Name: Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Keşfedin kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini hipoksik ön koşullandırma ile sinir progenitörlerine zenginleştirme ve olgun Schwann hücrelerine farklılaştırma yöntemini. Bu teknik otonom hücre tedavisi için yenileyici tıpta sinir hasarlarının onarımına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik destek için hipoksi oda aparatı ve Bayan Alice Lui&#39;yi sağladıkları için Dr. Nai-Sum Wong&#39;u onaylamak istiyorlar.

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;na ve aynı zamanda Hong Kong Üniversitesi&#39;nden Li Ka Shing Tıp Fakültesi Öğretim ve Araştırma için Canlı Hayvanların Kullanımı Komisyonu tarafından onaylanmış şekilde gerçekleştirildi. İnsanlara kemik iliği örnekleri, bilgilendirilmiş onayı aldıktan sonra sağlıklı bağışçıların iliyak kretinden elde edildi. Protokoller, Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hong Kong Üniversitesi tarafından onaylandı. 1. Sıçan MSC Kültürlerinin Hazırlanması <ol><li> MSK&#39;ların femurdan hasat edilmesi <ol><li> Kullanmadan önce en az 2 saat boyunca 180 ° C&#39;de tüm diseksiyon aletlerini ( yani ince kesme makası, küt uçlu kesme makası ve dişli forseps) otoklavlayın. </li><li> % 15 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S,% 1 v / v) ile takviye edilmiş asgari esansiyel orta-alfa modifikasyonu (aMEM) içeren MSC büyüme ortamı hazırlayın). </li><li> Genç erkek Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g vücut ağırlığı) pentobarbitone aşırı doz (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal) ile kurban edin. NOT: Farklı farelerden alınan ilik örnekleri ayrı ayrı işlenmelidir. </li><li> Kurbağalanmış hayvanları yatay konuma getirin. Karnını ve alt ekstremitelerini% 70 etanol ile iyice temizleyin. </li><li> İnce uyluk makası ve forseps kullanarak medial uylukların üzerindeki cildi ve cilt altı dokuyu çıkarın. Uyluk kaslarını çevresel olarak femur maruz kalana kadar çıkarın. Diz ve kalça eklemleri görene kadar bunu proksimal ve distal olarak devam ettirin. Küt uçlu kesme makası kullanarak kalça ve diz eklemi vasıtasıyla femurun parçalanması. NOT: Kemik iliğini bu aşamada maruz kalacak şekilde transarm etmeyin. Hasarsız femurları ileri işlem için laminer bir akış doku kültür kaputuna aktarın. </li><li> Metrafizden femurun distal ve proksimal uçlarını kesmek için küt uçlu kesme makası kullanın. </li><li> 50 mL konik tüpün üzerine 70 μm hücre süzgeç yerleştirin. Maruz kalmış femoral kanal içine fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) içeren 21 G, 10 mL şırınga yerleştirin ve tekrar tekrar yıkama ile kemik iliği konik tüp içine yıkayın. NOT: Her bir femurun yıkanması için yaklaşık 20 mL PBS kullanılır. Temizlenen içeriğin rengi kan lekeli ve bulanık kalırsa, daha büyük bir hacim kullanılabilir. </li><li> 5 dakika boyunca 480 xg&#39;de santrifüje ederek hücreleri toplayın. Süpernatanı atın. Hücre pelletini 10 mL MSC büyüme ortamı içinde tekrar süspanse edin. 10 cm doku kültürü dish.Place bir hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) içine doku kültürü yemekleri üzerine plakalar hücreleri. Kaplamanın ilk gününü 0 gün olarak kaydedin. NOT: Santrifüjü içeren tüm adımlarda, maksimum yavaşlama freni ayarlayın. </li></ol></li><li> MSC kolonilerinin kurulması ve yaygınlaştırılması NOT: Bu protokol rIlik boşluğundan MSC&#39;leri seçmek için bir araç olarak doku kültürü plastik tutunması üzerinde durur 11 . Kemik iliği içeriğinin doku kültürü plastikine 2 gün boyunca yapışmasına izin verilir. <ol><li> 2. günde yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için kültür plakalarını 10 mL PBS ile üç kez durulayın. Durulamadan sonra PBS&#39;yi 10 mL MSC büyüme maddesi ile değiştirin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve her 3 günde MSC büyüme maddesi ile doldurun. NOT: MSC kolonileri 6-7. Günde görünür olmalıdır ( Şekil 2A ). </li><li> Büyüme ortamı çıkarılarak hücreleri 10 günde geçirin ve hücreleri PBS ile durulayın. 