl analizi için bitiş yarıçapını belirleyin. Primer kanalın başlangıcından glandüler epitelin en distal noktasına kadar bir çizgi çizin.

Ardından M tuşuna basın; hattın mesafesi raporlanacaktır. Şimdi, Sholl analizi için ayarları girin. İlk olarak, kabukların tanımı (definition of shells) bölümündeki seçenekleri belirleyin, başlangıç yarıçapını 0.00 millimeters olarak ve yarıçap adım boyutunu 0.1 millimeters olarak ayarlayın.

Numune sayısını bir olarak ayarlayın. Az önce çizilen hattın uzunluğu, bitiş yarıçapı alanına otomatik olarak girilir. Yarıçap başına çoklu numune seçenekleri için, entegrasyonda ortalamayı seçin.

Betimleyiciler ve eğri uydurma seçenekleri için, çevreleme yarıçapı kesme değerini bir olarak ayarlayın. Birincil dal sayıları için başlangıç yarıçapından çıkarım yap seçeneğini belirleyin; doğrusal ve en iyi uydurma derecesi seçeneklerini seçin. Ardından, normalizasyonsuz profiller altında, en bilgilendirici seçeneğini belirleyin.

Şimdi, sholl yöntemleri bölümü altında, normalize profil için alanı seçin. Son olarak, çıktı bölümünde, kesişimlerin ısı haritasını oluşturmak için kesişim maskesi oluştur seçeneğini işaretleyin. Şimdi, halkalı görüntünün önizleme penceresini açın ve analiz alanını doğrulayın.

Her şey uygun görünüyorsa, analizi çalıştırmak için tamam'a tıklayın. Analizin çalıştırılması; bir sholl profili lineer penceresi, bir sholl profili yarı-logaritmik penceresi, tüm sholl çıktı değerlerini içeren bir sholl sonuçları penceresi ve polinom tarafından belirlendiği üzere her bir yarıçaptaki kesişim sayısını sağlayan bir dosya adı sholl profilleri penceresi oluşturacaktır. MEA'yı ölçmek için ImageJ'deki bezin iskelet görüntüsü üzerinden çalışın.

Poligon aracını açın ve bezin çevresine bir poligon çizin. Çizgi segmentleri eklemek için fareye tıklayın. Tüm epitel alan çevrelendiğinde, poligonu kapatmak için çift tıklayın.

Ardından, sonuçlar penceresini açmak için M tuşuna basın. Alan sütunundaki değer MEA'ya karşılık gelir. Eğer bez epitelyumu lenf düğümünün ötesine uzanmışsa, dallanma yoğunluğunu hesaplarken lenf düğümü alanını MEA'dan çıkarın.

Lenf düğümü alanı, MEA ile aynı şekilde ölçülebilir. Tanımlanan yöntemler kullanılarak, yaşları eşleştirilmiş iki sıçan grubu analiz edilmiştir. B grubundaki hayvanlara, meme bezinin erken gelişimine neden olduğu bilinen bir kimyasal uygulanmıştır.

Bezin yarıçapı boyunca dal kesişim sayısının grafiğe dökülmesi, sonuçlardaki varyasyonu ortaya koymaktadır. Sholl analizi sonuçları, grupların ortalama kesişim sayısında belirgin bir fark olduğunu göstermiştir. Ancak, sonuçlar hakkında çıkarımlarda bulunabilmek için kesişim verileri meme bezi alanına göre normalize edilmelidir.

Sholl analizi ve meme bezi epitel alan ölçümleri, karşılaştırmalı analiz yapmak için yararlı iki fizyolojik parametre sağlar. Glandların boyutunun tedavi grubunda çok daha büyük olduğu açıkça görülmektedir. Sholl analizi, dallanma yoğunluğu ve k değerinin hesaplanmasında kullanılan Sum N değerini verir.

Tedavi grubunda, daha yüksek ortalama dallanma yoğunluğu ve daha düşük dallanma azalma hızını yansıtan daha düşük ortalama k değeri, tedavi edilen hayvanların tedavi edilmeyen hayvanlara göre daha gelişmiş bezlere sahip olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, gürültü gideriminin en kritik adım olduğunu unutmamak önemlidir. Çok fazla veya çok az temizleme yapmak, bezin bütünlüğünü bozabilir ve sonuçları saptırabilir.

Bu yöntem kullanılırken, işleme tertemiz bir meme tüm doku örneği ile başlamak önemlidir. Yırtıklar veya katlanmalar gibi kusurlar varsa, doğru bir iskeletleştirilmiş görüntü elde edilemez. Doğru bir iskeletleştirilmiş görüntü oluşturmak sabır ve pratik gerektirir.

Bu teknik ustalığa erişildikten sonra, düzgün bir şekilde uygulandığında analiz edilen bez başına 15 ila 20 dakikada tamamlanabilir.