Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Bu markalama prosedürlerinin genel amacı, gelişmekte olan zebrafish embriyosundaki stabil, dinamik ve yeni oluşan mikrotübülleri görüntülemek ve nicelendirmektir. Bu yöntem, hücre polaritesinin oluşumuna mikrotübüllerin nasıl katkıda bulunduğu gibi gelişimsel nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı mikrotübül popülasyonlarının in situ tespitini ve nicelendirilmesini optimize etmesidir.

Genellikle, bu yöntemi ilk kez uygulayan kişiler mikrotübül bütünlüğünü korumadaki zorluklar nedeniyle güçlük çekerler. Metin protokolüne göre evrelandırılmış zebra balığı embriyoları klorundan arındırıldıktan sonra, mümkün olduğunca fazla medyumu uzaklaştırarak onları 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Embriyoları 28,5 °C'de beş dakika boyunca sabitlemek için mikrotübül montaj tamponu veya MAB içindeki 1 mililitre %4 PFA ekleyin.

Ardından bir pipet kullanarak tespit ediciyi aspire edin ve yerine 1 mL taze tespit edici ekleyin. Numuneleri bir sarsıcıda (rocker), oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin. Tespit ediciyi aspire edin ve 1 mL TBS NP-40 tamponu ekleyin.

Embriyoları bir sarsıcı üzerinde beş dakika boyunca nazikçe çalkalayın. Yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Ardından, tampon çözeltiyi 1 mL taze TBS NP-40 ile değiştirerek embriyoları 4 °C'de yedi günden fazla olmamak kaydıyla saklayın.

Metin protokolüne uygun olarak embriyoların sarıları alındıktan ve agaroz içine gömüldükten sonra, TBS NP-40 ile doldurulmuş kesit kabını yerleştirin ve agaroz içine gömülü embriyoların en uzun ekseninden 40 micrometers kalınlığında kesitler oluşturmak için bir vibratom kullanın. İlgilenilen kesitleri, 24 kuyucuklu bir plaka içindeki 500 microliters TBS NP-40'a aktarmak için ince pens kullanın. Tamponu uzaklaştırın ve 500 microliters bloklama çözeltisi ekleyin.

Ardından, kesitleri oda sıcaklığında en az bir saat boyunca sallayarak bekletin. Bloklama solüsyonunu, bloklama tamponunda seyreltilmiş 300 µL primer antikor ile değiştirin ve örnekleri bir sallayıcı üzerinde 4 °C'de 36 ila 72 saat boyunca inkübe edin. Örnekleri iki kez yıkamak için 600 µL TBS NP-40 kullanın.

Bunları oda sıcaklığında, her biri 30 dakika boyunca bir sarsıcı (rocker) üzerinde bekletin. Kesitlere, bloklama tamponu ile seyreltilmiş 300 µL florofor konjuge ikincil antikor ekleyin ve karanlıkta, 4 °C'de bir sarsıcı üzerinde 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Ardından, örnekleri az önce gösterildiği gibi iki kez yıkayın.

Ardından, embriyolara 500 µL DAPI solüsyonu ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, örnekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez TBS NP-40 ile yıkayın. Yıkama işlemlerinin ardından, tozsuz bir lamın merkezine anti-fade ajan içeren bir damla montaj medyumu yerleştirin.

Kesişleri montaj medyum damlacığına aktarmak için ince pens kullanın. Ardından, örneğin üzerine tozsuz bir lamel yerleştirin. Slaytları, görüntüleme yapılana kadar folyoya sarılı halde kuru, karanlık ve serin bir yerde saklayın.

Metin protokolünde belirtilen detayları kullanarak, seçilen sekonder antikor floroforları için kanal ayarlarıyla z stack konfokal görüntüler yakalayın ve görüntü dosyalarını kaydedin. Image J gibi bir 3D analiz yazılımı ile veri dosyası kopyasını açın. Görüntü, renk, kanalları birleştir (image, color, merge channels) seçeneğini belirleyerek ilgili kanalları üst üste getirip birleştirilmiş bir görüntü oluşturun.

