MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Bu prosedürün genel amacı, ilk kristalizasyon tarama koşullarından yüksek kaliteli kristaller üretmektir. Kristaller, proteinlerin, DNA'nın, RNA'nın ve komplekslerinin yapılarını incelemek için kullanılabilir. Makromoleküler yapılarla ilgili bir şey giderek daha zor hale geldi.

Ve çok çeşitli başlangıç koşullarının sağlanması, numune ve kristal optimizasyonu ihtiyacını azaltırken faydalı kristallerin verimini artırır. İki tam otomatik sistem olan LMB, nanolitre damlacıklarda 1.920'ye kadar buhar difüzyon deneyinin hazırlanmasını kolaylaştırır. Kısaca, kullanıcıların nanolitre dağıtıcının, mürekkep püskürtmeli yazıcının ve yapışkan plaka kapatıcının temel işlevlerine ve bakımına zaten aşina oldukları varsayılmaktadır.

Prosedürü gerçekleştirmeden önce, sistemin robotlarının başlatıldığından ve kontrol yazılımlarının açık olduğundan emin olun. Ana program başlamadan yaklaşık 30 dakika önce tüp soğutma taşıyıcısının soğutucusunu açın. Plaka kapatıcının motorlu SBS taşıyıcısına bir test plakası yerleştirin.

Plaka kapatıcıyı çalıştırın ve filmin düzgün şekilde uygulandığını kontrol edin. Plaka kapatıcının hazır olduğunu doğrulamak için bu testi iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra sıvı işleyicinin ana kabına 20 litre deiyonize su ekleyin.

%20 etanol durulama çözeltisinden oluşan daha küçük kaptan kaplin eklerini ayırın ve ekleri ana kaba bağlayın. Mürekkep püskürtmeli yazıcının dokunmatik ekranına uygun ekran adını girin. Ardından, dönen dönüşü tetiklemek için dönen kapıyı açıp kapatın.

İlk yığın kendini gösterdiğinde kapıyı açın. İlk yığını, her biri birinci sütunu dışarı bakan 22 kristalizasyon plakası ile tamamen yükleyin. Sonraki iki yığını da aynı şekilde tam olarak yükleyin.

Kalan altı plakayı dördüncü yığının en yüksek konumlarına yerleştirin, ardından atlıkarınca kapısını kapatın. Soğutucu ekranının 14 santigrat dereceyi gösterdiğini doğrulayın. Seçilen tarama kitlerini bir dakika boyunca nazikçe ve tekrar tekrar ters çevirin.

Ardından, sıvı işleyicinin ön panelini açın. Tüpleri açın ve standart 96 kuyulu düzende soğutma taşıyıcısına yerleştirin. Her bir tüpü taşıyıcıya yerleştirdikten sonra, kapağını aynı 96 oyuklu düzende tepsiye yerleştirin.

Sistem 1'i kullanırken, tüplerin doğru şekilde düzenlenip düzenlenmediğinin çapraz kontrol edilmesini sağlamak için etiket uçları 96 oyuklu düzende tepsiye yerleştirilir. Boru konumlarını çapraz kontrol edin ve ardından tüm boruların düz olduğundan ve taşıyıcıya yerleştiğinden emin olun. Ardından ön paneli kapatın.

Liquid handler yazılımının Startup (Başlangıç) penceresinde Run Maintenance (Bakımı Çalıştır) öğesini seçin ve Flushing (Yıkama programı) programını açın. %20 etanolü sistemden temizlemek ve sıvı dağıtım uçlarının dış kısımlarını yıkamak için programı çalıştırın. Temizleme işlemi tamamlandığında, Başlangıç'a dönmek için İptal'e tıklayın.

Mevcut Bir İşlemi Çalıştır'ı seçin ve Seçiminizi Başlatın'a tıklayın. MRC Kiti dağıtım programını açın. Yapılandırma ekranında Örnekler için 18" doldurun ve programı çalıştırın, İlk dört plaka etiketlenirken, doldurulurken ve mühürlenirken sistemi izleyin.

