Name: MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin, makromoleküllerin yüksek kaliteli kristallerini üretmek için buhar difüzyon deneylerinde nanolitre damlacıkların otomatik hazırlanması yöntemini. Bu protokol, protein, DNA ve RNA yapı çalışmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MRC-LMB kristalizasyon tesis tür tıbbi araştırma Konseyi (İngiltere) tarafından desteklenmektedir. Üyeleri LMB desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den KBB ve Pat Edwards (yapısal çalışmalar), Steve Scotcher ve diğer üyeleri mekanik atölye, Neil Grant ve Jo Westmoreland (görsel), Paul Hart ve Tom Pratt (BT). Biz de Steve Elliot (Tecan, Birleşik Krallık), Mitchell Stuart ve Heather Ringrose (Hamilton Robotik, İngiltere), Paul Thaw, Robert Lewis ve Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, İsviçre), George Stephens ve Donald Ogg (Alphabiotech, teşekkür etmek istiyorum Birleşik Krallık), Neil Williams (kurulmus Imaje, İngiltere) ve Graham Harris (Cleveland Ajansı) teknik yardım için.

1. iki tam otomatik sistemleri (başlangıç tarama)
<ol><li>
Sistem 1: 72 96-şey kristalizasyon plakaların hazırlık setleri (LMB plakaları) eleme ile dolu
	<ol>
<li>Yordamı gerçekleştirmeden önce sistemin robotlar başlatılır ve kendi kontrol eden yazılım açık olduğundan emin olun. Tüp soğutma taşıyıcı soğutucu üzerinde yaklaşık 30 dakika ana program başlamadan açın.</li>
		<li>Bir testi plaka plaka mühürleyen motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. Plaka mühürleyen çalıştırın ve film düzgün uygulandığını onaylayın. Plaka mühürleyen hazır olduğunu doğrulamak için bu testi iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Daha sonra 20 litre deiyonize su sıvı işleyicisi ana konteyner için ekleyin. Kaplin ekler küçük kapsayıcıdan (% 20 etanol durulama çözüm) kesmek ve ekler için ana kapsayıcı bağlanın.</li>
		<li>Uygun ekran adını (Tablo 1) mürekkep püskürtmeli yazıcı dokunmatik ekranda girin. O zaman, açın ve carousel döndürmeyi tetiklemek için carousel kapıyı kapat. Kapıyı açık ne zaman ilk yığın kendini göstermektedir.</li>
		<li>Tam 22 kristalizasyon levha, her biri 1 sütun bakan ilk yığınıyla yük dışarı. Tam olarak aynı şekilde sonraki iki yığınları yükleyin.</li>
		<li>Kalan 6 plakaları dördüncü yığın en yüksek konumlarda yükleyin. O zaman, atlıkarınca kapıyı kapat.</li>
		<li>Chiller görüntü 14 ° C. bulunduğunu doğrulayın Yavaşça ve sürekli olarak seçilen tarama kitleri için 1 dakika tersine çevirin. Sonra ön panelindeki sıvı işleyicisi açın.</li>
		<li>Tüpler açın ve standart 96-şey düzen (A1, A2, vb) göre soğutma taşıyıcıya yerleştirin. Her tüpün içinde taşıyıcı üzerine yerleştirerek, kapağı aynı 96-şey düzen bir tepsiye yerleştirin.</li>
		<li>Çapraz kontrol tüp konumlandırır ve tüm tüpler düzeyi ve taşıyıcı olarak yerleşmiş emin olun. Sonra ön paneli kapatın.</li>
		<li>'Başlangıç' penceresinde sıvı işleyicisi yazılım 'Çalıştır bakım' seçin ve reçeteye göre sarf programı açın. % 20 etanol sistemden temizlemek için ve sıvı dağıtımı ipuçları outsides yıkamak için çalıştırın.</li>
		<li>Kızarma tamamlandığında, '' Başlangıç' dönmek için İptal' i tıklatın. 'Varolan bir işlemi çalıştırmak' seçip 'seçiminizi Başlat' düğmesini tıklatın. 'MRC seti dağıtımı' programını açın. 'Örnekleri' yapılandırma ekran ve programı çalıştırmak için '18' doldurun.</li>
		<li>İlk dört tabak etiketli, dolu mühürlü ve sistem izlemeniz.</li>
		<li>Bir kez tüm 72 plakaları hazırlanan ve carousel geri yerleştirilir, kaplin ekler ana kapsayıcıdan küçük kapsayıcıya geçin. 'Kadar floş Başlat' programını çalıştırın (bkz. Adım 1.1.10).</li>
		<li>Chiller açmak ve boş atmak kiti tüpler eleme. Dikkatli bir şekilde 72 hazırlanan tabak atlıkarınca çıkarın. Yanlış dolu veya kötü mühürlü plakalar atmak. Kullanıma hazır plakaları 10 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistem 2: 20 LMB tabak içinde tek bir örnekten kristalizasyon damlacıkları kadar (100 nL protein + 100 nL condition) ayarlama
	<ol>
<li>İlk olarak, sistemin robotlardır yazılımının açık nanoliter dağıtıcısı başlatılır ve sıvı işleyicinin yöntemi Yöneticisi açık olduğundan emin olun. Microtube soğutma taşıyıcı ana program başlamadan 15 dakika kadar çevirin.</li>
		<li>Bir testi plaka plaka mühürleyen motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. Plaka mühürleyen çalıştırın ve plaka düzgün mühürlü doğrulayın. Plaka mühürleyen test üç kere.</li>
		<li>Daha sonra test çözüm damlacıkları 100-nL bir testi plaka ayarlamak için nanoliter dağıtıcı çalıştırın. Mikroskop altında damlacıkları doğru şekilde ayarlandığını denetleyin. Nanoliter dağıtıcı yazılım kapatın ve şerit-sahibi blok güverteden kaldır.</li>
		<li>Ardından, özel tasarlanmış plaka tutucu Ekle ( Temsilcisi sonuçlarıgörmek: kristalizasyon geliştirdiler LMB adlı) kendi koşulları (Tablo 1) geçici reaktifler en yüksek göreli miktarı LMB plakalı. Yapıştırıcı film plaka kaldırın.</li>
		<li>Sıvı işleyicisi ön panel açmak ve ilk sürgülü taşıyıcı arka güvertede mühürsüz tabak yerleştirin (taşıyıcıları kayma çıkardı kolay erişim için).</li>
		<li>Plaka bir SBS alüminyum kapaklı kapağı. Taşıyıcı arka sol köşesine doğru kapak kapak karşı köşeye hafif basınç uygulayarak yerleşmek.</li>
		<li>PIN'i, sürgülü taşıyıcıları yük ve kalan 19 çalışma üzerinden en az uçucu koşulları için aynı şekilde kuruyucu. Microtube soğutma taşıyıcı bir yeşil ışık tarafından belirtildiği şekilde 4 ° C'de olduğunda, onun kapağını çıkarın.</li>
		<li>Protein örneği (Tablo 2) (en az) 440 µL içeren bir microtube kapağı kesti. Bu sıvı algılama sistemi ile müdahale edecek gibi örnek köpüksüz Menisküs, yukarıda olduğundan emin olun. Tüp pozisyon 1. microtube-soğutma taşıyıcı yerleştirin.</li>
		<li>Plaka Taşıma bağdaştırıcısı taşıyıcı önünde sıvı işleyicisi güvertede bir PCR tabak koyun. Sonra ön paneli kapatın.</li>
		<li>Güverte yükledikten sonra nanoliter dağıtıcı güverte şerit-tutucu bloğunu açıktır ve 50 µL ipucu yığınlarının arkasında taşıyıcıları alüminyum SBS kapakları açık olun.</li>
		<li>Sıvı işleyicisi 'Yöntemi Yönetimi' arabirimi 'tabak kurulum' seçin. Her iki sistemin başlatma izlemek ve çalışma parametreleri doldurmak. Yöntemi yönetim arabirimi (istemleri, rakamlar ve hazırlık ile yardımcı bir ipucu-yönetim sistemi) yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Tüm bileşenlerin hazır ve o zaman başlamak belgili tanımlık oluşum gerekli bir kez daha denetleyin.</li>
		<li>Nanoliter dağıtıcı damla ilk plaka ve plaka mühürleyen daha sonra ayarlar gibi Sistem İzleyicisi plaka mühürler.</li>
		<li>Bir kez tüm 20 plakaları kristalizasyon damlacıkları ile hazırlanan ve otomatik olarak kayar taşıyıcılara iade, ön panel açmak ve yavaşça plakayı çıkarın. Kristalizasyon için depolamadan önce tabakları düzgün mühürlü kontrol edin.</li>
		<li>% 20 etanol çözüm SBS kapaklı depolama sıvı işleyicisinin sol taraftaki istifleme önce temiz. PCR plaka ve microtube atın.</li>
		<li>Microtube soğutma taşıyıcı açmak ve uzakta yoğunlaşma silin. Bir kağıt havlu daha fazla yoğunlaşma emmek için soğutucu yüzeyin üstüne bırakın. O zaman, taşıyıcı kapağını ve ön paneli kapatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimizasyon koşulları
<ol><li>
Şırınga bağlı sıvı işleyici: konsantrasyonları kristalizasyon plaka (4-köşe yöntemi) rezervuar içine iki doğrusal gradyanlar üreten.
	<ol>
<li>Öncelikle, sıvı işleyicisi açık ve onun bilgisayar yazılımı açık başlatıldı emin olun.</li>
		<li>'GRADYAN' sekmesi: gerekli program açıkken, kristalizasyon plaka türü ve son hacim rezervuar (Tablo 3) seçin. Gelişmiş ayar 'maksimum çekim vol' için 3000 için 6.000 düşürülmelidir [isopropanol] > %10 v/v ve [MPD] > %20 v içeren çözümler kullanırken / v.
</li>
		<li>Şırınga hazır olun. Bir piston her şırınga (sivri uçlu aşağı) yerleştirin ve şırıngaları arkası robot baş altında belirlenmiş oluklar takabilirsiniz. Bir şırınga (program düzgün bağlı sadece tüm gerekli şırıngaları ile başlar) konumda kilitlemek için saat yönünde çevir.</li>
		<li>Tekneler hazırlayın. Paslanmaz çelik çerçeve çıkarıp tekneler yerleştirin. Soldaki 4 pozisyonlar 4 köşe A, B, C, D. gerekli çözümleri hacimleri her şırınga (üzerinde Tablo 3, 0,5 mL ölü birim görüntülenen birimler eklendi) görüntüleyen 'SET UP' sekmesine geçin karşılık gelir. Köşe çözümler onların anılan sıraya göre tekneler dökün ve çerçeve (çerçeve bulunduğu 2 küçük mıknatıslar güverte ön tarafta bulunan tutar) destenin geri yerleştirin. Zaten güvertede yerleştirildiğinde çözümleri kaplar dökmek için bu adım ile devam etmek için alternatif bir yol değil.
</li>
		<li>Kristalizasyon plaka üzerinde motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin.</li>
		<li>'Aspire edin' tıklayın ve bu adımı (pistonlar kadar onların yolda durdu) tamamlanması bekleyin.</li>
		<li>"Çalıştır" sekmesine geçin ve programı çalıştırın.</li>
		<li>Üzerinde ikmal-in program, geri ayarla'yı sekmesine gidin ve 'Kaldır' ı tıklatın: sistem şırıngaları artık çözümlerinden temizler ve sonra pistons kaldırıncaya kadar. 'Tasfiye' istenen 'Yerine Kaldır'; Bu alt konumda aynı şırınga ile daha fazla çözüm Aspire hazır pistons bırakacaktır.
</li>
		<li>Saat yönünün tersine büküm tarafından şırıngaları kaldırmak.</li>
		<li>Şırınga ve tekneler uygun depo gözündeki atın (veya deiyonize su ve daha sonra yeniden kullanmak üzere % 20 v/v etanol çözüm ile yıka).</li>
		<li>Plaka mühür ve yüksek viskoz çözümleri karıştığında Mikroplaka Mikser 3 dk 1000 RPM veya 10 min için üzerine yerleştirin. Plaka kristalizasyon damlacıkları nanoliter dağıtıcı üzerinde oluşturmak için hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protokolü (kurma kristalizasyon damlacıkları ile katkı ekran önceden doldurulmuş bir 96-şey kristalizasyon plaka) 1 eleme katkı