594 nanometre, 488 nanometre ve DAPI kanallarını sırasıyla kırmızı, yeşil ve maviye boyanacak şekilde seçin. Onaylayın, kompozit oluşturun ve tamam'ı seçin. Görüntüler, yığın, z projeksiyonu (images, stack, z project) seçeneklerini kullanarak z yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonunu gerçekleştirip birleştirilmiş z yığınını tek bir 2D görüntü olarak görselleştirin.

İçteki en iyi z düzlemlerinin başlangıç ve bitiş konumlarını sırasıyla başlangıç slaydı ve durdurma dilimi olarak girin. Projeksiyon tipi olarak maksimum yoğunluğu seçin ve tamam'a tıklayın. 3D analiz yazılımında, kütüphane oluştur'u seçin ve görüntü kütüphanesi için tanımlayıcı bir isim belirleyin.

Ham görüntü dosyalarına tıklayın, bunları oluşturun ve kütüphaneye sürükleyin. Ardından, analiz edilecek bir dosya seçin. Daha sonra, görünüm menüsünden, ana pencerede kanal birleştirilmiş görüntüyü görüntülemek için genişletilmiş odak seçeneğini seçin.

Serbest el ROI aracını seçin ve analiz edilecek ilgi bölgesinin ana hattını çizin. Eylemler sekmesini, ardından görüntüyü kırpmak için seçime göre kırp seçeneğini seçin. Daha sonra kırpılmış görüntü dosyasını yeni bir isimle kaydedin.

Ardından, 3D analizle ilgili belirli nesneleri filtrelemek için protokol oluşturmak üzere ölçümler sekmesine tıklayın. Daha sonra "find objects" (nesneleri bul) seçeneğini protokol penceresine sürükleyin ve ilk protokolü DAPI olarak yeniden adlandırın. Açılır menüden beta tübülin kanalını seçin.

Ardından, aşağıdaki ayarları beta tubulin protokolüne sürükleyin ve "find objects" (nesneleri bul) kısmının altına şu sırayla yerleştirin: "Fill holes and objects" (boşlukları ve nesneleri doldur), "separate touching objects" (temas eden nesneleri ayır), "exclude objects by size" (nesneleri boyuta göre hariç tut) ve "exclude not touching ROIs" (temas etmeyen ROI'leri hariç tut). Şimdi, her protokolün altındaki "measure" (ölç) seçeneğini seçin.

Ardından, DAPI dışındaki tüm kanallar için yoğunluk ve hacim ölçümünü, tüm tübülin etiketlemeleri için ise iskelet uzunluğunu seçin. Ölçülecek bölgenin etrafına bir ROI çizin. Özet sekmesi altında, yazılım bölgeyi işledikten sonra ölçümleri gözlemleyin.

Ardından verileri kopyalayın ve burada gösterildiği gibi işlenebilir bir hesap çizelgesine kaydedin. Çok kuyucuklu bir akış düzeneği oluşturmak için, bir mengene veya şerit testere kullanarak 50 milliliter'lik bir santrifüj tüpünü boyuna ikiye bölün. 70 µm naylon gözenekli ağdan, yarıçapı üç cm olan yedi adet yarım daire kesin ve bunları bölünmüş santrifüj tüpünün bir yarısına sıkıca oturacak şekilde düzeltin.

Akvaryum için uygun silikon sızdırmazlayıcı kullanarak, yarım daireleri santrifüj tüpünün içine 10 mililitrelik derece işaretlerine paralel olacak şekilde yapıştırın. Cihazın iki gün boyunca kurumasına izin verdikten sonra, bir beherdeki suyun içinde iki ila üç saat bekleterek durulayın. Kesilmiş santrifüj tüpünün üst vidalı ucunu, akış cihazında tutulan sıvının derinliği bir çeyrek inç olacak şekilde modelleme kili ile kaplayın.

50 millilitrelik bir şırınganın pistonunu çıkararak yıkama düzeneğini hazırlayın ve ucuna 12 inç ince tüp yerleştirin. Tüpü gidebildiği kadar içeri itin ve eklem yerini kapatmak için modelaj kili kullanın. Sıvının tüm akış cihazından geçmesini sağlamak için, ağ yapısını embriyo medyumu ile önceden ıslatın.

