Name: Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Keşfedin, vasküler endotelyal kök hücrelerin damar oluşum potansiyelini meme yağ pedi transplantasyonu ve bütün-doku hazırlama teknikleriyle in vivo değerlendirmeyi. Bu yöntem kök hücre biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmalarında uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (315030045 ve 31371500, YAZ için 31401245, QCY için 31401245), Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2014CB964800), Çin Bilimler Akademisi (XDB19000000 ila YAZ) ve Çinli Hücre Biyolojisi Derneği (QCY&#39;ye Erken Kariyer Bursu).

Deneysel prosedürler, Şanghay Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokol SIBCB-NAF-15-002-S335-003 kapsamında onaylandı. 1. Fare Meme Bandı&#39;ndan VESC&#39;lerin izolasyonu <ol><li> Meme bezi hasadı ve doku sindirimi. <ol><li> Ağırlıkları 20 ile 25 g arasında değişen dokuz bağışçı olarak 8 haftalık Actin-GFP olgun bakire raportör farelerini kullanın. Not: Donör kaynaklı hücreler, GFP ifadesi ile kolayca izlenebilir. </li><li> RPMI1640 içinde% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 kalem / strep ve 25 mM HEPES içeren doku sindirim ortamı orta hazırlayın. Karışımı 0.22 μm&#39;lik bir filtreyle süzün ve bir su banyosu içerisinde 37 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> Bir CO2 odası içinde fareler kurban. Dördüncü inguinal meme bezi çifti ilk önce dikey bir cilt yaparak ayırın(Veya cerrahi makas) alt karın orta hattında ncision. Forseps kullanarak kasık meme bezini ortaya çıkarmak için cildi yavaşça bir taraftan soyun. Dördüncü kasığa ait meme bezlerini her iki taraftan alın ve makas kullanarak 6 cm&#39;lik bir Petri kabında ince parçalar halinde kesin. <ol><li> Kıyılmış dokunun toplam ağırlığını ölçün ve 50 mL tüp içine yerleştirin. Not: Sonuçtaki doku kıymanın her bir parça için 1 mm 3&#39;den küçük olduğundan emin olun. Tipik bir verim, her hayvan için yaklaşık 5.000 VESC&#39;dir. </li></ol></li><li> 1 ml doku kıyma başına 10 ml&#39;lik bir hacimde 50 ml&#39;lik kapaklı bir santrifüj tüpüne sindirim ortamı ortamı hazırlayın. Sindirim tamponu oluşturmak için 10 mL sindirim ortamı ortamı için 300 ünite konsantrasyonda kollajenaz Tip 3 ekleyin. Eşit şekilde karıştırın ve ince kağıt mendiline ilave edin. </li><li> Yatay olarak 50 mL&#39;lik santrifüj tüpünü sallanan bir platform üzerine yerleştirin ve hızı 100 rpm&#39;ye ayarlayın ve sıcaklık 37 ° C&#39;ye ayarlayın. kışkırtmakMeme dokusunu 2 saat boyunca. Doğru sindirimi sağlamak için boruyu her 20 dakikada bir kontrol edin ve elle çalkalayın. Not: FACS öncesi doku sindiriminin amacı katı dokudan tek hücreli bir solüsyon hazırlamaktır. Bu nedenle, sindirimin sonunda içerik, görünür doku parçaları olmadan kalın bir solüsyonda olmalıdır. </li></ol></li><li> Tek hücreli çözelti hazırlama. <ol><li> Sindirimden sonra, önceden ısıtılmış, steril PBS ile 50 mL santrifüj tüpünü ekleyin ve eşit şekilde karıştırmak için tüpü tersine çevirin. Hücre pelleti elde etmek için tüp 200 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini gevşetmek için tüpün tabanını oynatın. Kırmızı kan hücrelerini yok etmek için, 3 mL kırmızı kan hücresi parçalama tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında (RT) doku kültürü kapağında inkübe edin. </li><li> 10 mL steril PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırmak için tübü tersine çevirin. 5 dakika 200 xg&#39;de doku içeriğini santrifüjleyin ve diskArdından süpernatant. 