1.5 mL rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifini ilave edin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonu nötralize etmek için 3 mL MSC büyüme ortamı ekleyin. Ayrılmış hücreleri, 250 xg&#39;de 5 dakika santrifüj ederek toplayın. </li><li> PBS içinde uygun bir seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topaklardaki hücreleri ölçün. </li><li> MSC büyüme ortamında 10 cm&#39;lik bir kültür plakasına 40,000 hücre / cm2 yoğunluğunda pasif hücreleri tohumlandı. NOT: Sıçan MSC&#39;leri pasajdan sonraki 2 gün içinde% 80-90&#39;a kadar birleşmelidir ( Şekil 2B ). Hücreler, adım 1.2.2&#39;de tarif edildiği gibi, en fazla 8 pasaj için geçirilebilir. MSC&#39;ler immünositokimya ve trilineaj farklılaşması için kapasiteleri ile karakterize edilebilir ( Şekil 3 ) 12 . Yalnızca 3. ve 8. pasajlar arasındaki MSC kültürleri, daha sonraki hipoksik ön koşullandırma ve sinirsel progenitör zenginleştirmeye tabidir. Geçiş sayısının daha yüksek MSC&#39;leri düzleştirilmiş bir morfolojiyi benimser ( Şekil 2C ) ve yeterli sayıdaki sinir öncüsü üretmez. Bu kültürler atılmalıdır. </li></ol></li></ol> 2. İnsan BMSC Kültürlerinin Hazırlanması <ol><li> 9 mL MSC büyüme ortamı ile 1 mL insan kemik iliği aspiratı seyreltin veHücreleri 10 cm&#39;lik bir doku kültürü çanak üzerinde. Kültürleri hücre inkübatöründe muhafaza edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). </li><li> Ortamı 2 gün sonra çıkarın ve yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kültürleri üç kez 10 mL PBS ile hafifçe durulayın. Son durulamadan sonra, PBS&#39;yi çıkarın ve 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirin. PBS durulamadan sonra her 3 günde bir büyüme ortamını tekrar doldurun. NOT: MSC kolonileri 6-7. Günde görünür olmalıdır. Kolonilerin sayısı konular arasında değişebilir. </li><li> Adım 1.2.2&#39;de açıklandığı gibi, hücreleri 10. günde geçirebilirsiniz. PBS içinde uygun bir seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topaklardaki hücreleri ölçün. MSC büyüme ortamında 10 cm&#39;lik bir kültür plakası üzerine pasifleştirilmiş hücreleri 40.000 hücre / cm2 yoğunluğunda tohumlandı. NOT: İnsan MSC&#39;leri ( Şekil 2D ), sıçan MSC&#39;lerine benzer bir morfolojiyi gösterir ve aynı şekilde geçişten sonraki 2 gün içinde% 80-90&#39;lık birleşmeye ulaşmalıdır. Onlar chara olmalılarİmmünositokimya ve trilineaj farklılaşması için kapasiteleri vasıtasıyla citerleştirilir 12 . Sıçan MSC&#39;lerde olduğu gibi, geçit 3 ve 8 arasında olan insan MSC&#39;leri, daha sonraki hipoksik önkoşullamaya ve sinirsel progenitör zenginleştirmeye tabidir. </li></ol> 3. Hipoksik Ön Şartlandırma <ol><li> Halka kelepçeyi bıraktıktan sonra hipoksi oda bileşenlerini ( örn. Taban, kapak, tepsiler) sökün ve tek tek parçaları% 70 etanolle silerek temizleyin. 15 dakika için UV ışığı altında sterilizasyon için oda bileşenleri bir laminer akış doku kültür kaputu yerleştirin. </li><li> Hipoksik ön koşullandırmadan önce ortamı alın ve sıçan ve insan MSC kültürlerini (bölüm 1 ve 2) 10 mL PBS ile durulayın. PBS, 25 mM HEPES ile takviye edilmiş 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirilir. NOT: 10 cm&#39;lik bulaşıklar üzerinde kültürlenen MSC&#39;ler, hipoksik ön koşullandırmadan önce% 80-90&#39;lık konfluene ulaşmış olmalıdır. </li><li> Cul&#39;u yerleştirinYemekleri hipoksi odasında arayın. Bölme bileşenlerini tekrar monte edin ve halka kelepçe sıkın. % 99 N 2 /% 1 O 2 gaz karışımını 5 dakika süreyle 10 L / dk&#39;lık bir akış oranında odacık içine boşaltın. </li><li> Gaz kaçağı olmadığından emin olmak için hipoksi odacığının bağlantı uçlarını kapatın. Oda hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) içinde 16 saat boyunca yerleştirin. </li><li> Hipoksik önkoşullamanın tamamlanmasının ardından, sonraki nöral progenitör zenginleştirme kültürüne hazırlık amacıyla bölmeden kültürleri çıkarın. </li></ol> 4. Sinirsel Progenitör Zenginleştirme Kültürü <ol><li> B27 (% 2 v / v), bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng / mL), epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 ng / mL) ile takviyeli Dulbecco&#39;nun modifiye kartal ortamı / Ham besin karışımı F12&#39;den (DMEM / F12) oluşan sinirsel progenitör ortamını hazırlayın. 20 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v). </li><li> Adım 1.2.2&#39;de açıklandığı gibi hipoksik önkoşullamış sıçan / insan MSC&#39;lerini çıkarın.Ayrılmış hücreleri, 250 xg&#39;de 5 dakika santrifüj ederek toplayın. PBS içindeki uygun seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topak içerisindeki hücreleri ölçün. </li><li> Nöral progenitör ortamda hücreleri tekrar süspanse edin ve 6.000 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunluğa sahip düşük bağlanmış, 6 oyuklu plakalar üzerine tohum ekleyin. Kültürü bir hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) 12 gün boyunca yerleştirin. Sinir öncü madde ortamının% 75&#39;ini her 3 günde bir doldurun. NOT: Boyutlanabilir yapışkan olmayan hücre kümeleri 6-7. Günde gözlemlenmelidir. 