Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Bu hücre kültürü tekniğinin genel amacı, kemik iliği nöral progenitörlerinin fonksiyonel Schwann hücrelerine farklılaşmalarını kolaylaştırmak için zenginleştirmektir. Bu yöntem, kök hücre ve rejeneratif tıpta önemli bir konuyu ele almaktadır: travma sonrası aksonal yeniden büyüme ve remiyelinizasyona yardımcı olmak için glia oluşturmak için sınırlı bir nöroprogenitör kaynağının nasıl kullanılacağı. Bu tekniğin bir avantajı, otolog hücre tedavisinde kullanılmak üzere kemik iliği stromal hücrelerinden nöral hücre genişlemesini kolaylaştırmak için verimli kültür koşullandırmasının kullanılmasıdır.

Kültürde iki gün sonra, harcanan ortamın ve yapışmayan hücrelerin% 75'ini çıkarın ve yapışan hücreleri üç adet 10 milimetre PBS yıkama ile durulayın. Üçüncü yıkamadan sonra, PBS'yi 10 mililitre kemik iliği stomal hücresi veya MSC, büyüme ortamı ile değiştirin ve kültürü inkübatöre geri koyun. Görünür koloniler altı ila yedinci gün arasında ortaya çıkmalıdır.

10. günde, kültürü taze PBS'de yıkayın ve hücreleri 1.5 mililitre rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifi ile ayırın. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, reaksiyonu nötralize etmek için üç mililitre MSC büyüme ortamı ekleyin ve ayrılan hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri beş mililitre taze MSC büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni bir 10 santimetre doku kültürü plakasında santimetre kare yoğunluğu başına dört kez 10 ila dördüncü hücre şeklinde tohumlayın.

Hücreler, geçtikten sonraki iki gün içinde% 80 ila 90 birleşmeye ulaşmalıdır. Hipoksik ön koşullandırma için önce halka kelepçeyi serbest bırakın ve açıkta kalan parçaları %70 etanol ile temizleyin. Hipoksi odasını bileşenlere daha fazla sökün ve 15 dakika boyunca UV ışığı altında sterilizasyon için laminer bir akış başlığına yerleştirin.

Daha sonra, gösterildiği gibi% 80 ila 90 birleşik bir MSC kültürünü 10 mililitre PBS ile yıkayın ve kültürleri 25 milimolar hepes ile desteklenmiş taze MSC büyüme ortamı ile muamele edin. Muamele edilen kültürü yeniden monte edilmiş hipoksi odasına yerleştirin ve halka kelepçesini sıkın. Gaz sızıntısı olmadığından emin olmak için haznenin bağlantı uçlarını kapatın ve %99 nitrojen ve %1 oksijenden oluşan bir gaz karışımını dakikada 10 litre akış hızında hazneye yıkayın.

Beş dakika sonra, odayı 16 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, hücreleri gösterildiği gibi ayırın ve santrifüjleme ile toplayın. Peletleri nöral progenitör ortamda yeniden süspanse edin ve 12 gün boyunca% 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de kültürleri için düşük bağlantılı 6 oyuklu plakalara santimetre kare başına altı kez 10 ila üçüncü hücrelere tohumlayın.

Büyük, yapışık olmayan hücre küreleri altı ila yedinci gün arasında gözlemlenmelidir. Hipoksi koşullu kültürlerde, 10 ila 12. günlerde normoxia altındakilere göre daha fazla nöroküre belirgindir. 12. günde, nörosferleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve nörosferleri santrifüjleme ile toplayın.

DMEM / F12'deki küreleri yeniden süspanse edin ve santimetre kare başına beş ila 10 nöroküre plakala, kuyu başına 1.5 mililitre glial indüksiyon ortamında poli-D-lizin laminin kaplı 6 oyuklu plaka üzerine plakalayın. Küre hücre kültürünü en az yedi gün koruyun ve ortamı her üç günde bir yenileyin. Dorsal kök gangliyonlarını hasat etmek için, ilk embriyoyu yüzüstü pozisyonda diseksiyon mikroskobu altında oda sıcaklığında PBS içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın ve omuriliğin her iki tarafına mikro diseksiyon forsepsleri yerleştirin.