	<ol>
<li>İlk olarak, koşul ilk %10 (dk. vol. 15 koşul bir konteyner sıvı işleyicisi ile katkı ekrana gelen transfer ederken mL) artışla reaktifler konsantrasyonları ile hazırlayın.</li>
		<li>Sıvı işleyicisi çalıştırmak hazır olduğundan emin olun. 'Tek bir tabak için ' ekran için katkı maddeleri Ekle programı açın (rezervuar birim girin: '72 µL'). İster, rakamlar ve robot seçimlere göre çalışmaya hazır olduğundan emin ile uç-yönetim sistemi (12 x 1000 µL ipuçları gerekli) yardım.
</li>
		<li>-20 ° C-kuluçka makinesi katkı ekranını ve onun alüminyum mühür hemen (kullanım plaka sahibi) kaldırmak sonra plaka sıvı işleyicisi güvertede yer. (Taşıyıcı ön sol içinde bulunan A1-köşe plaka yerleştirilir) bir dikey düzen göre program çalışır. Aynı zamanda da koşulu ile dolu kap yerleştirin. Programı çalıştırın.</li>
		<li>Plaka rezervuarlar doldurduktan sonra Mikroplaka shaker yerleştirin ve programı çalıştırın. Deiyonize su ve % 20 etanol ile durumu yeniden kullanmak üzere konteyner durulayın.</li>
		<li>
Nanoliter dağıtıcı üzerinde damlacıklar ayarlayın. İlk olarak, kristalizasyon plaka (kullanım plaka sahibi) açıldı. O zaman, plaka ve 8-iyi protein Şerit şerit-sahibi blok ilk pozisyonda yer. Kontrol eden yazılım 'Setup' sekmesinde her bileşen güvertede gerçek konumlarını görüntüler. Her yük ile protein örnek gerekli damla boyutu (Tablo 4) göre şeridinin de. Damlacıkları hazırlamak için programı çalıştırmak.
</li>
		<li>Üzerinde ikmal-in program, plaka güverteden kaldır ve hemen kapatın (plaka mühürleyen, 3-inç geniş yapışkan bant kullanın). Şeridi'nde uygun depo gözü atın.</li>
		<li>Boyut, şekil, değerlendirmek ve depolama önce mikroskop altında damlacıkları merkezleme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protokolü (kurma kristalizasyon damlacıkları bir 96-şey kristalizasyon plaka ile yeniden kullanılabilir bir katkı perde) 2 Eleme katkı
	<ol>
<li>İlk, belgili tanımlık katkı perde hazırlamak: 40 dakika oda sıcaklığında erimek için karşılık gelen dondurulmuş 96-şey hücre kültür plaka bırakın. O zaman, 1000 x g 2 min için katkı ekranında santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Koşul (dk. vol. 15 koşul bir konteyner sıvı işleyicisi ile katkı ekrana gelen transfer ederken mL) hazırlayın.</li>
		<li>96-şey kristalizasyon plaka rezervuarlar koşulu ile doldurun. Sıvı işleyicinin, protokolü 1 aynı şekilde devam, 2.2.2 adım ama rezervuar hacmindeki '80 µL' girin.</li>
		<li>Nanoliter dağıtıcı üzerinde damlacıklar (plaka ile birlikte kristalizasyon plaka ve 8-iyi protein Şerit şerit-sahibi blok, Tablo 4ilk pozisyonda katkı ekran içeren) güvertede 3 bileşenleri ile ayarlayın.</li>
		<li>Bir alüminyum levha ile ekran içeren hücre kültür plaka mühür ve -20 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>Boyut, şekil, değerlendirmek ve depolama önce mikroskop altında damlacıkları merkezleme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15325645">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBBZV.pdf">X-Ray Diffraction of Protein Crystals.</a> Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).</li>
<li>Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Structures-A+Series+of+Fortunate+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events.</a> Biophys. J. 95, 1-9 (2008).</li>
<li>Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376864/">Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences.</a> 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/500706">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889891004430">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001317">High-throughput protein crystallization.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).</li>
<li>Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE+high-throughput+crystallization%2C+crystal+imaging+and+recognition+techniques%3A+current+state%2C+performance+analysis%2C+new+technologies+and+future+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).</li>
<li>Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23860256">Membrane protein structure determination-the next generation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).</li>
<li>Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652247">Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+approach+to+initial+crystallization+screening+of+proteins+is+under-sampled%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled.</a> J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).</li>
<li>Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+implementation+of+precise+grid+screens%3A+the+four-corners+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1016/S1535-5535-04-00123-6">Technological Advancements in Liquid Handling Robotics.</a> JALA. 6, 36-40 (2001).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1016/j.jala.2004.04.020">Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology.</a> JALA. 9, 257-261 (2004).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Robot+for+High-throughput+Crystallization+of+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).</li>
<li>Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Success+Rate+of+Protein+Crystallization+by+Random+Microseed+Matrix+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening.</a> J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).</li>
<li>Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+UV+detection+of+protein+crystals+enabled+by+fluorescence+excitation+at+wavelengths+longer+than+300+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).</li>
<li>Szewczak, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Structural+studies+of+the+bacterial+MreBCD+complex%22">Structural studies of the bacterial MreBCD complex</a>. , University of Cambridge, UK. (2016).</li>
<li>Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+dengue+virus+type+1+envelope+protein+in+the+postfusion+conformation+and+its+implications+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion.</a> J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).</li>
<li>Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi+sampling%3A+a+methodical+and+flexible+approach+to+initial+macromolecular+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+%CE%B1-helical+membrane+protein+crystallization%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update.</a> Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MORPHEUS+II+protein+crystallization+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The MORPHEUS II protein crystallization screen.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitting+the+target%3A+fragment+screening+with+acoustic+in+situ+co-crystallization+of+proteins+plus+fragment+libraries+on+pin-mounted+data-collection+micromeshes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).</li>
<li>Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+Implementation+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Protein+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography.</a> JALA. 21, 97-106 (2015).</li>
<li>Zipper, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+to+reduce+evaporation+of+crystallization+droplets+by+using+plate+lids+with+apertures+for+adding+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcrystal+manipulation+with+laser+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microcrystal manipulation with laser tweezers.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).</li>
<li>Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+Evaluations+of+the+Reproducibility+of+Vapor-Diffusion+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).</li>
<li>Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923710">The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).</li>
<li>McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022024886901715">The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins.</a> J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).</li>
<li>Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022024898008525">Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids.</a> J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).</li>
<li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+silver+bullets%3A+an+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+screens+developed+at+the+MRC+Laboratory+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoPlex%3A+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparse-matrix+screening+of+chemical+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.</a> Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).</li>
<li>Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+rationalization+of+crystallization+screening+for+small-+to+medium-sized+academic+laboratories%3A+the+PACT%2FJCSG%2B+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08893110410001664837">Automated Evaluation of Crystallisation Experiments.</a> Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).</li>
<li>Snell, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+training+set+through+the+visual+analysis+of+crystallization+trials.+Part+I%3A+%E2%88%BC150+000+images%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
<li>Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cg1004209">The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions.</a> Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).</li>
</ol>