10-12. Günde, ≥ 100 μm çapında nevrosferler görülebilir ( Şekil 4 ). Hipoksik önkoşullamış MSC&#39;ler normoksik koşullar altında kültüre edilen MSC&#39;lere kıyasla daha fazla sinir küresi üretmelidir 9 . </li><li> 12 mL&#39;de nörosferler toplayın ve 10 mL&#39;lik bir pipete aspire edin ve bunları 15 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın. Sinirküreleri, 250 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. NOT: Neurospheres olabilirNestin ve GFAP 7 gibi nöral progenitör belirteçleri için 12. günde karakterizedir. </li></ol> 5. Öldürülen Schwann Hücrelerinin DRG Nöronları ile birlikte Kültür yoluyla Üretilmesi <ol><li> Saflaştırılmış sıçan DRG nöronlarının hazırlanması <ol><li> Kullanmadan önce en az 2 saat süreyle tüm diseksiyon aletlerini ( yani diseksiyon makası, forseps, iki mikrodiseksiyon forsepsi ve mikrodiseksiyon makası) otoklavda tutun. </li><li> Poly-D-lisin (PDL, PBS içinde 10 ug / mL) ile 6-iyi doku kültürü plakalar 4 ° C&#39;de gece boyunca kaplayın. PDL&#39;yi çıkarın ve göz başına 1.5 mL PBS ile durulayın. </li><li> Plakları laminin (PBS içinde 10 ug / mL) ile kaplayarak, 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle uygulayın. Tabletleri göz başına 1.5 mL PBS ile durulayın. </li><li> B27 (% 2 v / v), L-glutamin (% 1 v / v), sinir büyüme faktörü (NGF, 20 ng / mL) ve P / S ile desteklenen nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron bakım ortamını hazırlayın % V / v). </li><li>B27 (% 2 v / v), L-glütamin (% 1), NGF (20 ng / mL), P / S (% 1), florodeoksiüridin (FDU, 10) takviyeli nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron saflaştırma ortamını hazırlayın Μg / mL), ve uridin (10 μg / mL). </li><li> Hamile fareleri 14-15 gebelik haftasında pentobarbital aşırı doz ile kurutun (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal). </li><li> Kurbağalanmış hayvanları yatay konuma getirin. Karnını% 70 etanol ile iyice temizleyin. </li><li> İnce diseksiyon makası ve forseps kullanarak hayvanın alt karın duvarını boyuna kesin. Diseksiyon makası kullanarak rahmin tanımlanması ve çıkarılması. Embriyonları açığa çıkarmak ve çıkarmak için uterus duvarını kesin. Embriyoları PBS ile dolu steril, 10 cm&#39;lik bir kültür kabına aktarın. Kültüre buz koyun. </li><li> Diseksiyon için hazırlanan embriyo, PBS (oda sıcaklığı) ile dolu steril, 10 cm&#39;lik bir kültür kabına aktarın ve diseksiyon mikroskopunun altında konumlandırın. Embriyo salladı konumda olsun. DEĞİLE: Beyaz renkli omurilik ve eklenen DRG&#39;ler, embriyonun dorsal yüzeyi üzerinde, yarı saydam cildi üzerinden görülebilir. </li><li> Spinal kordun her iki yanından mikro-delici forseps yerleştirin ve çevresindeki yumuşak dokudan omuriliği ayırmaya başlamak için künt diseksiyon uygulayın. Boyun açıklığı ve kuyruk sapı boyunca mikrodiseksiyon forseps kullanarak hayvan ücretsiz omurilik kesin. Çevreleyen yumuşak dokudan kurtarmak için kordonun ventral yüzeyi üzerinde daha fazla künt diseksiyon gerçekleştirin. </li><li> Serbest omuriliğin dorsal yüzeyi üzerinde kalan yumuşak dokuyu çıkarmak için mikroskopi forseps kullanın. NOT: Bu aşamada yalnızca omurilik, sinir kökleri ve bağlı DRG kalmalıdır. </li><li> Mikrodiseksiyon forseps kullanarak bağlanan sinir köklerinden bireysel DRG&#39;ler ayırın. DRG&#39;leri PBS içeren 1.5 mL&#39;lik steril bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL&#39;lik bir uça tutturulmuş bir pipet kalemi kullanın. NOT: Her bir 1.5 mL tüp için, maksimum100 DRG barındırabilir. </li><li> 5 dakika için 250 xg&#39;de DRG&#39;leri santrifüjleyin ve rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifine (tüp başına 200 μL) tekrar süspanse edin. 10 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). 250 xg&#39;de 5 dakika boyunca DRG&#39;leri santrifüjleyin, süpernatanı alın ve DRG nöron bakım ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. 200 μL&#39;lik bir pipet ucu kullanarak peleti yumuşak öğütme ile parçalayın. Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak pellet içindeki hücreleri ölçün. </li><li> Hücreleri, hücre başına 1.5 mL DRG nöron bakım ortamında PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara 5,000 hücre / cm2 yoğunlukta tohum ekti. Kültür iki gün sonra DRG nöron bakım ortamı çıkarın, PBS ile durulayın ve DRG nöron saflaştırma orta ile değiştirin. NOT: Her saflaştırma döngüsü için DRG kültürlerini saflaştırma ortamı ile 2 gün süreyle, ardından bakım ortamında 1 gün inkübe edin. 3-4 saflaştırma çevriminden sonra, remTüm endojen gliaların oval olması bekleniyor 7 . Bu yaklaşık 14 gün sürmelidir. Saflaştırılmış kültürler, nöronal markör TUJ1 için pozitiflik gösterir ve S100β ekspresyonu için yoktur ( Şekil 5 ). </li></ol></li><li> Schwann hücre benzeri hücrelerin üretilmesi <ol><li> Β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (% 10) ile desteklenmiş αMEM&#39;den oluşan glial indüksiyon ortamını hazırlayın ve P / S (% 1 v / v). </li><li> Bölüm 4&#39;te hazırlanan nevroküreleri, her bir göz başına 1.5 mL glial indüksiyon ortamında cm2 başına 5-10 küre yoğunluğunda plakaya / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara yerleştirin. Hücreleri PBS ile duruladıktan sonra glial indüksiyon maddesini her 2 günde değiştirin. NOT: Çekirdekli sinirkürelerden alınan hücrelerin 2. günde dışarı doğru göç ettiği görülmektedir. 7. günde göç eden hücrelerin konik bir görünümü vardır ve Schwann hücresi için immünopozitiflik göstermelidirP75 nörotrofin reseptörü (p75) ve S100β 7 belirteçleri. Bu hücrelere SCLCs denir. </li></ol></li><li> DRG nöronları ile SCLC&#39;lerin birlikte kültürlenmesi <ol><li> 1: 1 hacim / hacim oranında DRG nöron bakım ortamı (adım 5.1.4) ve glial indüksiyon ortamı (adım 5.2.1) içeren kokültür ortamını hazırlayın. </li><li> FBS (% 5), β-Heregulin (10 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v) ile takviye edilmiş DMEM / F12&#39;den oluşan Schwann hücre bakım ortamını hazırlayın. </li><li> 7. SCLC&#39;lerden kültür ortamını çıkarın, PBS ile yıkayın ve 5 dakika süreyle 37 ° C&#39;de rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifinin 0,5 mL / çukuru ile inkübe edin. Kültür ortamında SCLC&#39;leri tekrar süspanse edin. </li><li> Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün. </li><li> Saflaştırılmış DRG nöron kültürlerine SCLC&#39;leri 1,000 hücre / cm2 yoğunluğunda ekti. Her 2 günde bir orta yenileyerek, kültürleri 14 gün boyunca muhafaza edin. NOT: Kokültür sırasında SCLC&#39;ler olgun Schwann hücrelerine özgü iğ benzeri morfolojiyi elde etmiştir ( Şekil 6 ). Bu hücreler, büyüme faktörlerinden çekildikten sonra fenotiplerinde kalır ve aksonları in vitro ve in vivo miyelinasyon yapabilirler 7 , 10 . Schwann hücre belirteçlerinin pozitifliği ( yani, p75 ve S100β) immünofloresans ile izlenmelidir. </li><li> Kokültürü tamamladıktan sonra, kademe 1.2.2&#39;de anlatıldığı gibi, kaderi tamamlayan Schwann hücrelerini geçin. Kuyu başına 0.5 mL ayrışma reaktifi kullanın. Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün. </li><li> Kaderle bağlı Schwann hücrelerini 10.000 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunlukta Schwann hücre bakım ortamında tekrar süspanse edin. İmmünofloresans için PDL / laminin kaplı 6 gözlü plakalara tohum hücreleri. NOT: Kültürler kaçınılmaz olarak bir fibroblastHücre kaderi 7 . Bu hücreler, birlikte yetiştirme tamamlandıktan sonra, kadere bağlı Schwann hücreleriyle birlikte pasajlanır. Bu fibroblast substratumun üzerinde yer alan Schwann hücreleri, başka yerlerde tarif edildiği gibi, PBS&#39;nin (4 ° C) &quot;soğuk jetleri&quot; ile yıkandıktan sonra kolayca sökülebilir ve daha da genişletilebilir. Kadere bağlı Schwann hücreleri bakım ortamında 1 ay boyunca genişletilebilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation%3A+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li>
<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li>
<li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li>
<li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li>
<li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia%2Fischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li>
<li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li>
<li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).</li>
<li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection%3A+phenotype%2C+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+jet%3A+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic%2C+apoptosis-inducing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li>
</ol>

Bu yazının tüm yazarları beyan etmek için herhangi bir açıklama yapmamıştır.