Sıvının tüm bölmelere dolmasını ancak kil kenarlığın bulunduğu ön kısımdan boşalmaya devam etmesini sağlamak için cihazı buz üzerinde eğimli konuma getirin. Yıkama aparatını, buz üzerindeki akış cihazının üzerinde bir ring standa asın. Buz üzerinde 200 milliliters embryo medium soğutun ve tüm hava kabarcıklarının temizlendiğinden ve akış hızının dakikada yaklaşık yedi mililitre olduğundan emin olacak kadarını yıkama aparatına dökün.

Şırınganın yüksekliğini değiştirerek akış hızını ayarlayın. Embriyoları klorundan arındırdıktan ve metin protokolüne göre nocodazole hazırladıktan sonra, nocodazole tedavi grubunun embriyo ortamını değiştirmek için 10 milliliters soğuk nocodazole çalışma çözeltisi kullanın. Petri kaplarını, gelişim evresine uygun bir süre boyunca buz üzerinde bekletin.

Ardından, ateşle uçları düzeltilmiş 1 mililitre cam pipet kullanarak embriyoları, her deney grubu için ayrı bölmeler içeren akış sistemine aktarın. 50 mililitre şırınganın üst kısmına buz gibi soğuk embriyo besiyeri dökerek nocodazole yıkama işlemini başlatın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık yıkamanın ardından, embriyoları sıcak embriyo besiyeri içeren cam petri kaplarına aktarmak için ateşle uçları düzeltilmiş 1 mililitre cam pipet kullanarak mikrotübüllerin yeniden büyümesine izin verin.

Embriyolar transfer edilir edilmez bir zamanlayıcı başlatın. Son olarak, kontrol ve yıkama embriyolarını bir, beş ve 10. dakikalarda, yaklaşık 10 embriyoyu bir mililitre %4 PFA MAB fiksatifi ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyerek, bu videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi fikse edin. Stabil ve dinamik mikrotübüller için marker olarak glu-tübulin ve tyr tübülin kullanın.

Dinamik mikrotübüllerin, nöral kill aşamasında arka beyinde baskın olduğu gösterilmiştir. Kill kısmı, gelişmiş epitelizasyon aşaması olan nöral rod'a dönüştüğünde, özellikle ventral rod'da, anti tyr-tubulin antikoru ile immünoreaktif olan mikrotübüllerin niteliksel olarak azaldığı görülür. Buna karşılık, glu-tubulin nöral kill boyunca dağınık ve noktasal şekilde bulunur ancak mikrotübül hattı boyunca ventral nöral rod'da yoğunlaşmıştır.

Ok uçları, markalamanın arttığı spesifik mikrotübüler demetleri veya yapıları göstermektedir. Nocodazole tedavisi, mikrotübülleri depolimerize ederek yaygın markalamaya neden olur. Mikrotübüller yeniden büyüdükçe, sentrozomdan itibaren uzanırlar.

Ancak, düzlemsel olmayan yörüngeleri nedeniyle bu durum tek bir düzlemde belirgin olmayabilir. Yine de, bazı görüntü analiz yazılımları 3D uzunluk ölçümü yapabilmekte ve böylece nocodazole yıkanmasından sonra mikrotübül büyümesinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Analiz edilen nöral tüpün tüm bölgelerinde, nocodazole yıkanmasının ardından mikrotübüllerin ortalama uzunluğunun zamanla arttığı görülmektedir.

3D görüntü analiz yazılımı kullanılarak veri analizi tamamlandıktan ve kalite kontrol gerçekleştikten sonra, toplam mikrotübüllerin ortalama uzunluğu ve stabil mikrotübüller ile stabil mikrotübüllerin toplam mikrotübüllere oranı gibi faydalı bilgiler ham verilerden elde edilebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik başlangıçtan bitişe kadar bir haftadan fazla sürmez. Bu prosedürü uygularken, mikrotübüller kolayca depolimerize olduğu için örneklerin zamanında toplanması ve işlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedür mutantların analizine de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlam embriyodaki farklı mikrotübül popülasyonlarının nasıl yakalanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.