Aşağıdaki öğeler LifeArc commercializes bu yana biz bu vesile ile çakışan bir ticari faiz devlet: 96 - 48-iyi ve MRC tabaklar, MRC asılı damla mühür, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM ve LMB kristalizasyon ekranlar.

1 - hazırlık ve ilk ekranlar levha depolanan kullanımı
Kitleri eleme ışık yağış veya faz ayrımı depolama sırasında bazı tüplerde oluştuğundan kalıplara önce reçete karışık. Ne zaman bir ekran iki kitleri (2 x 48 tüpler) oluşur, ikinci seti ilk tüp soğutma taşıyıcı E1 konumda yer alır. Ne zaman bir ekran 4 setleri (4 x 24 tüpler) oluşur, ikinci seti ilk tüp C1 konumda yerleştirilir, üçüncü seti ilk tüp E1 konuma yerleştirilir ve dördüncü seti ilk tüp G1 konuma yerleştirilir. Tüpler soğutma onların taşıyıcıya eklerken, kapakları standart 96-şey yatay düzen takip bir tepsiye yerleştirilir. Bu yana iyi numaraları üzerine kapakları üreticileri tarafından belirtilir, tüm tüpler doğru sırada verildiğinde bu çapraz kontrol sağlar. Bu da tabak azaltılmış bir dizi doldururken tüpler üzerinde doğru kapakları yerine yardımcı olur.
Önceden doldurulmuş plakaları 10 ° c, donma ve depolama koşulları ve sorunları bozulma ile sızdırmazlık neden olabilir 4 ° C'de önlemek için bir uzlaşma saklıyoruz. Plakalar için depolanır normalde fark yoğunlaşmasız iç yüzünde, mühür ile birkaç ay kadar. LMB05, LMB06, LMB09 ve LMB10 plakalar için bunlar geçici reaktifler (Tablo 1) nispeten yüksek konsantrasyonları ile koşulları içeren daha az gerçek bu. Yoğunlaşma az miktarda mühür iç tarafında bulunan mühürleme verimliliği azaltır ve Çapraz bulaşma wells plakaları getirdiğin süre arasında neden olabilir. İlk Isınma sırasında yoğunlaşma önlenmesi ile yardımcı olmak için tabak ilk 4 ° C soğuk odada gecede depolanan atlıkarınca yalıtılmış bir piknik soğutucusu içine aktarılabilir. Çok yavaş soğutma mühürlü kuyu içindeki sıcaklık degradelerin gelişimi en aza indirir ve dolayısıyla yoğunlaşma azaltır genel15. Buna ek olarak, sonra plakaları 10 ° C kuluçka makinesine saklanır, bir kurum içi özel SBS polistren kapak plaka (gösterilmez) her yığının en üstüne yerleştirilir.
Bizim önceden doldurulmuş plakaları kümesinin tamamını bir roman, suda çözünen, protein örnek karşı büyük bir başlangıç ekranı olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, daha az sayıda tabak belirli gereksinimlerini karşılamak için seçilmiş olabilir. Örneğin, LMB15 ve LMB19 özellikle membran protein örnekleri26,27için formüle ekranlar ya da LMB20 bu ağır-atomlar ile deneysel kırınım veri28 ' aşamalı kolaylaştırmak için formüle ekran (Ayrıca bkz: : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">MORPHEUS protein kristalizasyon ekranlar formülasyonu</a>).
2. kristalizasyon damlacıkları kurma
Sistem 2 kullanırken, kitleri ile önemli miktarda geçici reaktifler eleme ilk işlenip. Bu kapak işleme ve plaka sızdırmazlık etkileyecek SBS kapakları lastik üzerinde kalıplama yoğunlaşma önler. Bir SBS kapak izni onlar başlangıçta uyumlu hale getirilmesi gerekir neden olan bir tabak zaman, üst kısmında biraz vardır (bkz: iletişim kuralı, adım 1.2.6). Protein ölü cilt PCR plaka kuyu olarak nispeten cömert (0.8 µL, Tablo 2bkz: efsanesi) vardır. Eşit cömert ölü birimleri ne zaman nanoliter dağıtıcısı kullanarak tek tek 8-şey şeritler (Tablo 4) protein ile istihdam edilmektedir olduğunu unutmayın. Daha küçük ölü birimleri çalışabilir, ancak bazı örnekler ipuçları için uygun, kalibrasyon bir robot-ebilmek var olmak biraz tutarsız, odanın her zamanki gibi vbdaha sıcak olabilir. Tüm yaklaşım pekiştirmek için cömert ölü birimler tarafından örtülü örnek zararlara neden.
Son gelişmeler, daha fazla deney minyatür etkin ve dolayısıyla kristalizasyon koşulları eleme için gerekli örnek hacmi önemli ölçüde karşılık gelen teknoloji29,30 entegre ederek azalır . Ancak, bazı yönlerini daha da minyatür damlacıkları31 buharlaşma ve microcrystals32manipülasyon gibi dikkatli bir değerlendirme gerekir.
Son olarak, plaka (2000 rpm, 1dk) Santrifüjü rutin son bir adım olarak kristalizasyon damlacıkları (içinde küresel üst-wells) ayarlarken entegre olabilir. Daha tutarlı bir boyutu ve şekli Santrifüjü kaynaklanan damlacıkları tekrarlanabilirlik sorunları33,34azaltabilir. Kesinlikle, ortalanmış damla olarak gerekli odak uzaklığı arasında tüm plaka benzer olacak bir mikroskop kullanarak deneyler daha sonra değerlendirilmesi kolay olmayacaktır.
3. 4-köşe yönteminin avantajları
4-köşe yöntemin en önemli avantajı hataları en aza indirir ve basit otomatik protokolleri kolaylaştırır, basitliğidir. Örneğin, 4 köşe çözümler her zaman aynı düzen takip bir sıvı işleyicisi güvertede yer alacak. Ayrıca, tüm programları çözüm (şekil 3 c) arasında sabit oranlar temel alır. 4 köşe çözümleri el ile hazırlık çözümleri çok viskoz olabilen yüksek konsantrasyonlarda otomatik işleme için tercih edilir. Aspirasyon dağıtımı/nispeten hızlı ve doğru sonra üzerinde en tip-in sıvı işleyicileri sıvı sınıfların en iyi duruma getirme için en düşük gereksinimleri ile mümkündür. Yine de, bazı köşe çözümler hala çok yapışkan bir sıvı-verimli bir şekilde çalışmasına ile işletim sistemi bir robot için olabilir. Bu yüzden biz pozitif deplasmanlı (3B rakam) ile çalışan sıvı işleyici için seçti.
Konsantrasyonları 2 doğrusal gradyanlar yanı sıra üçüncü bir bileşen (örneğin, bir küme arabellekleri/katkı) uygun bir şekilde sürekli bir konsantrasyon test edilebilir. Bunun için ilk köşe çözümleri uygun daha yüksek bir konsantrasyon, çeşitlendirilecek için bileşeni hariç olmak üzere, temel bir kümesi nispeten büyük miktarda hazırlanır. O zaman, bu bileşeni içeren stok çözümleri son konsantrasyonları ayarlamak için eklenir. Örneğin, 50 mL 4 köşe çözümler kümesinin daha başlangıçta % 10 daha yüksek konsantrasyonlarda hazırlanıyor. Bu çekirdek kümesi sonra 5 daha küçük alt kümeleri 4 ikiye bölünmüş durumda. Son olarak, farklı tampon-pH çözümleri hacmi % 10 her alt kümesine eklenir.
4. biçimleri ve türleri katkı ekranlar
Ekranları beri düzenli olarak kullanılan değil normalde-20 ° C'de (şekil 4) depolanır ve geçici/kararsız bileşikleri içerir. Çünkü tamamen oda sıcaklığında erimek katkı tüm çözümler için 12-24 saat sürecek bir derin kuyu blok (1 mL Wells) depolanan bir donmuş katkı ekran kullanımı erken planlanması gerekir. Ayrıca, kullanıcılar çok sayıda potansiyel Çapraz bulaşma sorunlara neden aynı katkı ekran paylaşmak. Son olarak, derin kuyu blok yüksekliğini onları uygun olmayan çoğu nanoliter Albümler için yapar. Bu sorunları aşmak için uygun bir çözüm, ekranın düşük profilli tabak (şekil 4) Derin kuyu bloğundan aktarılmalıdır.
Tarihsel olarak, tek reaktifler (ile tek konsantrasyonları) geniş bir çeşitlilik içeren katkı ekranları çok popüler35,36olmuştur. Ancak, diğer türleri katkı ekranlarının karışımları katkı maddeleri37 veya farklı konsantrasyonlarda38, bulunan tek katkı maddeleri azaltılmış bir dizi entegre geliştirilmiştir. Son olarak, bir tamamlayıcı örnekleri kristalizasyon39,40önce katkı maddeleri etkisini araştırmak için bir yaklaşımdır.
5. daha fazla dikkat edilmesi gereken noktalar
İyi uygulama: Çoğu ekranı zararlı veya bile toksik maddeler içerir ve bu nedenle yeterli kişisel koruma sırasında protokolleri istihdam gerekir. Aynı şekilde, hareketli parçalar robotlar için yaralanmaları, özellikle (robotlar çoğunu Acil durdurma düğmesi/sistem olsa) bir program çalışırken el ile müdahale etmeye çalışırken neden olabilir. Teknik karmaşıklığı nedeniyle dahil, düzenli robotlar, ekranlar ve programları ile daha önce karakterize test örnekleri tekrarlanabilirlik sürekli yüksek düzeyde önemlidir kontrol ediyorum.
Üretilen iş: Bir göstergesi olarak 4.000-8.000 LMB arasında yıllık 1 sistemiyle (ve daha sonra başlangıç tarama için kullanıcılar tarafından istihdam) plakalar imal edilmektedir. Beklenen devir oranı 4-5 ay sonra bazı koşullar olarak çok düşük olduğunda 10 ° C'de önceden doldurulmuş tabak büyük miktarda bozulabilir ve buharlaşmasına başlayacak hisse senedi için adapte değildir. Otomasyon iletişim kuralları için farklı yaklaşımlar küçük-orta boy laboratuvarları41için uygulanmıştır.
Saklama ve deneyler değerlendirilmesi: Damlacıkları hazırladıktan sonra plakaları bir odada 4-18 ° C (+/-0,5 ° C maksimum sapma) sıkı kontrol sıcaklık düşük titreşim raflarda depolanır. Deneyler soğuk ışık kaynağı mikroskoplar kullanarak değerlendirilir. Çeşitli otomatik görüntüleme sistemleri piyasada bulunan vardır, ancak bir dikkatle tüm yönleri dikkate almanız gerekir: bir tabak inceden inceye gözden geçirmek için gereken hız için yüksek işlem hacmi yeterli olacaktır? Kristaller dışındaki nesneler ile otofokus müdahale edecek? Elde edilen görüntülerin kalitesini nokta çok küçük kristaller (özellikle kenarındaki damlacıkları) için yeterli olacak mı? 42 , 43 , 44
Kristalizasyon koşullardan karşılaştırma: Başlangıçta elde kristalleri doğası hakkında dikkatli araştırmalar sonra bir eğilimleri ve benzerlikler <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB ekran veritabanı</a> veya C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Web aracı</a>45kullanarak koşulları çözümleyebilirsiniz.