Hipoksik ön koşullandırma ve nörosfer kültürünü kullanarak nöral progenitörleri zenginleştirmeden önce MSC&#39;lerin &quot;kök salanlığını&quot; korumak esastır. Tecrübelerimize göre, multipotent MSC&#39;ler, uzatılmış fibroblast benzeri morfolojileri ile güvenilir şekilde tanımlanabilir. Buna karşın, belirgin sitokkelet stres lifleri ile daha yassı, dört köşeli morfoloji benimseyen MSC&#39;ler, nöral hücre kaderlerini kolayca kabul etmemekte ve atılmaları gerekmektedir. Genel olarak, pasaj rakamları sekizden büyük MSC&...

Sinir öncüleri ve türevlerinin transplantasyonu, travmatik sinir yaralanması 1 , 2 ve nörodejenerasyon 3 , 4&#39;ü takiben bir tedavi stratejisi olarak vaat ettiğini göstermektedir. Klinik uygulamadan önce aşağıdakileri sağlamak önemlidir: i) otolog bir kök / progenitör hücresi kaynağına erişmek ve genişletmek için bir yöntem ve ii) bunları ilgili, olgun hücre tiplerine yönlendiren bir araç 3 . Omurilik yaralanması için hücre tedavisine olan ilgimiz yetişkin dokulardan nöral progenitörlerin sağlam, otolog bir hücre kaynağı aramamıza neden oldu. MSC&#39;lerin bir alt popülasyonu nöral krestten kaynaklanır ve kemik iliğinden kolaylıkla erişilebilir durumdadır. Bu hücreler nöronlar ve glia üretebilen sinir öncüleridır 5 . Serebral iskemi hayvan modelleri, hipoksinin prol<html> Beyinde nöral progenitörlerin çıkarımı ve multipotansı 6 . Bu, kemik iliği kaynaklı nöral progenitörlerin üzerine genişleme aracı olarak hipoksik ön koşullanmayı kullanma temelini oluşturdu. Yaralı omuriliğe Schwann hücrelerinin transplantasyonu rejenerasyon 2&#39;yi teşvik eder. SCLC&#39;ler, gliogenik faktörlerle ( yani, β-Heregulin, bFGF ve PDGF-AA) destek yoluyla MSC&#39;lerden üretilebilir, ancak fenotipik instabiliteyi gösterirler. Büyüme faktörlerinin geri çekilmesi üzerine, fibroblast benzeri bir fenotipe dönüşürler 7 . Anormal farklılaşma ve karsinogenez riski nedeniyle, hücre transplantasyonunda fenotipik instabilite istenmez. Schwann hücresi prekürsörleri, embriyonik periferik sinir 8 içindeki akson demetleri ile ilişkili olduğu için, saflaştırılmış embriyonik DRG nöronları 7 ile birlikte kültürel SCLC&#39;lere yol açtık ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 9. Elde edilen olgun Schwann hücreleri , in vitro 7 , 9 ve in vivo 10&#39;da kadere bağlı ve ispat fonksiyonudur. MSC&#39;lerden nöral progenitörlerin zenginleştirilmesi için protokolümüz basit ve etkili olup sonraki tahliller için hücre sayısının artmasına neden olur. Kader kaynaklı Schwann hücrelerinin kokültür platformu vasıtasıyla türetilmesi, glial farklılaşmanın incelenmesine ve potansiyel klinik uygulama için stabil ve fonksiyonel Schwann hücrelerinin oluşturulmasına izin verir.