Künt diseksiyon kullanarak, omuriliği boyun açıklığı ve kuyruk saplaması boyunca çıkarmak için forseps kullanarak omuriliği çevredeki yumuşak dokudan ayırın. Serbest kalan omurilikten kalan yumuşak dokuyu sadece omurilik, sinir kökleri ve bağlı sırt kökü gangliyonu kalana kadar çıkarın. Bireysel dorsal kök gangliyonlarını bağlantı sinir köklerinden ayırın.

Ardından, 100'e kadar dorsal kök gangliyonunu 1,5 mililitrelik PBS mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir mililitre pipet ucu ile donatılmış bir pipet kalemi kullanın. Gangliyonları santrifüjleme ile toplayın ve peletleri tüp başına 200 mikrolitre rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifi içinde yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede 10 dakika sonra, dorsal kök ganglion nöron bakım ortamındaki peletleri nazikçe ezmek için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak dorsal kök gangliyonlarını tekrar santrifüjleyin.

Dorsal kök ganglion hücrelerini, kuyu başına 1.5 mililitre dorsal kök ganglion nöron bakım ortamında poli-D-lizin laminin kaplı 6 oyuklu plakaya beş kez 10 ila santimetrekare arasında üçüncü hücrelere tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de kültürde iki gün geçirdikten sonra, hücreleri yıkayın ve nöronal hücre kültürlerini iki gün daha taze dorsal kök ganglion nöron saflaştırma ortamında inkübatöre geri koyun. Üç ila dört bakım ve saflaştırma döngüsünden sonra, dorsal kök ganglion hücre kültürleri, nöronal belirteç Tuj-1 için pozitif ve glial hücre belirteci S100 beta için negatif test etmelidir.

Schwann hücre benzeri hücre kültürünün yedinci gününde, hücreleri PBS'de durulayın ve ardından beş dakika boyunca 37 santigrat derecede oyuk başına 0.5 mililitre rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifi ile ayrışın. Hücre peletini ko-kültür ortamında yeniden süspanse edin ve Schwann hücre benzeri hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 14 günlük ko-kültür için santimetre kare başına 10 ila üçüncü hücreler arasında saflaştırılmış dorsal kök ganglion nöron kültürüne tohumlayın. Sağlıklı MSC'ler, çok sayıda geçiş için korunan ve çoklu potansiyellerini yitirmiş MSC'lerin dörtgen görünümünün aksine konik bir morfoloji sergiler.

Genişlemiş MSC kolonileri, MSC belirteçlerinin ekspresyonunu, hematopoietik kök hücre belirteçlerinin yokluğunu ve adipfojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara farklılaşma kapasitesini göstermelidir. Hipoksik ön koşullandırmaya tabi tutulan sağlıklı MSC kültürü, hem sayı hem de boyut olarak daha büyük nörosferler gösterir. Dorsal kök ganglion nöron ağının saflığı, nöronal belirteç Tuj-1'in ekspresyonu ve Schwann hücre belirteci S100'ün eşlik etmemesi ile doğrulanabilir.

Dorsal kök ganglion nöronları ile ko-kültürde 14 gün sonra, Schwann hücre benzeri hücreler, olgun kadere bağlı Schwann hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonel özelliklerini kazanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre genişletme tekniği uygun şekilde gerçekleştirilirse, nöral progenitör alt popülasyonu 10 gün içinde insan veya sıçan BMSC'lerinde genişletilebilir. Bu prosedürü denerken, BMSC örneğinin nestin pozitif nöroprogenitörlerle donatıldığını ve CD45 pozitif hematopoietik progenitörlerin tümünün çıkarıldığını doğrulamayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, BMSC'lerin nasıl elde edileceğini, nöral progenitör alt popülasyonu için zenginleştirme ve travma sonrası aksonal yeniden büyüme ve remiyelinizasyonu arttırmada kullanılmak üzere nöral progenitör farklılaşmasını kadere bağlı Schwann hücrelerine nasıl yönlendireceğinizi iyi anlamalısınız. Bu prosedürü takiben, olgun Schwann hücreleri gibi miyelinizan glia, hem periferik hem de merkezi sinir sisteminin demiyelinizan yaralanmaları ve hastalıkları için tedavilerin geliştirilmesinde kullanılmak üzere türetilebilir.