İlk dört plakanın hazırlığı tamamlanana kadar sistemi gözetimsiz bırakmayın. 72 plakanın tümü hazırlandıktan ve atlıkarıncaya geri yerleştirildikten sonra, kaplin eklerini deiyonize su kabından %20 etanol kabına geçirin. Daha önce olduğu gibi aynı işlemi kullanarak başlangıç temizleme programını çalıştırın.

Soğutucuyu kapatın ve boş tarama kiti tüplerini atın. Hazırlanan 72 plakayı atlıkarıncadan dikkatlice çıkarın. Yanlış doldurulmuş veya kötü kapatılmış plakaları atın.

Kullanıma hazır plakaları 10 santigrat derecede saklayın. Öncelikle sistemin robotlarının açık olduğundan, nanolitre dağıtıcının yazılımı açık olarak başlatıldığından ve sıvı işleyicinin yöntem yöneticisinin açık olduğundan emin olun. Ana program başlamadan yaklaşık 15 dakika önce mikrotüp soğutma taşıyıcısını açın.

Plaka kapatıcının motorlu SBS taşıyıcısına bir test plakası yerleştirin. Plaka kapatıcıyı çalıştırın ve plakanın düzgün şekilde kapatıldığından emin olun. Plaka kapatıcıyı üç kez test edin.

Ardından, bir test plakasında 100 nanolitrelik test çözeltisi damlacıkları ayarlamak için nanolitre dağıtıcıyı çalıştırın. Burada, nanolitre dağıtıcı tarafından üretilen 100 nanolitrelik bir damlacığın hafif bir mikrografı ve kırmızı boya ile yapılan test çözeltisi gösterilmektedir. Nanolitre dağıtıcı yazılımını kapatın ve şerit tutucu bloğunu güverteden çıkarın.

Daha sonra, özel olarak tasarlanmış bir plaka tutucuya, koşullarında en yüksek nispi miktarda uçucu reaktife sahip önceden doldurulmuş 96 oyuklu bir kristalizasyon plakasına yerleştirin. Yapışkan filmi plakadan çıkarın. Sıvı tutucu ön panelini açın ve mühürsüz plakayı ilk kayar taşıyıcının arkasındaki güverteye yerleştirin.

Plakayı bir SBS alüminyum kapakla örtün. Kapağın karşı köşesine hafif bir baskı uygulayarak kapağı taşıyıcının sol arka köşesine doğru yerleştirin. Sistem 2'yi kullanırken, önce önemli miktarda uçucu reaktif içeren tarama kitleri işlenmelidir.

Bu, SBS uçlarında yoğuşma oluşmasını önler, bu da uçların otomatik olarak taşınmasını veya plaka sızdırmazlığını etkileyebilir. Mührü açın, kayar taşıyıcılara yükleyin ve kalan 19 plakayı aynı şekilde örtün, en çok uçucu koşullardan en az uçucu koşullara kadar çalışın. Mikrotüp soğutma taşıyıcısı, yeşil ışıkla gösterildiği gibi 4 santigrat dereceye ulaştığında, kapağını çıkarın.

En az 440 mikrolitre protein örneği içeren bir mikrotüpün kapağını kesin. Sıvı algılama sistemini etkileyeceğinden, numunenin menisküsün üzerinde köpük olmadığından emin olun. Tüpü mikrotüp soğutma taşıyıcısının 1. konumuna yerleştirin.

Plaka hareketli adaptör taşıyıcısının önündeki sıvı işleyici güvertesine bir PCR plakası yerleştirin. Ardından ön paneli kapatın. Liquid handler metodu yönetim arayüzünde Setup Plates (Kurulum Plakaları) öğesini seçin.