<table><tbody><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>PHG0313</tr><tr><td>Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Sinir büyüme faktörü (NGF)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Trombosit kaynaklı büyüme faktörü-AA (PDGF-AA)</td> <td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF alanı (&beta; -Her)</td> <td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2 '- deoksiüridin (FDU)</td> <td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher bilimsel</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher bilimsel</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan kültür</td> <td>için 10 cm plakaTPP</td><td>93100</td><td>Doku kültürü uyumu ile MSC'lerin seçimi için kullanılır</td></tr><tr><td>Yapışkan kültür için 6 oyuklu plaka</td><td>TPP</td><td>92006</td> Yapışmayan kültür için UltraLow 6 oyuklu <td>pasajı takiben MSC'lerin genişletilmesi için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Nöral progenitör zenginleştirme</td></tr><tr><td>için kullanılır anti-insan CD90 (Thy-1)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan/sıçan STRO-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan nestin</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anti-sıçan CD90 (Thy-1)</td> <td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>anti-sıçan CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>anti-sıçan nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-sıçan CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 ve beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sınıf III-beta tübülin (Tuj-1)</td> <td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan çekirdeği</td><td>Milipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksi odası</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampon</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

olgun schwann hücrelerinin Üretimi İçin bir kaynak olarak kemik İçi türe göre progenitör hücrelerin hipoksik Ön koşullandırma

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Bu el yazması, kemik iliği stromal hücresi (MSC) popülasyonundan nöral progenitörler için zenginleştirmek ve bundan sonra olgun Schwann hücre kaderini yönlendirmek için bir araç tanımlamaktadır. Sıçan ve insan MSC&#39;leri, epidermal büyüme faktörü (EGF) / bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) takviyesi ile düşük bağlanma alt tabakasında nörosferler olarak genişleyen, ardından geçici hipoksik koşullara (1 saat boyunca% 1 oksijen) tabi tutuldu. Neurospheres, poli-D-lizin / laminin kaplı doku kültürü plastik üzerine ekildi ve Schwann hücresi benzeri hücreleri (SCLC&#39;ler) üretmek için β-Heregulin, bFGF ve trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) içeren bir gliojenik kokteylde kültürlendi. SCLC&#39;ler, E14-15 gebe Sprague Dawley sıçanlarından elde edilen saflaştırılmış dorsal kök gangliyon (DRG) nöronları ile 2 hafta boyunca kokültür yoluyla kader taahhüdüne yönlendirildi. Olgun Schwann hücreleri S100β / p75 ekspresyonunda kalıcılık sergiler ve miyelin segmentleri oluşturabilir. Bu şekilde üretilen hücrelerin potansiyelleriOmurilik hasarını takiben otolog hücre transplantasyonunda ve hastalığın modellemesinde uygulanmalar.

Protokolümüzdeki başlıca aşamalara genel bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. Özetle, sıçan ve insan MSC&#39;leri, doku kültürü plastiğine uyularak seçilir. Genişletilmiş MSC&#39;ler hipoksi ile önkoşullandırılır ve daha sonra nörosfer oluşturan koşullara tabidir. Neurospheres kaplanır ve SCLCs ayrımına izin verilir. SCLC&#39;ler, kadere bağlı Schwann hücreleri oluşturmak için saflaştırılmış DRG nöronlarıyla birlikte kültürlenir. <p class="jove_con...

Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC&#39;ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Bu hücre kültürü tekniğinin genel amacı, fonksiyonel Schwann hücrelerine farklılaşmalarını kolaylaştırmak için kemik iliği nöral progenitörlerini zenginleştirmektir. Bu yöntem, kök hücre ve rejeneratif tıp alanındaki temel bir sorunu ele almaktadır: travma sonrası aksonal yeniden büyüme ve remyelinizasyona yardımcı olacak glia hücreleri üretmek için sınırlı sayıdaki nöroprogenitör kaynağının nasıl kullanılacağı. Bu tekniğin bir avantajı, otolog hücre terapisinde kullanılmak üzere kemik iliği stromal hücrelerinden nöral hücre ekspansiyonunu kolaylaştırmak için etkili kültür koşullandırmasının kullanılmasıdır.