X-ışını kristalografisi yoğun daha fazla biyolojik ve hastalık mekanizmaları atomik düzeyde bizim anlayışı ilerletmek için ve daha sonra ilaç keşif1akılcı yaklaşımlar yardımcı olmak için uygulanır. Bunun için saflaştırılmış ve konsantre (2-50 mg/mL) makromoleküllerin protein, DNA, RNA, diğer ligandlar ve kendi kompleksleri örneklerdir yargılandın kristalizasyon2,3 boyutlu duvarlar, Korkuluk onların eğilimi formu için sipariş için ,4. Yüksek kaliteli kristaller bu röntgen diffract elde edilen zaman kristal yapısı, atom çözünürlük5,6çözülmüş. En önemlisi, bir roman örnek kristalize koşulları bilinemez ve genellikle çok düşük kaliteli kristaller verimidir. İlgi birçok örnekleri onları kararsız kristalizasyon (genellikle bir kaç gün) için karşılık gelen zaman ölçeğini yapmak zor biyokimyasal özellikleri vardır bir temel nedenidir. Son olarak, işlem örnekleri ve örnek çeşitleri üretmek ve onların arıtma ve kristalizasyon7,8en iyi duruma getirmek için gereken süreyi tarafından bileşik olduğunu.
Kristalizasyon durumu örnek çözünürlük azaltır bir precipitant ile bir çözümdür ve koşullar kez de arabellekleri ve katkı maddeleri içerir. Böyle reaktifler yüzlerce gibi onlar örnek bütünlüğünü (örneğin, protein veya nükleik asit unfolding) müdahale eğilimi düşük kristalizasyon deneyler parametrelerini değiştirmek için uygundur. Kristalizasyon reaktifler kombinasyonları milyonlarca test mümkün olmasa da, birçok tarama kitleri - çeşitli stratejileri9ile formüle için birkaç test,10 - Mini denemeler ve otomatik protokolleri ile mümkün. Bu açıdan en mükellef muhtemelen buharı difüzyon ile 100-200 nL damlacıkları küçük oldukça özel kristalizasyon tabak11 ' uygulanan kristalizasyon koşulu (25-250 µL) içeren bir rezervuar üzerinde oturan bir tekniktir , 12. protein örnek ve koşul kez 200 toplam hacmi için 1:1 oranında birleştirilir üst-Wells damlacıkları ayarlarken nL. Robot nanoliter protein kristalizasyon alternatif teknikleri ve levha altında petrol toplu13 ve Lipidic üçüncü aşama14 (özellikle olan trans-membran proteinlerinin uygulanan en son bir gibi uygulanabilir çok kötü çözünür su).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">MRC LMB kristalizasyon tesisinde</a> erken 2000'li yıllarda başladı ve otomatik protokolümüze erken bir özetini 200515dakika içinde sunuldu. Protein kristalizasyon tarihsel bir giriş sunuldu ve ayrıca robot nanoliter avantajları bir taslağını yaklaşım (sonra yeni bir yaklaşımın rutin deneyler için). Beri makromoleküllerin kristalizasyon aslında bir Stokastik süreç (uygun) başlangıç koşullarını geniş bir istihdam çok az veya hiç yararlı önceki bilgilerle artırmak verim kalitesi kırınım kristalleri16. Ayrıca, örnekleri ve birçok durumda kristalleri duruma getirilmesi ihtiyacını önemli ölçüde azaltmak için büyük bir başlangıç ekranı genellikle gözden kaçan bir avantajı olduğunu. Tabii ki, bir-ebilmek hareketsiz lüzum-optimizasyon bazı başlangıç koşullarını ile daha sonra devam etmek. Genellikle, reaktifler ve pH konsantrasyon sonra sistematik olarak incelenmiştir. Daha fazla reaktifler da daha fazla kristalizasyon parametrelerini değiştirmek için en iyi duruma getirilmiş koşulları tanıttı olabilir. Kesinlikle, bir taze hazırlanmış bir örnek ile kristalizasyon denemeniz gerekir, bu nedenle ilgili iletişim kuralları her zaman basit ve kullanılabilir olmalıdır.
Burada, iki MRC-LMB (sistemleri 1 ve 2) tasarlanmış sistemleri otomatiğe ve ilgili protokolleri tam olarak açıklanmıştır. Bu iki sistem ana uygulama tarafından açılan kristalizasyon plakaları defada buharı difüzyon eleme ilk. Sistem 1 sıvı bir işleyici, hisse senedi plakaları için otomatik bir carousel, plaka etiketleme için bir mürekkep püskürtmeli yazıcı ve bir yapışkan plaka mühürleyen entegre. Sistemdeki 1, 72 96-şey plakaları piyasada bulunan tarama kitleri (80 µL koşulun rezervuar için test tüpleri 10 mL başlangıç hacmi transfer) ile dolu, etiketli ve mühürlü. Plakayı daha sonra nerede onlar her zaman ('LMB plakaları' adı verilen ilk) kullanıcılarının ekranlardır 10 ° C kuluçka saklanır.
Sistem 2 sıvı işleyicisi, bir nanoliter pınarı ve bir yapışkan plaka mühürleyen entegre. Sistem üzerinde 2, damlacıkları (100-1000 nL) buharı difüzyon deneyler için oturma koşullarını birleştirme tarafından üretilen ve örnek üst-Wells 20 48 veya 96 iyi plakaların ön koşulları ile dolu. Bu 1920 başlangıç tarama koşulları 20 LMB plaka sistemi 2 kullanırken yargılandın olduðu anlamýna gelir.
Robotlar da tek tek Seçilen koşulları optimizasyonu için kullanılır ve karşılık gelen yarı otomatik iletişim kuralları da açıklanmıştır. 4-köşe yöntemi17 düzenli olarak en iyi duruma getirme ekranlar üretmek için istihdam edilmektedir. İlgili iletişim kuralı ilk 4 Çözümleri ('A, B, C ve D') el ile hazırlanması gerekir. Konsantrasyonları (iki ana kristalizasyon aracıları için) iki doğrusal degradeleri doğrudan kristalizasyon plaka rezervuar otomatik olarak oluşturulur. Bunun için farklı oranlar 4 köşe Solutions'da şırınga bağlı sıvı işleyici dağıtır.
Daha fazla koşul en iyi duruma getirmek için potansiyel olarak elde edilen kristalleri18özelliklerini geliştirmek katkı ekranlar istihdam edebilirsiniz. Katkı tarama için iki yaklaşım vardır: damlacıkları (Protokolü 1) ayarlamadan önce kristalizasyon plakaları rezervuar reçete katkı maddeleri ile başlayan bir protokol ve başka bir protokol nerede katkı ekran reçete doğrudan damlacıkları (2 iletişim kuralı).
MRC-otomatik makromoleküllerin kristalizasyon kolaylaştırmak için LMB başlatılan diğer yararlı gelişmeler de sunulmaktadır. Esasen, kristalizasyon plakaları ve ilişkili aygıtları gibi bir stackable toplum, biyomoleküler eleme (SBS) bu kapak en aza indirir buharlaşma koşullardan sistemi 2 kullanırken.
Kısalık için bu kullanıcıların temel işlevleri ve bakım nanoliter dağıtıcısı, mürekkep püskürtmeli yazıcı ve yapışkan plaka mühürleyen ile aşina olduğu varsayılır. Aksi belirtilmediği sürece, tabaklar robotlar güvertede konumlandırılmış öyle ki iyi A1 ('A1-köşe') bir levha taşıyıcı arka sol köşesine doğru olduğunu.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Robotlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Özgürlük EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Sıvı işleyici (Sistem 1). Sistem sıvısına dayalı Aspirasyon/Dağıtım. Otomatik bir atlıkarınca entegre eder. EVOware plus kontrol yazılımı v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro laboratuvar&reg; YILDIZ & TİCARET;</td><td>Hamilton</td><td>yok</td><td>Sıvı işleyici (Sistem 2). Pozitif yer değiştirmeye dayalı Aspirasyon/Dağıtım (CO-RE&trade; teknoloji). Yöntem yönetimi arayüzü ile Hamilton STAR kontrol yazılımı v.4.3.5.4785.</td></tr><tr><td>Sivrisinek&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Damlacıkları ayarlamak için kullanılan mikroşırınga bazlı nanolitre dağıtıcı (Sistem 2 ve bağımsız), 3 konumlu güverte. Kontrol yazılımı v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Yusufçuk&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Optimizasyon ekranları üretmek için kullanılan şırınga bazlı sıvı işleyici (4 köşeli yöntem). Kontrol yazılımı v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>Yapışkan plaka kapatıcı</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Sistem 1 ve 2'ye entegre (bağımsız robot olarak da kullanılır).</td></tr><tr><td>Mürekkep püskürtmeli yazıcı 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Sisteme Entegre 1. Dokunmatik ekran arayüzü.</td></tr><tr><td><güçlü>Kristalizasyon ekranları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristal Ekran ve ticaret; LMB01</td> Kristal Ekran 2 ve ticaretinde kullanılan 1 <td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB01 Sihirbaz ve ticaretinde kullanılan <td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); LMB02</td><td></td> Sihirbaz ve ticaretinde kullanılan Klasik 1 <td>Rigaku</td> 1009530 <td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); LMB02</td><td></td><td>Izgara Ekranı</td> ve ticaretinde kullanılan Klasik 2 Rigaku 1009531 <td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); LMB03</td> Izgara Ekranı ve ticaretinde kullanılan Amonyum Sülfat <td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); </td> LMB03 Hızlı Tarama ve ticarette kullanılan PEG / LiCl <td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td><td>LMB03</td> Izgara Ekranı ve ticaretinde kullanılan Hampton Research <td>HR2-221</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); </td> LMB03 Izgara Ekranı ve ticaretinde kullanılan Sodyum Klorür <td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); LMB04 Izgara Ekranı ve ticaretinde kullanılan PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); </td> LMB04 MemFac ve ticaretinde kullanılan MPD <td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB04 PEG / İyon ve ticarette kullanılan <td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB05 Natrix&trade'de kullanılan <td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB05 Crystal Screen Lite ve ticaretinde kullanılan <td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB06 Custom Lite ekranında kullanılan <td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td></td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>n/a</td><td>LMB06 Sihirbaz ve ticaretinde kullanılan Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); LMB07</td><td></td><td></td> Wizard & trade'de kullanılan Cryo 1 Rigaku 1009536 <td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); LMB07</td> JBS1'de kullanılan Cryo 2 <td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td></td><td>) LMB08 JBS2'de kullanılan Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td><td></td><td></td></tr><tr>LMB08<td>JBS3'te</td> kullanılan <td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td></td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L'de</td> <td>kullanılırLMB08 JBS4'te kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL) LMB08</td></tr><tr><td>JBS5'te</td> kullanılan <td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td> Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL) LMB09'da kullanılan JenaBioScience CS-105L <td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL) LMB09'da</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>kullanılan <td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td><td></td></tr><tr><td>LMB09'da kullanılan JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>LMB09 JBS9'da kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td></td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>LMB10'da kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L'de</td> <td>kullanılırLMB10 Clear Strategy&trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 1 pH 4.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB10</td> Clear Strategy&<td>trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 1 pH 5.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB10</td> Clear Strategy&<td>trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 1 pH 6.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB11</td> Clear Strategy&<td>trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 1 pH 7.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB11</td> Clear <td>Strategy&trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 1 pH 8.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB11</td> Clear Strategy&<td>trade'de kullanılan Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 2 pH 4.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB11</td> Clear <td>Strategy&trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 2 pH 5.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB12</td> Clear <td>Strategy&trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 2 pH 6.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB12</td> Clear Strategy&<td>trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 2 pH 7.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB LMB12</td> Clear Strategy&<td>trade'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Ekran 2 pH 8.5</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>LMB12 Endeksi ve ticaretinde kullanılan Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td>LMB13 SaltRX ve ticaretinde kullanılan <td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL); LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX ve ticaretinde kullanılan 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL);</td></tr><tr><td>LMB14</td> MemStar ve ticaretinde kullanılan 2 <td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-21 LMB15</td> MemSys ve <td>ticaretinde kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-25 LMB15</td> JCSG-plus & <td>ticaretinde kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>); Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td> LMB16 MORPHEUS&reg; ekranında <td>kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td></td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>LMB17 Pi minimal ekranında kullanılan MD1-46</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL) LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG ekranında</td> kullanılan <td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>LMB19</td><td></td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; II ekran</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-91</td> LMB20 LMB kristalizasyon ekranı ve <td>ticaretinde kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL</td></tr><tr><td>);</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-98</td><td>LMB21'de kullanılan kristalizasyon kiti (test tüpleri, koşul başına 10 mL)</td></tr> <tr><td><güçlü>Katkı ekranları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT katkı ekranı</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>96 oyuklu derin kuyu bloğunda (kuyu başına 1 mL) dondurulmuştur.</td></tr><tr><td>MORPHEUS & reg; katkı ekranı</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>96 oyuklu derin kuyu bloğunda donmuş (500 & mikro; Kuyu başına L).</td></tr><tr><td>ANGSTROM katkı ekranı ve ticareti; &nbsp;</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-100</td><td>96 oyuklu derin kuyu bloğunda dondurulmuştur (kuyu başına 1 mL).</td></tr><tr><td>MORPHEUS & reg; katkı ekranı</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-93</td><td>96 oyuklu hücre kültüründe donmuş Costar & reg; V şeklinde kuyucuklu plaka (100 & mikro; Kuyu başına L).</td></tr><tr><td>ANGSTROM katkı ekranı ve ticareti; &nbsp;</td><td>Moleküler Boyutlar Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>96 oyuklu hücre kültüründe donmuş Costar&reg; V-şekilli kuyucuklu plaka (100 & mikro; Kuyu başına L).</td></tr><tr><td>HIPOKRAT katkı ekranı</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 tek katkı maddeleri (MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td>< Güçlü>Diğer sarf malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu MRC 2 damla plakası</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Oturma-damla, buhar difüzyon plakası. Rezervuar önerilen hacim: 80&nbsp; Yararlı damlacık hacimleri aralığı: 10-1000 nL. UV ile bulaşabilir.</td></tr><tr><td>48 kuyulu MRC 1 damla plaka&nbsp; ('MAXI plaka')</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>Ölçek büyütme/optimizasyon için oturarak bırak, buhar difüzyon plakası. Rezervuar önerilen hacim: 200&nbsp; &micro;L. Yararlı damlacık hacimleri aralığı: 0.1-10 &micro;L. UV bulaşıcı.</td></tr><tr><td>MRC asılı damla contası</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Asılı damla, her iki MRC buhar difüzyon plakası (MRC 96T-UVP ve MMX01-UVP) ile uyumludur. UV ve X-ışını bulaşabilir.</td></tr><tr><td>Yapışkan sızdırmazlık bandı</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3 inç genişliğinde Duck&reg; HD Temizle ve ticaret; mühürleyici ve manuel sızdırmazlık için.</td></tr><tr><td>Yapışkanlı alüminyum levha</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Katkı ekranlarını yeniden kapatmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Mürekkep kartuşu</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>Sistem 1 (mürekkep püskürtmeli yazıcı).</td></tr><tr><td>Solvent kartuşu</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>Sistem 1 (mürekkep püskürtmeli yazıcı).</td></tr><tr><td>50 ve mikro; L ipuçları&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>Sistem 2 (STAR&trade; sıvı işleyici). 1920 x CO-RE & TİCARET ile 6 set kutusu; tek kullanımlık yığınlarda uçlar.</td></tr><tr><td>Reaktif kabı</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Katkı maddesi tarama protokolleri sırasında bir koşulu plaka(lar)a dağıtmak için kullanılır.&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR plakası</td><td>Thermo Scientific & Trade;</td><td>AB-2150</td><td>Sistem 2 (Sivrisineğe aktarılacak proteini içerir&reg;). Abgene Diamond ultra, 384 V şeklinde kuyu.</td></tr><tr><td>mikroşırıngalar</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Sivrisinek ve nanolitre dağıtıcı için 26.000 mikroşırınga makarası (9 mm aralıklı).</td></tr><tr><td>şerit tutucu blok</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Sivrisinek ve şeritler için SSB cihazı, diğer adıyla '4 Reaktif Tutucu'.</td></tr><tr><td>2 ve mikro; L 8 oyuklu şerit</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Sivrisinek güvertesinde protein içerir&reg;. 40 şeritli kutu, maks. kuyu içinde hacim 3.2 &mikro; L'dir.</td></tr><tr><td>5 ve mikro; L 8 oyuklu şerit</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Sivrisinek güvertesinde protein içerir&reg;. 40 şeritli kutu, maks. kuyu içinde hacim 7.5 &mikro; L'dir.</td></tr><tr><td>5 mL şırıngalar</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Dragonfly &reg; sıvı işleyici için şırınga gövdesi ve pistonu. 100'lük paket.</td></tr><tr><td>Oluklar/Rezervuarlar</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Dragonfly'ın güvertesinde stok çözeltileri içerir&reg;. 50'lik paket.</td></tr><tr><td>Tek bir plakada (0-2000 rpm) karıştırma koşulları için</td> <td>orbital mikroplaka çalkalayıcı</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td> Variomag&reg; .</tr><tr><td>Mikroplaka karıştırıcı</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. 96 titreşimli pim ile tek bir plakada karıştırma koşulu.</td></tr></tbody></table>