Her iki sistemin başlatılmasını izleyin ve plaka tipi ve her koşul için damla sayısı, damla boyutu, işlenecek ilk plakanın konumu ve plaka sayısı dahil olmak üzere çalışma parametrelerini doldurun. Desteyi yükleme konusunda yardım isteyip istemediğiniz sorulduğunda Hayır'a tıklayın. Boş uç rafı olmadığını kontrol ettikten sonra Tamam'ı tıklayın. Çalıştırma için yeterli ipucu olup olmadığını kontrol ettikten sonra Tamam'ı tıklayın. Gerektiğinde, bahşiş yönetim sistemini güncelleyin ve Tamam'a tıklayın. Nanolitre dağıtıcı güvertesinin şerit tutucu bloğundan uzak olduğundan ve taşıyıcının 50 mikrolitrelik uç yığınlarının arkasında olduğundan ve alüminyum SBS kapaklarından uzak olduğundan emin olun.

Gerekli diğer tüm bileşenlerin hazır olduğunu iki kez kontrol edin ve ardından işlemi başlatın. Nanolitre dağıtıcı ilk plakadaki damlaları ayarlarken sistemi izleyin ve plaka kapatıcı daha sonra plakayı kapatır. İlk plakanın hazırlanması tamamlanana kadar sistemi gözetimsiz bırakmayın.

20 plakanın tümü kristalleşme damlacıkları ile hazırlandıktan ve otomatik olarak kayar taşıyıcılara geri döndükten sonra, ön paneli açın ve plakaları yavaşça çıkarın. Kristalleşme için saklamadan önce plakaların doğru şekilde kapatıldığını kontrol edin. SBS kapaklarını, saklama için sıvı işleyicinin sol tarafına istiflemeden önce %20 etanol çözeltisi ile temizleyin.

PCR plakasını ve mikrotüpü atın. Mikrotüp soğutma taşıyıcısını kapatın ve yoğuşmayı silin. Daha fazla yoğuşmayı emmek için soğutucu yüzeyinin üzerine bir kağıt havlu bırakın.

Ardından taşıyıcı kapağını yerine takın ve ön paneli kapatın. OmpF ve MreB başlangıçta bu tam otomatik protokoller kullanılarak tarandı. X-ışını kırınımı için yeterli kalitede OmpF kristalleri, LMB 7 plakasının A4 kuyusunda bulundu.

MreB'nin kırınım kalitesi kristalleri, LMB 20 plakasının D12 kuyusunda bulundu. Ön yakıt plakalarının 10 santigrat derecede saklanması, kristalleşme koşullarının bozulmasına ve yoğuşma ile ilgili sorunlara neden olabilecek donma ve 4 derecede depolamayı önlemek için bir uzlaşmadır. Bu şekilde saklandığında, plakalar dört ila beş ay içinde kullanılabilir.

Sistem 1 ile yılda 4 ila 8.000 LMB plaka üretilir ve daha sonra ilk tarama için kullanılır. Beklenen ciro çok daha düşük olduğunda protokoller farklı şekilde optimize edilmelidir. Tüm ön yakıt plakaları setimiz normalde yeni bir numune için büyük bir başlangıç ekranı olarak kullanılır.

Bununla birlikte, çok daha spesifik numune gereksinimleri için daha az plaka seçilebilir. Damlacıklar hazırlandıktan sonra, plakalar düşük titreşimli raflarda, sıcaklık 4 veya 18 santigrat derecede sıkıca kontrol edilerek saklanır. Deneyler kaydırma ışık kaynağı mikroskopları ile değerlendirilir.

Kristallerin doğasını dikkatli bir şekilde araştırdıktan sonra, koşullar arasındaki özellikler ve benzerlikler LMB veya C6 Screen veritabanları gibi web tabanlı araçlarla analiz edilebilir. Kristalleşme koşullarının müteakip optimizasyonu hala gerekli olabilir. 4 köşeli yöntemler ve eklemeli tarama ile ek otomatik protokoller makalemizde açıklanmıştır.