İki günlük kültürden sonra, kullanılmış besiyerinin %75'ini ve yapışmayan hücreleri uzaklaştırın ve yapışık hücreleri üç kez 10 mililitre PBS ile yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, PBS'yi 10 mililitre kemik iliği stromal hücreleri veya MSC büyüme besiyeri ile değiştirin ve kültürü inkübatöre geri yerleştirin. Görünür koloniler altıncı veya yedinci güne kadar ortaya çıkmalıdır.10. günde, kültürü taze PBS ile yıkayın ve 1,5 mililitre rekombinant enzimatik hücre ayrıştırma reaktifi ile hücreleri ayırın. 37 derece Celsius'ta beş dakika beklettikten sonra, reaksiyonu nötralize etmek için üç mililitre MSC büyüme medyumu ekleyin ve ayrılan hücreleri santrifüjle toplayın. Peleti beş mililitre taze MSC büyüme medyumunda yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni bir 10 santimetre doku kültürü plakasına, santimetrekare başına 4 × 10⁴ hücre yoğunluğunda ekleyin.Hücreler, pasajlama sonrası iki gün içinde %80 ila %90 konfluens seviyesine ulaşmalıdır. Hipoksik ön koşullandırma için önce halka klembi gevşetin ve açığa çıkan kısımları %70 ethanol ile temizleyin. Ardından hipoksi odasını bileşenlerine ayırın ve 15 dakika boyunca UV ışığı altında sterilizasyon için laminer akışlı kabine yerleştirin.Ardından, az önce gösterildiği gibi %80 ila %90 konfllüen bir MSC kültürünü 10 mililitre PBS ile yıkayın ve kültürleri 25 milimolar hepes ile desteklenmiş taze MSC büyüme ortamı ile işleme tabi tutun. İşlem görmüş kültürü yeniden monte edilen hipoksi odasına yerleştirin ve halka kelepçeyi sıkın. Gaz sızıntısı olmadığından emin olmak için odanın bağlantı uçlarını mühürleyin ve %99 nitrojen ve %1 oksijen içeren bir gaz karışımını dakikada 10 litre akış hızında odanın içine gönderin.Beş dakika sonra, hazneyi 16 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, az önce gösterildiği gibi hücreleri ayırın ve santrifüjleme yoluyla toplayın. Pelletleri nöral progenitör ortamında yeniden süspande edin ve 37 °C ile %5 CO2 altında 12 gün boyunca kültürlemek üzere, düşük yapışma özelliğine sahip 6 kuyucuklu plakalara santimetrekare başına 6 × 10³ hücre ekin.Altıncı veya yedinci güne gelindiğinde, belirgin büyüklükte yapışmayan hücre küreleri gözlemlenmelidir. 10 ile 12. günler arasında, hipoksi koşullu kültürlerde normoksi altındakilere kıyasla daha fazla nörosfer belirginleşir. 12. günde, nörosferleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve nörosferleri santrifüj ile toplayın.Sferleri DMEM/F12 içerisinde yeniden süspanse edin ve santimetrekare başına beş ila 10 nörosferi, kuyucuk başına 1,5 mililitre glial indüksiyon ortamı kullanarak poli-D-lizin laminin kaplı 6 kuyucuklu plaklara ekin. Küre hücre kültürünü, ortamı her üç günde bir yenileyerek en az yedi gün boyunca sürdürün. Dorsal kök ganglionlarını toplamak için, ilk embriyoyu diseksiyon mikroskobu altında, yüzüstü pozisyonda, oda sıcaklığındaki PBS içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın ve mikro diseksiyon penslerini spinal kordun her iki yanına yerleştirin.Küt diseksiyon yöntemiyle, boyun açıklığı ve kuyruk kökü boyunca omuriliği çıkarmak için pens yardımıyla omuriliği çevreleyen yumuşak dokudan ayırın. Serbest kalan omurilikten, geriye sadece omurilik, sinir kökleri ve bağlı dorsal kök ganglionları kalana kadar artık yumuşak dokuları temizleyin. Münferit dorsal kök ganglionlarını, bağlı oldukları sinir köklerinden ayırın.Ardından, 1 ml'lik pipet ucu takılı bir pipet kalem kullanarak 100 adede kadar dorsal kök ganglionunu, PBS içeren 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ganglionları santrifüjleme ile toplayın ve peletleri tüp başına 200 µL rekombinant enzimatik hücre ayrıştırma reaktifi içinde yeniden süspande edin. 37 °C'de 10 dakika beklettikten sonra, dorsal kök ganglionu nöron bakım ortamındaki peletleri nazikçe tritüre etmek için 200 µL'lik bir pipet ucu kullanarak dorsal kök ganglionlarını tekrar santrifüjleyin.Dorsal kök ganglion hücrelerini, her kuyucukta 1,5 mililitre dorsal kök ganglion nöronu bakım ortamı olacak şekilde, poly-D-lisin laminin kaplı 6 kuyucuklu plakalara santimetrekare başına 5x10³ hücre yoğunluğunda ekleyin. 