Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Bu hücre kültürü tekniğinin genel amacı, fonksiyonel Schwann hücrelerine farklılaşmalarını kolaylaştırmak için kemik iliği nöral progenitörlerini zenginleştirmektir. Bu yöntem, kök hücre ve rejeneratif tıp alanındaki temel bir sorunu ele almaktadır: travma sonrası aksonal yeniden büyüme ve remyelinizasyona yardımcı olacak glia hücreleri üretmek için sınırlı sayıdaki nöroprogenitör kaynağının nasıl kullanılacağı. Bu tekniğin bir avantajı, otolog hücre terapisinde kullanılmak üzere kemik iliği stromal hücrelerinden nöral hücre ekspansiyonunu kolaylaştırmak için etkili kültür koşullandırmasının kullanılmasıdır.

İki günlük kültürden sonra, kullanılmış besiyerinin %75'ini ve yapışmayan hücreleri uzaklaştırın ve yapışık hücreleri üç kez 10 mililitre PBS ile yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, PBS'yi 10 mililitre kemik iliği stromal hücreleri veya MSC büyüme besiyeri ile değiştirin ve kültürü inkübatöre geri yerleştirin. Görünür koloniler altıncı veya yedinci güne kadar ortaya çıkmalıdır.

10. günde, kültürü taze PBS ile yıkayın ve 1,5 mililitre rekombinant enzimatik hücre ayrıştırma reaktifi ile hücreleri ayırın. 37 derece Celsius'ta beş dakika beklettikten sonra, reaksiyonu nötralize etmek için üç mililitre MSC büyüme medyumu ekleyin ve ayrılan hücreleri santrifüjle toplayın. Peleti beş mililitre taze MSC büyüme medyumunda yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni bir 10 santimetre doku kültürü plakasına, santimetrekare başına 4 × 10⁴ hücre yoğunluğunda ekleyin.

Hücreler, pasajlama sonrası iki gün içinde %80 ila %90 konfluens seviyesine ulaşmalıdır. Hipoksik ön koşullandırma için önce halka klembi gevşetin ve açığa çıkan kısımları %70 ethanol ile temizleyin. Ardından hipoksi odasını bileşenlerine ayırın ve 15 dakika boyunca UV ışığı altında sterilizasyon için laminer akışlı kabine yerleştirin.

Ardından, az önce gösterildiği gibi %80 ila %90 konfllüen bir MSC kültürünü 10 mililitre PBS ile yıkayın ve kültürleri 25 milimolar hepes ile desteklenmiş taze MSC büyüme ortamı ile işleme tabi tutun. İşlem görmüş kültürü yeniden monte edilen hipoksi odasına yerleştirin ve halka kelepçeyi sıkın. Gaz sızıntısı olmadığından emin olmak için odanın bağlantı uçlarını mühürleyin ve %99 nitrojen ve %1 oksijen içeren bir gaz karışımını dakikada 10 litre akış hızında odanın içine gönderin.

Beş dakika sonra, hazneyi 16 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, az önce gösterildiği gibi hücreleri ayırın ve santrifüjleme yoluyla toplayın. Pelletleri nöral progenitör ortamında yeniden süspande edin ve 37 °C ile %5 CO2 altında 12 gün boyunca kültürlemek üzere, düşük yapışma özelliğine sahip 6 kuyucuklu plakalara santimetrekare başına 6 × 10³ hücre ekin.

Altıncı veya yedinci güne gelindiğinde, belirgin büyüklükte yapışmayan hücre küreleri gözlemlenmelidir. 10 ile 12. günler arasında, hipoksi koşullu kültürlerde normoksi altındakilere kıyasla daha fazla nörosfer belirginleşir. 12. günde, nörosferleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve nörosferleri santrifüj ile toplayın.

Sferleri DMEM/F12 içerisinde yeniden süspanse edin ve santimetrekare başına beş ila 10 nörosferi, kuyucuk başına 1,5 mililitre glial indüksiyon ortamı kullanarak poli-D-lizin laminin kaplı 6 kuyucuklu plaklara ekin. Küre hücre kültürünü, ortamı her üç günde bir yenileyerek en az yedi gün boyunca sürdürün. Dorsal kök ganglionlarını toplamak için, ilk embriyoyu diseksiyon mikroskobu altında, yüzüstü pozisyonda, oda sıcaklığındaki PBS içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın ve mikro diseksiyon penslerini spinal kordun her iki yanına yerleştirin.

