Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve

Bu protokolün genel amacı, mikrokristallere ve özellikle in vivo kristaller olarak kabul edilen hücrelerde üretilen kristallere uygulanan X-ışını kristalografi metodolojilerini tanıtmaktır. Bu yaklaşımın temel avantajı, mikrokristallerin üretimi, tespiti ve analizi için basit ve verimli bir süreç sunmasıdır. Bu yöntem, canlı hücrelerin içinde büyütülen kristalleri kullanarak mikrokristallerin kullanımını kolaylaştırmayı amaçlamakta; böylece karmaşık saflaştırma süreçlerine ve Aprocox sedasyon denemelerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır.

Bu videoda, bir sinkrotron ışın hattındaki X-ışını kırınımı deneyleri için basit hazırlık ve manipülasyona odaklanacağız. Klasik kristalografinden en çok ayrılan adımları gösteriyoruz. Bu gösterimde, başarılı bir şekilde büyütülmüş vital polihedron proteini kristalleri kullanacağız; ancak bu yöntem herhangi bir bakteriyel, böcek, memeli veya maya hücresinde kristalleşen proteinler için de uygulanabilir.

İlk olarak, cypovirus poliedr proteinini aşırı ifade eden 30 mililitre Sf9 hücresini, dönen bir platform üzerinde 27 derece santigrat sıcaklıkta üç gün boyunca inkübe edin. Sınıf II biyogüvenlik kabini kullanarak ve standart aseptik teknikleri takip ederek ana kültürün sterilitesini korumaya özen göstererek, 500 mikrolitre Sf9 hücre kültürünü steril bir serolojik pipet yardımıyla bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mikrosantrifüj tüpündeki hücrelerden beş mikrolitreyi bir lam üzerine pipetleyin.

Ardından, bir kenarı damlaya değecek şekilde bir lamel camı numunenin üzerine hafifçe eğimli bir şekilde yerleştirin ve hava kabarcığı oluşumunu önleyerek lameli dikkatlice sıvının üzerine indirin. Sonra, slaytın görüntüsünü ters mikroskop ile alın. Hücreleri dikkatlice inceleyin; incelemeye 200x büyütme ile başlayın ve potansiyel bir kristal tespit ettiğinizde maksimum büyütmeye geçin.

Keskin kenarlar ve kırılma indisindeki değişiklikler aranmalıdır. Kristaller tespit edilirse, önceki adımlar tekrarlanarak kristal büyümesini izlemek için kültür günlük olarak incelenmelidir. Sf9 hücreleri için, kültürü bir santrifüj tüpüne aktararak hasat yapın.

Tüpü buz üzerine yerleştirin ve mümkün olan en kısa sürede bir sonraki adıma geçin. Kristal içeren hücrelerin izolasyonu için, enfekte edilmiş dört mililitre Sf9 hücresini akış sitometrisi analizine uygun bir tüpe pipetleyin. Kontrol olarak, yalancı enfekte (mock) bir kültürden eşdeğer sayıda Sf9 hücresi içeren ikinci bir tüp hazırlayın.

Ardından, akış sitometrik değerlendirmeden hemen önce, her iki örneğe mililitre başına bir mikrogram nihai konsantrasyonda propidyum iyodür ekleyin. Şimdi, FSC ve SSC'ye göre hücre ayıklama yapabilen standart bir akış sitometresine kontrol örnek hücrelerini uygulayın. En az 20.000 olayı analiz edin.

Analizden ölü hücreleri, hücre kümelerini ve debrisleri ayıkladıktan sonra, FSC-SSC grafiğini oluşturun. Ardından, kristal içeren örneğin en az 20.000 olayını analiz edin. FSC-SSC grafiğini kontrol grubuyla karşılaştırın ve kristal içeren hücrelere karşılık gelen belirgin bir popülasyonun ortaya çıkıp çıkmadığını inceleyin.

Genellikle daha yüksek SSC veya FSC değerlerinde görülen, kristal içeren hücre popülasyonu çevresinde geçitleri (gate) tanımlayın. Bu geçitlemeyi kullanarak, kristal içeren hücrelerden yaklaşık 150.000 ile 200.000 adedini, önceden 50 µL PBS tamponu ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne ayırın. Hangi popülasyonun kristal içeren hücrelerle ilişkili olduğunu doğrulamak için, ayıklanan örnekleri daha önce açıklanan şekilde ışık mikroskopisi ile görüntüleyin.

Bu aşamada, eğer deneysel faz belirleme gerekiyorsa, hücreler ağır atom çözeltileriyle inkübe edilebilir. Bu yaklaşım, metinde ve diğer incelemelerde açıklanan çeşitli bileşiklerin ve inkübasyon sürelerinin taranmasını takip eder. Önce bir pine monte edilmiş mikro ağı manyetik bir çubuğun ucuna takarak numuneyi yerleştirme araçlarını hazırlayın.