37 °C ve %5 CO2 ortamında iki günlük kültürleme sonrası, hücreleri yıkayın ve nöronal hücre kültürlerini taze dorsal kök ganglion nöronu saflaştırma ortamında iki gün daha inkübatöre geri yerleştirin. Üç ila dört bakım ve saflaştırma döngüsünden sonra, dorsal kök ganglion hücre kültürlerinin nöronal marker Tuj-1 için pozitif ve glial hücre marker S100 beta için negatif sonuç vermesi gerekir.Schwann hücresi benzeri hücre kültürünün yedinci gününde, hücreleri PBS ile durulayın ve ardından her kuyucuk için 0,5 milliliters recombinant enzimatik hücre ayrıştırma reaktifi ile 37 degrees Celsius'ta beş dakika boyunca ayrıştırma işlemini gerçekleştirin. Hücre peletini ko-kültür ortamında yeniden süspande edin ve Schwann hücresi benzeri hücreleri, saflaştırılmış dorsal kök ganglion nöron kültürüne, 37 degrees Celsius ve 5%CO2 altında 14 günlük ko-kültür için santimetrekare başına 1 times 10 to the third hücre olacak şekilde ekleyin. Sağlıklı MSC'ler, yüksek pasaj sayısında tutulmuş ve multipotensini kaybetmiş MSC'lerin dörtgen görünümünün aksine, konik bir morfoloji sergiler.Genişletilmiş MSC kolonileri, MSC markörlerinin ekspresyonunu, hematopoetik kök hücre markörlerinin yokluğunu ve adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hatlara farklılaşma kapasitesini göstermelidir. Hipoksik ön koşullamaya tabi tutulmuş sağlıklı MSC kültürleri, hem sayı hem de boyut bakımından daha büyük nörosferler sergiler. Dorsal kök ganglion nöron ağının saflığı, nöronal markör Tuj-1'in ekspresyonu ve eş zamanlı olarak Schwann hücresi markörü S100'ün yokluğu ile doğrulanabilir.Dorsal kök ganglion nöronları ile 14 günlük ko-kültürden sonra, Schwann hücresi benzeri hücreler, olgun ve kaderi belirlenmiş Schwann hücrelerinin özelliklerini ve fonksiyonel niteliklerini kazanır. Bu yöntem bir kez ustalaştığında, hücre genişletme tekniği uygun şekilde yürütüldüğü takdirde, nöral progenitör alt popülasyonu insan veya sıçan BMSC'leri içerisinde 10 gün içinde genişletilebilir. Bu prosedürü uygularken, BMSC örneğinin nestin-pozitif nöroprogenitörlere sahip olduğunun ve CD45 pozitif hematopoetik progenitörlerin tamamının uzaklaştırıldığının doğrulanması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, BMSC'lerin nasıl elde edileceği, nöral progenitör alt popülasyonunun nasıl zenginleştirileceği ve travma sonrası aksonal yeniden büyümeyi ve remiyelinizasyonu artırmak amacıyla nöral progenitör diferansiyasyonunun kaderi belirlenmiş Schwann hücrelerine nasıl yönlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, olgun Schwann hücreleri gibi miyelinizan glia hücreleri, hem periferik hem de merkezi sinir sisteminin demiyelizan yaralanmaları ve hastalıkları için tedavilerin geliştirilmesinde kullanılmak üzere türetilebilir.

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu videoda, multipotent kemik iliği stromal hücrelerinden (BMSC'ler) Schwann hücresi benzeri hücreler elde etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Başlangıçta, BMSC'ler hipoksi tedavisine tabi tutulur, ardından nöronal progenitör hücrelere yönlendirilmiş farklılaşma gelir. Daha sonra, bu progenitör hücrelerin Schwann hücresi benzeri hücrelere dönüşümünü indüklemek için spesifik ortam ve kültür koşulları kullanılır.

Kemik İliği Stromal Hücrelerinden Schwann Hücresi Benzeri Hücrelerin Üretilmesi

Bu video, sıçan embriyolarından dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarını izole etmek ve olgun Schwann hücreleri oluşturmak için bunları Schwann hücre öncüleri ile birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. İzole edilen DRG'ler, nöronları ve glial hücreleri izole etmek için işlenir. İzole edilen hücreler, nöronları saflaştırmak için kültürlenir ve daha sonra bir ko-kültür ortamında Schwann hücre benzeri hücreler (SCLC'ler) ile birlikte kültürlenir. DRG nöronları ile etkileşim,...

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Burada, hasarlı bir hematopoietik ve bağışıklık sisteminin yeniden inşası için terapötik hematopoietik kök/progenitör hücreleri hasat etmek için kemik morfogenetik protein-2 yüklü jelatin iskeleler tarafından tetiklenen in vivo osteo-organoidler kurduk. Genel olarak, bu yaklaşım hücre tedavileri için umut verici bir hücre kaynağı sağlayabilir.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Keşfedin kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini hipoksik ön koşullandırma ile sinir progenitörlerine zenginleştirme ve olgun Schwann hücrelerine farklılaştırma yöntemini. Bu teknik otonom hücre tedavisi için yenileyici tıpta sinir hasarlarının onarımına yardımcı olur.

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Daha fazla video keşfet