Küt diseksiyon yöntemiyle, boyun açıklığı ve kuyruk kökü boyunca omuriliği çıkarmak için pens yardımıyla omuriliği çevreleyen yumuşak dokudan ayırın. Serbest kalan omurilikten, geriye sadece omurilik, sinir kökleri ve bağlı dorsal kök ganglionları kalana kadar artık yumuşak dokuları temizleyin. Münferit dorsal kök ganglionlarını, bağlı oldukları sinir köklerinden ayırın.

Ardından, 1 ml'lik pipet ucu takılı bir pipet kalem kullanarak 100 adede kadar dorsal kök ganglionunu, PBS içeren 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ganglionları santrifüjleme ile toplayın ve peletleri tüp başına 200 µL rekombinant enzimatik hücre ayrıştırma reaktifi içinde yeniden süspande edin. 37 °C'de 10 dakika beklettikten sonra, dorsal kök ganglionu nöron bakım ortamındaki peletleri nazikçe tritüre etmek için 200 µL'lik bir pipet ucu kullanarak dorsal kök ganglionlarını tekrar santrifüjleyin.

Dorsal kök ganglion hücrelerini, her kuyucukta 1,5 mililitre dorsal kök ganglion nöronu bakım ortamı olacak şekilde, poly-D-lisin laminin kaplı 6 kuyucuklu plakalara santimetrekare başına 5x10³ hücre yoğunluğunda ekleyin. 37 °C ve %5 CO2 ortamında iki günlük kültürleme sonrası, hücreleri yıkayın ve nöronal hücre kültürlerini taze dorsal kök ganglion nöronu saflaştırma ortamında iki gün daha inkübatöre geri yerleştirin. Üç ila dört bakım ve saflaştırma döngüsünden sonra, dorsal kök ganglion hücre kültürlerinin nöronal marker Tuj-1 için pozitif ve glial hücre marker S100 beta için negatif sonuç vermesi gerekir.

Schwann hücresi benzeri hücre kültürünün yedinci gününde, hücreleri PBS ile durulayın ve ardından her kuyucuk için 0,5 milliliters recombinant enzimatik hücre ayrıştırma reaktifi ile 37 degrees Celsius'ta beş dakika boyunca ayrıştırma işlemini gerçekleştirin. Hücre peletini ko-kültür ortamında yeniden süspande edin ve Schwann hücresi benzeri hücreleri, saflaştırılmış dorsal kök ganglion nöron kültürüne, 37 degrees Celsius ve 5%CO2 altında 14 günlük ko-kültür için santimetrekare başına 1 times 10 to the third hücre olacak şekilde ekleyin. Sağlıklı MSC'ler, yüksek pasaj sayısında tutulmuş ve multipotensini kaybetmiş MSC'lerin dörtgen görünümünün aksine, konik bir morfoloji sergiler.

Genişletilmiş MSC kolonileri, MSC markörlerinin ekspresyonunu, hematopoetik kök hücre markörlerinin yokluğunu ve adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hatlara farklılaşma kapasitesini göstermelidir. Hipoksik ön koşullamaya tabi tutulmuş sağlıklı MSC kültürleri, hem sayı hem de boyut bakımından daha büyük nörosferler sergiler. Dorsal kök ganglion nöron ağının saflığı, nöronal markör Tuj-1'in ekspresyonu ve eş zamanlı olarak Schwann hücresi markörü S100'ün yokluğu ile doğrulanabilir.

Dorsal kök ganglion nöronları ile 14 günlük ko-kültürden sonra, Schwann hücresi benzeri hücreler, olgun ve kaderi belirlenmiş Schwann hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonel niteliklerini kazanır. Bu yöntem bir kez ustalaştığında, hücre genişletme tekniği uygun şekilde yürütüldüğü takdirde, nöral progenitör alt popülasyonu insan veya sıçan BMSC'leri içerisinde 10 gün içinde genişletilebilir. Bu prosedürü uygularken, BMSC örneğinin nestin-pozitif nöroprogenitörlere sahip olduğunun ve CD45 pozitif hematopoetik progenitörlerin tamamının uzaklaştırıldığının doğrulanması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, BMSC'lerin nasıl elde edileceği, nöral progenitör alt popülasyonunun nasıl zenginleştirileceği ve travma sonrası aksonal yeniden büyümeyi ve remiyelinizasyonu artırmak amacıyla nöral progenitör diferansiyasyonunun kaderi belirlenmiş Schwann hücrelerine nasıl yönlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, olgun Schwann hücreleri gibi miyelinizan glia hücreleri, hem periferik hem de merkezi sinir sisteminin demiyelizan yaralanmaları ve hastalıkları için tedavilerin geliştirilmesinde kullanılmak üzere türetilebilir.