3 mL önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin ekleyin ve kalan dokuyu daha da sindirmek için tüp 37 ° C&#39;de 5 dakika saklayın. </li><li> 3 mL önceden ısınmış IMDM&#39;yi ekleyin ve daha sonra 100 μL DNaz I çözeltisi (1 mL PBS içinde seyreltilmiş 0.25 mg DNaz) ilave edin. DNA filamentlerini parçalamak için tüpü 37 ° C&#39;de saklayın. Hücre solüsyonu elde etmek için doku karışımını 70 μm hücre süzgeçten geçirin. Enzimatik sindirimi nötralize etmek için süzgeç 2 mL PBS +% 5 FBS ile iki kez durulayın. </li><li> Hücreleri peletlemek için hücre karışımı 200 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve antikor boyama için hücre pelletini 1 mL PBS +% 5 FBS içinde tekrar süspanse edin. </li></ol></li><li> FACS tabanlı Procr + VESC izolasyonu. <ol><li> Verilen rutin protokolleri izleyen donör meme dokusundan elde edilen hücre karışımını antikor boyamasına tabi tutun 8 . Not: Aşağıdaki antikorlar kullanılmıştır: anti-fareKan serisi-FITC, anti-fare CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-fare CD105-APC (hepsi 1 ug / mL konsantrasyonda kullanılır), anti-fare CD201 (Procr) -biotin Μg / mL) ve streptavidin-v450 (0.5 μg / mL konsantrasyonda kullanılır). <ol><li> Antikor boyamadan sonra, hücreleri PBS +% 5 FBS ile tamamlayın ve daha sonra 5 dakika 200 g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 1 mL PBS +% 5 FBS ile hücreleri tekrar süspanse edin. 40 μm hücre süzgeçten geçirin. FACS sıralama kadar buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> Procr + VESC&#39;leri izole etmek için FACS tabanlı sıralama gerçekleştirmeye devam edin. <ol><li> Her bir rengin voltajını belirlemek için renklendirilmemiş numuneyi ve her tek renkli kontrolü analiz edin. Otomatik floresans veya arka plan boyamayı önlemek için kompanzasyon parametrelerini hesaplayın. İstenilen hücre popülasyonları için uygun gating ve sıralama için şablon oluşturun. </li><li> FACS sıralama hiyerarşisini oluşturmak için, öncelikleTüm etkinlikler ve ardından çiftler veya yapışkan hücre kümelerini genişlikle tetikleyerek atın. Kan serpintisi hücrelerini kapatın ve daha sonra endotelial popülasyonları tanımlamak için CD31 + ve CD105 + kullanın. Not: Procr + hücreleri bir FMO kontrolüne kıyasla CD31 + CD105 + EC&#39;lerden izole edilmiştir. Temsili bir FACS analiz şeması Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bir FACS ile izole edilmiş VESC popülasyonu IMDM +% 50 FBS&#39;de askıya alınmalı ve sonraki işleme kadar buz üzerinde saklanmalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In Vivo VESC Damar Oluşturma Deneyi Meme Fat Padini Kullanarak <ol><li> Transplantasyon için primer EC&#39;leri hazırlayın. <ol><li> FACS ile sıralanmış hücreleri 10 mL PBS +% 5 FBS ile toplayın ve ardından hücreleri altına yerleştirmek için 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Sıvıyı dikkatli bir şekilde aspire edin, hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve hücre zerresini bazal membran matris karışımı ile tekrar süspansiyon haline getirin (consi% 50 taban membranı matrisi ve 100 ng / mL rmVEGF ve 60 U / mL heparin ile takviye edilmiş% 20 FBS içeren PBS) 15,000 hücre / 15 | iL&#39;lik bir çalışma yoğunluğuna ulaşmak için kullanıldı. Not: Bazal membran matriks karışımı daima buzda saklanmalıdır. </li><li> Nihai enjeksiyon hacimlerinin toplam olarak 15 μL&#39;yi aşmamasına dikkat ederek, 1.5 mL&#39;lik bir mikro tüp içinde gerekli girdi konsantrasyonlarına ulaşmak için sıralanmış ve sayılmış hücreleri ciddi olarak seyreltin. Transplantasyon sırasında daha iyi içerik görselleştirmesi için her bir tüpe% 0.1 Tripan mavisi ekleyin. Karıştırmak için iyice pipetleyin. Kullanana kadar tüpleri buz üzerinde saklayın. Not: Başarılı bir damar üretimi, en az 