mrc laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Yüksek kaliteli kristaller bu röntgen diffract elde edilen zaman kristal yapısı, atom çözünürlük çözülmüş. Proteinler, DNA'lar, RNA'ların ve kendi kompleksleri kristalize koşullar ancak değil olabilir tahmin. Koşulları geniş bir istihdam kalite kırınım kristalleri verimini artırmak için bir yoldur. İki tam otomatik sistemleri, moleküler kristalizasyon tarama 1920 başlangıç koşullarını karşı kolaylaştıran Biyoloji laboratuarında (Cambridge, İngiltere, MRC-LMB) nanoliter damlacıkları buharı difüzyon tarafından geliştirilmiştir. Yarı otomatik iletişim kuralları da reaktifler, pH, konsantrasyonları değiştirerek veya potansiyel olarak elde edilen kristalleri özelliklerini geliştirmek katkı maddeleri tanıtımı koşulları optimize etmek için geliştirilmiştir. Karşılık gelen tüm iletişim kuralları ayrıntılı olarak açıklanan ve kısaca tartışıldı. Birlikte ele alındığında, onlar onların deneyler anahtar parametreleri üzerinde kontrol kullanıcılar verirken uygun ve yüksek verimli makromoleküllerin kristalizasyon bir çok kullanıcılı tesisi sağlar.