Çubuğu, bir diyaliz şamandırasının yarık kısmına yanlamasına yerleştirin. Ardından, bir cımbızla bir kâğıt fitil alın ve bunları sabitleyin. Devam etmeden önce düzeneğin tamamlandığını tekrar kontrol edin.

Şimdi, hücreleri 0,2% nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde eşit hacimde 0,4% trypan blue çözeltisi ile karıştırın. Hücreleri yeniden süspanse ettikten sonra, ayrıştırılmış hücrelerden 0,5 µL'yi mikro mesh üzerine pipetleyin. Hücrelerin mikro mesh yüzeyine çökmesine izin verdikten sonra, fazla sıvının çoğunu bir kağıt fitil ile tamponlayarak uzaklaştırın. Mikro mesh yeterince kurulanmazsa, hücreler fazla sıvı içerisinde farklı derinliklerde kalacak ve bu durum senkrotron cihazındaki X-ışını demeti ile hizalanmalarını zorlaştıracaktır.

Ayrıca, fazla sıvı arka plan X-ışını saçılımını artıracaktır. Mikro ağ aşırı derecede kurulanırsa, sıvı tamamen uzaklaştırılacak ve numune ızgara açıklıklarında tutunmayacaktır. Optimal kurulama ile mikro ağ üzerinde yalnızca ince bir sıvı tabakası kalır; bu da numuneyi koruyarak ızgara açıklıklarına girmesini sağlar.

Bazı kristaller kriyoprotektan kullanımını gerektirecektir. Bizim durumumuzda buna gerek yoktur, ancak prosedür, numunenin uygulanması ve ardından kurulanmasıyla aynı olacaktır. Yalnızca ince bir sıvı tabakasının kaldığından emin olun.

Mikro ağı hemen sıvı azot ile şok soğutun ve bir sinkrotron mikro odaklı ışın hattına taşımak üzere robotik bir puck'a aktarın. In vivo kristallerin küçük boyutu nedeniyle, mikro odaklı bir kristalografi ışın hattında kırınım verileri toplayın. İlk olarak, mikro ağı goniometreye yerleştirin.

Şimdi, ön ve yan yönelimleri kullanarak mikro ağı ışın yoluyla merkezleyerek başlayın. Mikro ağ ön yüzeyden bakarken, ağın yatay şeritlerinden birinin merkezini hizalayarak hizalamayı hassas bir şekilde ayarlayın. Hizalamada yalnızca küçük yeniden ayarlamalar yaparak bu yatay şerit boyunca veri toplayın.

Şeritteki tüm kristaller test edildiğinde, bir sonraki şeride geçin ve hizalama prosedürünü tekrarlayın. Kristallerin atlanmaması veya iki kez çekilmemesi için, trypan blue renk değişimini kılavuz olarak kullanarak işlenmiş şeritlerin net bir şekilde tanımlandığından emin olun. In vivo mikro kristaller kullanılarak yapı belirleme için iki yöntemin genel bir özeti sunulmaktadır.

Üst satır, kristallerin hücrelerden saflaştırılmasını içeren klasik yaklaşımı tanımlarken, alt satır, veri toplama işlemi için kristallerin konak hücrelerde tutulduğu in cellulo kristalografi yaklaşımını göstermektedir. In cellulo yaklaşımında, enfekte olmamış hücrelerin akış sitometrisi profili, kristal içeren hücrelerin profili ile karşılaştırılır ve kristal içeren hücreleri diğer hücrelerden ayırmak için hangi hücre popülasyonunun seçilmesi gerektiğini belirlemek amacıyla kullanılır. Bu örnekte, polihedra içeren hücreler, enfekte olmamış hücrelere göre daha yüksek yan saçılmaya sahiptir.

Trypan mavisi ile boyanmış hücreler, çoğu sinkrotron ışın hattında bulunan kameralar kullanılarak kolayca görselleştirilebilir. Saflaştırılmış kristaller küçük boyutları nedeniyle tanımlanmaları ve X-ışını demetiyle hizalanmaları zahmetli olsa da, veri toplama sırasında merkezleme işlemlerini minimize etmek ve aynı hücreyi veya kristali iki kez maruz bırakmaktan ya da hücreleri ve kristalleri gözden kaçırmaktan kaçınmak için bir ızgara düzeninde ilerlemek en iyisidir. Bu iş akışı bir kez kavrandığında, kristal içeren hücrelerin hasadından veri toplamaya kadar yaklaşık yarım gün sürer.

Bu prosedür, deneysel faz belirleme için ağır atom doyurma işlemleriyle uyumludur. Polihedron örneğinde, normal yapı, protein ekspresyonunun başlangıcından itibaren sekiz gün içinde elde edilmiştir. Sıvı azotla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve boğulma ile yanıklara karşı önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.