100 VESC ile sağlanabilir. </li></ol></li><li> Primer EC&#39;leri meme yağ yastığına naklet. <ol><li> Cerrahi aletleri ve tezgahı dezenfekte edin. Aynı araçları birden çok hayvanda kullanıyorsa, dezenfeksiyon için bir boncuk sterilizatör kullanılabilir. </li><li> 3 haftalık BALB / c çıplak mikrofonunu anestezi altına alE, kurumunuzun veteriner hekimi ve IACUC tarafından önerilen anestetik protokolü kullanarak. Her fare sırtüstü pozisyonda, sırtını da ameliyat masasına koyun. Bacaklarını yapışkan bantla sabitleyin. </li><li> Pamuklu çubuğu iyot bazlı antiseptik solüsyona batırın. Ameliyattan önce cildin yüzeyini sterilize etmek için farenin tüm karın bölgesini iyice silin. </li><li> Forseps ile farenin karın cildi tutun ve kaldırın. Küçük, 1 cm&#39;lik dikey kesi yapmak için cerrahi bir neşrubat kullanın. Baş aşağı, Y şeklinde insizyon elde etmek için her biri arka bacağa doğru 0,5 - 1 cm uzunluğunda iki kesik yapın. <ol><li> Cildinizi karından hafifçe ayırmak için forseps ve pamuklu çubuk kullanın ve kasık meme bezlerini ortaya çıkarmak için cildi yana doğru döndürün. Fareyi bir stereoskopun altına yerleştirin ve büyütmeyi 2.0X olarak ayarlayın. Odaklamayı, meme yağ pedinin açıkça görülüp çalıştırılabileceği şekilde ayarladığınızdan emin olun. </li></ol></li><li> 27G 1/2 &quot;iğne yerleştirinBuz ön ısıtmak için. İğne ile birleşen bölgede sıkışan olası hava kabarcıklarını gidermek için temel membran matriks karışımlı bir 1 mL&#39;lik şırıngayı önceden boşaltın. Mikrosantrifüj tüpünün kapağına 15 μL karışık çözeltiyi pipetleyin ve ardından tüm hacmi astarlanmış şırıngaya aspire edin. </li><li> İnce cımbız kullanarak inguinal lenf nodunun önündeki meme yağ pedini tutun ve kolay enjeksiyon için hafifçe kaldırın. Şırınga iğnesinin yaklaşık 1/4&#39;ünü yağ yastığına yavaşça yerleştirin. <ol><li> Şırınga iğnesini kavramak ve dengelemek için cımbızı tıraş pedinden bırakın. Sıvı sızıntısını önlemek için çözeltiyi yavaşça enjekte edin. İğneyi çekerken sızıntıyı en aza indirgemek için hücre karışımının katılaştığından emin olmak için birkaç saniye bekleyin. </li></ol></li><li> Emici dikişlerle cilt kapağını kapatın. Boyut 5-0 non-reaktif monofilament dikiş kullanarak cilt flepini dikin ve cerrahın tarzı düğümlerle yaraları kapatın, her düğüm yaklaşık olarak0.3 cm uzaklıktadır. Alternatif olarak, yara zımbaları ile cildi kapatın. </li><li> Çalıştırılmış fareleri kurtarmak için ayrı bir kafese yerleştirin. Anestezi uygulanmış farelerin hipotermiye maruz kalmasını önlemek için kafesin üzerine bir ısıtma lambası yerleştirin. Fareyi ameliyat sonrası sıcak tutmak için kafesin altına yumuşak kağıt ve pamuk koyun. <ol><li> Tüm alıcılar tamamen uyanık oluncaya kadar farelere dikkatle bakın. Önümüzdeki birkaç gün boyunca, post-cerrahi analjezikleri tüm hayvanlara ya da tesis veteriner hekiminin talimatına göre önceden uygulayın. Yara enfeksiyonu ortaya çıkarsa, onaylanmış hayvan protokolüne göre antibiyotik uygulayın. Cerrahi yara zımba teli ile kapatılmışsa, yara tamamen kapatıldığında ameliyattan 10 gün sonra yara klipslerini çıkarın. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Mikroskobik Gözlem için Bütünüyle Dayanıklı Doku Hazırlama <ol><li> Doku hasatı <ol><li> İmplantasyondan 2-4 hafta sonra alıcı BALB / c&#39;yi anestezi altına alınızAdım 2.2.2&#39;de olduğu gibi 20 g vücut ağırlığı başına 0.12 mL&#39;lik bir dozda% 2.5 anestezi edici maddenin intra-peritoneal bir enjeksiyonu ile çıplak fareler. Not: Pozitif damar büyümesi hücre transplantasyonundan 2-4 hafta sonra tespit edilebilir. </li><li> Alıcı sistemik dolaşımı 50 μg / 25 g vücut ağırlığı dozunda isolectin-647 boya kuyruk damar enjeksiyonu ile etiketleyin, 50 μL steril PBS&#39;ye tekrar süspansiyon haline getirin. 