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Bu prosedürün genel amacı, başlangıç kristalizasyon tarama koşullarından yüksek kaliteli kristaller üretmektir. Kristaller; proteinlerin, DNA'nın, RNA'nın ve bunların komplekslerinin yapılarını incelemek için kullanılabilir. Makromoleküler yapılarla ilgili bazı hususlar giderek daha zorlayıcı hale gelmiştir.Geniş bir başlangıç koşulları yelpazesi sağlamak, numune ve kristal optimizasyonu ihtiyacını azaltırken, yararlı kristallerin verimini artırır. İki tam otomatik sistem olan LMB, nanolitre damlacıklarda 1.920'ye kadar buhar difüzyon deneyinin hazırlanmasını kolaylaştırır. Kısalık adına, kullanıcıların nanolitre dağıtıcı, inkjet yazıcı ve yapışkan plaka kapatıcının temel işlevlerine ve bakımlarına zaten aşina olduğu varsayılmaktadır.Prosedürü gerçekleştirmeden önce, sistem robotlarının başlatıldığından ve kontrol yazılımlarının açık olduğundan emin olun. Ana program başlatılmadan yaklaşık 30 dakika önce, tüp soğutma taşıyıcısının soğutucusunu (chiller) açın. Plaka mühürleyicinin motorlu SBS taşıyıcısına bir test plakası yerleştirin.Plaka mühürleyiciyi çalıştırın ve filmin düzgünce uygulandığını kontrol edin. Plaka mühürleyicinin hazır olduğunu doğrulamak için bu testi iki kez daha tekrarlayın. Ardından, sıvı aktarıcı sistemin ana haznesine 20 liters deiyonize su ekleyin.Bağlantı eklerini %20 etanol durulama çözeltisinin bulunduğu küçük kaptan ayırın ve ekleri ana kaba bağlayın. Mürekkep püskürtmeli yazıcının dokunmatik ekranına uygun ekran adını girin. Ardından, döner tablaya rotasyonu başlatmak için döner tabla kapağını açıp kapatın.İlk istif göründüğünde kapıyı açın. İlk istifi, her birinin birinci sütunu dışa bakacak şekilde 22 kristalizasyon plakası ile tamamen doldurun. Sonraki iki istifi de aynı şekilde tamamen doldurun.Kalan altı plakayı dördüncü istifin en üst konumlarına yerleştirin, ardından karusel kapağını kapatın. Soğutucu ekranının 14 °C olduğunu doğrulayın. Seçilen tarama kitlerini bir dakika boyunca nazikçe ve tekrarlı olarak altüst edin.Ardından, sıvı işleyici cihazın ön panelini açın. Tüpleri açın ve standart 96 kuyucuklu düzende soğutma taşıyıcısına yerleştirin. Her bir tüpü taşıyıcıya yerleştirirken, kapağını da aynı 96 kuyucuklu düzende tepsiye yerleştirin.Sistem 1 kullanılırken, tüplerin doğru şekilde düzenlendiğini çapraz kontrol edebilmek için etiket uçları tepsiye 96 kuyucuklu düzende yerleştirilir. Tüp konumlarını çapraz kontrol edin ve ardından tüm tüplerin düz olduğundan ve taşıyıcıya tam oturduğundan emin olun. Sonrasında ön paneli kapatın.Sıvı işleme yazılımının Başlangıç penceresinde, Bakım Çalıştır'ı seçin ve Durulama programını açın. Sistemdeki %20 ethanol'ü dışarı atmak ve sıvı dağıtma uçlarının dış kısımlarını yıkamak için programı çalıştırın. Durulama tamamlandığında, Başlangıç ekranına dönmek için İptal'e tıklayın.Mevcut İşlemi Çalıştır'ı seçin ve Seçiminizi Başlat'a tıklayın. MRC Kit dağıtım programını açın. Konfigürasyon ekranındaki Örnekler kısmına 18" yazın ve programı çalıştırın. İlk dört plaka etiketlenirken, doldurulurken ve mühürlenirken sistemi izleyin.İlk dört plakanın hazırlanması tamamlanana kadar sistemi gözetimsiz bırakmayın. 72 plakanın tamamı hazırlandıktan ve yeniden carousel'e yerleştirildikten sonra, bağlantı eklerini deiyonize su kabından %20 etanol kabına taşıyın. Başlangıç yıkama programını daha önce uygulanan aynı işlemle çalıştırın.Soğutucuyu kapatın ve boş tarama kiti tüplerini atın. Hazırlanan 72 plakayı karuselden dikkatlice çıkarın. Yanlış doldurulmuş veya kötü mühürlenmiş plakaları atın.Kullanıma hazır plakaları 10 °C'de saklayın. Öncelikle sistem robotlarının açık olduğundan, nanolitre dağıtıcının yazılımı açık şekilde başlatıldığından ve sıvı işleme sisteminin yöntem yöneticisinin açık olduğundan emin olun. Ana program başlatılmadan yaklaşık 15 dakika önce mikro tüp soğutma taşıyıcısını açın.Plaka mühürleyicinin motorlu SBS taşıyıcısına bir test plağı yerleştirin. Plaka mühürleyiciyi çalıştırın ve plağın uygun şekilde mühürlendiğini doğrulayın. Plaka mühürleyiciyi üç kez test edin.Ardından, bir test plağına 100 nanolitre test çözeltisi damlacıkları yerleştirmek için nanolitre dağıtıcıyı çalıştırın. Burada, nanolitre dağıtıcı tarafından üretilen ve kırmızı boya ile hazırlanmış test çözeltisini içeren 100 nanolitrelik bir damlacığın ışık mikrografı gösterilmektedir. Nanolitre dağıtıcı yazılımını kapatın ve şerit tutucu bloğu platformdan çıkarın.Ardından, özel tasarım bir plaka tutucusuna, koşulları arasında uçucu reaktiflerin göreceli miktarının en yüksek olduğu, önceden doldurulmuş 96 kuyucuklu bir kristalizasyon plakası yerleştirin. Plaka üzerindeki yapışkan filmi çıkarın. Sıvı aktarım sisteminin ön panelini açın ve mühürsüz plakayı, ilk kayar taşıyıcının arkasındaki platforma yerleştirin.Plakayı bir SBS alüminyum kapakla kapatın. Kapağın karşı köşesine hafifçe bastırarak kapağı taşıyıcının arka sol köşesine doğru oturtun. Sistem 2 kullanırken, önemli miktarda uçucu reaktif içeren tarama kitleri öncelikli olarak işlenmelidir.Bu işlem, SBS uçlarında yoğunlaşma oluşmasını engeller; çünkü yoğunlaşma, uçların otomatik olarak taşınmasını veya plakaların mühürlenmesini etkileyebilir. Mührü açın, sürgülü taşıyıcılara yerleştirin ve kalan 19 plakayı aynı şekilde, en uçucul koşullardan en az uçucul koşullara doğru çalışarak kapatın. Mikrotüp soğutma taşıyıcısı, yeşil ışıkla belirtildiği üzere 4 degrees Celsius'ye ulaştığında kapağını çıkarın.En az 440 µL protein örneği içeren bir mikrotübün kapağını kesin. Sıvı tespit sistemini etkileyeceği için örnekte menisküs üzerinde köpük olmadığından emin olun. Tüpü, mikrotüp soğutma taşıyıcısının 1. Pozisyonuna yerleştirin.Bir PCR plakasını, sıvı taşıyıcı platformunda plaka hareket adaptör taşıyıcısının önüne yerleştirin. Ardından ön paneli kapatın. Sıvı taşıyıcı yöntem yönetim arayüzünde, Plakaları Kur Ayarına (Setup Plates) tıklayın.Her iki sistemin başlatılmasını izleyin ve plaka tipi, her bir koşul için damla sayısı, damla boyutu, işlenecek ilk plakanın konumu ve plaka sayısı dahil olmak üzere çalışma parametrelerini doldurun. Güverte yükleme konusunda yardım isteyip istemediğiniz sorulduğunda Hayır'a tıklayın. Boş uç rafı bulunmadığını kontrol ettikten sonra Tamam'a tıklayın. Çalışma için yeterli uç olduğundan emin olduktan sonra Tamam'a tıklayın. Gerektiğinde uç yönetim sistemini güncelleyin ve Tamam'a tıklayın. Nanolitre dağıtıcı güvertesinin şerit tutucu bloktan temiz olduğundan ve taşıyıcının 50 µL uç yığınlarının arkasında olduğundan ve alüminyum SBS kapakların temiz olduğundan emin olun.Diğer tüm gerekli bileşenlerin hazır olduğunu iki kez kontrol edin ve ardından işlemi başlatın. Nanolitre dağıtıcı ilk plakaya damlaları yerleştirirken ve plaka mühürleyici ardından plakayı mühürlerken sistemi izleyin. İlk plakanın hazırlanması tamamlanana kadar sistemi gözetimsiz bırakmayın.Tüm 20 plaka kristalizasyon damlacıklarıyla hazırlanıp otomatik olarak sürgülü taşıyıcılara döndükten sonra, ön paneli açın ve plakaları nazikçe çıkarın. Plakaları kristalizasyon için saklamadan önce doğru şekilde mühürlendiklerini kontrol edin. SBS kapaklarını, sıvı aktarıcının sol tarafında saklamak üzere üst üste dizmeden önce %20 etanol çözeltisi ile temizleyin.PCR plakasını ve mikrotüpü atın. Mikrotüp soğutma taşıyıcısını kapatın ve yoğunlaşan nemi silin. Daha fazla yoğunlaşmayı emmesi için soğutucu yüzeyin üzerine bir kağıt havlu bırakın.Ardından taşıyıcı kapağını geri yerleştirin ve ön paneli kapatın. OmpF ve MreB başlangıçta bu tam otomatik protokoller kullanılarak tarandı. X-ışını kırınımı için yeterli kalitedeki OmpF kristalleri, LMB 7 plakasının A4 kuyucuğunda bulundu.MreB'nin difraksiyon kalitesindeki kristalleri LMB 20 plakasının D12 kuyucuğunda bulunmuştur. Ön-yakıt plakalarının 10 °C'de saklanması, donmayı önlemek ve kristalleşme koşullarının bozulmasına veya yoğuşmaya bağlı sorunlara yol açabilecek 4 °C'de saklama işlemini önlemek için yapılmış bir tercihtir. Bu şekilde saklandığında, plakalar dört ila beş ay içinde kullanılabilir.System 1 ile yılda 4.000 ila 8.000 LMB plakası üretilmekte ve bunlar daha sonra ilk tarama için kullanılmaktadır. Beklenen devir hızı çok daha düşük olduğunda protokoller farklı şekilde optimize edilmelidir. Ön yakıt plakalarının tüm seti, normalde yeni bir örnek için geniş kapsamlı bir ilk tarama olarak kullanılır.Buna karşın, çok spesifik örnek gereksinimlerine bağlı olarak daha az plaka seçilebilir. Damlacıklar hazırlandıktan sonra plakalar, sıcaklığı 4 veya 18 derece Celsius olarak sıkı şekilde kontrol edilen, düşük titreşimli raflarda saklanır. Deneyler, kaydırmalı ışık kaynaklı mikroskoplar ile değerlendirilir.Kristallerin doğası dikkatle incelendikten sonra, farklı koşullar arasındaki özellikler ve benzerlikler LMB veya C6 Screen veri tabanları gibi web tabanlı araçlarla analiz edilebilir. Kristalizasyon koşullarının daha sonra optimize edilmesi hala gerekli olabilir. 4-köşe yöntemlerini ve katkı maddesi taramasını içeren ek otomatik protokoller makalemizde açıklanmıştır.

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

3-D bir molekül yapısı molekül fonksiyonları nasıl eşsiz bir anlayış sağlar. Yakın atomik çözünürlükte yapı tespiti için temel yöntem, X-ışını kristalografisi. Burada, X-ışını kristalografisi yapı tayini için uygun olan herhangi bir makromolekül üç boyutlu kristaller elde etmek için mevcut yöntemler göstermektedir.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Biz kullanılmak üzere sonraki yapı belirlenmesi, kısmi kırınım veri kümeleri floresan protein Cerulean birçok küçük kristaller toplanan oluşan bir tam kırınım veri kümesi elde etmek için MeshAndCollect Protokolü'nün kullanılmasına mevcut.

MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü

Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

Makromoleküler X-ışını Kristalografi için yeni bir örnek tutucu ile birlikte uygun bir kullanım Protokolü sunulmaktadır. Sistem, kristal büyümesi, kristal ıslanmasına ve herhangi bir kristal manipülasyon veya montaj gerek kalmadan her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ dikesasyon veri toplama sağlar.

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.

Nötron Makromoleküler Kristalografi için Kristal Büyümesinin Optimizasyonu

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Burada, EMBL Grenoble'daki HTX Laboratuvarı'nda KristalDirekt teknolojisine dayalı proteinden yapıya, hızlı ligand-protein kompleksi analizi ve büyük ölçekli parça taraması için otomatik makromoleküler kristalografi boru hatlarının nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Bu protokol, 1.536 mikrotahlil plakası hazırlığından 6 haftalık deneysel zaman penceresinin sonuna kadar değişen yüksek verimli kristalizasyon taramasını detaylandırır. Örnek kurulumu, elde edilen görüntüleme ve kullanıcıların makromoleküler kristalleşme koşullarını hızlı ve verimli bir şekilde tanımlamak için yapay zeka özellikli bir grafik kullanıcı arabirimi kullanarak analizleri nasıl gerçekleştirebilecekleri hakkında ayrıntılar dahil edilmiştir.

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Öğrenin, makromoleküllerin yüksek kaliteli kristallerini üretmek için buhar difüzyon deneylerinde nanolitre damlacıkların otomatik hazırlanması yöntemini. Bu protokol, protein, DNA ve RNA yapı çalışmalarını kolaylaştırır.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Daha fazla video keşfet