5 - 10 dakika dinlenme süresine izin verin. Fareleri CO 2 kullanarak kurutun. </li><li> Adım 2.2.4&#39;ten sonra hücrelerin başlangıçta enjekte edildiği meme dokusu bölgesini inceleyin; Cerrahi makas kullanın. Bir cerrahi bıçak kullanılarak, 6-cm Petri kabaca 3- 4-mm-3 küpler halinde doku doğranır. </li></ol></li><li> Antikor boyama için doku sindirimi ve hazırlanması. <ol><li> Doku parçalarını, kollajenaz III ile takviye edilmiş 10 mL önceden ısıtılmış sindirim ortamı (adım 1.1.2) ile doldurulmuş 15 mL&#39;lik bir santrifüj tüpünde özümleyin.(10 mL başına 300 U). </li><li> 15 mL&#39;lik santrifüj tübünü, hız 100 rpm&#39;e ayarlanmış ve doku yapısını gevşetmek ve aşırı adiposit dokusunu çıkarmak için yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C&#39;ye ayarlanmış sallanan bir platform üzerine yatay olarak yerleştirin. Not: Adipositler, gürültülü bir flüoresan arka plana neden olabilecek oto-flüoresan üretme eğilimindedir. Sindirimin sonunda, doku parçaları yumuşak, bulutlu bir görünüme sahip olmalıdır. En iyi sindirim periyodu doğranmış doku parçalarının büyüklüğüne bağlıdır ve bu nedenle en iyi sonucu elde etmek için buna göre ayarlanmalıdır. Doku damarı zaten flüoresan etiketli izoelektin ile etiketlendiğinden, aşağıdaki prosedürlerin tamamı ışığa karşı korunmalıdır. </li><li> Doku parçalarını RT&#39;de 10 dakika PBS ile yıkayın. Floresansı korumak için parçaları% 6&#39;luk PFA (pH 7.2 - 7.4) ile yarı dolu 6 cm&#39;lik bir Petri kabına dikkatlice yerleştirerek bütün montaj dokusunu düzeltin. Petri kabını yerleştirinSallanan bir platform üzerine yerleştirin ve 30 dakika oda sıcaklığında dokuyu nazikçe çalkalayın. Not: PFA kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır. </li><li> Kalan PFA&#39;yı çıkarın ve sabit dokuyu üç kez yıkama tamponuyla (PBS&#39;de% 0.1 ara ile) yıkayın ve her yıkama işleminin 10 dakikalık bir aralıkla yıkayın. </li></ol></li><li> Bütün montaj dokusu antikor boyama. <ol><li> Antikor boyama tamponundaki birincil antikoru 2 mL&#39;lik bir santrifüj tüpünde seyreltin. Bir gece boyunca 4 ° C&#39;de birincil antikor ile doku inkübe edin. Not: Sıçan anti-CD31 (konsantrasyon: 10 ug / mL) veya sıçan anti-VE-Cadherin (CD144 / Cdh5; konsantrasyon: 2.5 ug / mL) primer antikor olarak kullanıldı. Hem CD31 hem de VE-Cadherin, endoteli tanımak için kullanılan hücre yüzeyi markörleridir. 5x antikor boyama tamponu 500 mM maleik asit, pH 7.5 ile hazırlanır; 750 mM NaCl; Ve% 0.5 (v / v) ara madde PBS içinde çözülür. Taze 1x çalışma solüsyonu hazırlanırken sadece uygun bir serum hacmine (% 5) ekleyin9 . </li><li> Antikor boyama tampon kaldırmak ve 10 dakika arayla, yıkama tamponu ile üç kez tüm monte doku yıkayın. Dokuyu ikincil antikorla ( Malzeme Tablosuna bakın) artı DAPI&#39;yi sallanan bir platformda 4 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Çekirdekleri görselleştirmek için 5 μg / mL&#39;lik nihai konsantrasyonda DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) kullanın. </li><li> Tüm montaj dokusunu yıkama tamponu ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Daha iyi korunması için dokuyu kurutmak için gece boyunca% 80 gliserol veya% 80 sakaroz içindeki doku parçalarını kuluçkalayın. </li><li> Tekli doku parçalarını bir cam slayt üzerine yerleştirin ve aşırı dehidrasyon tamponunu çıkarın. Kurulum malzemesi ile dokuyu örtün, bir lamel yerleştirin ve ayarlamak için dokuyu hafifçe sıkıştırın. </li><li> Konfokal mikroskopik görüntü elde etmeyi gerçekleştirir. Tamamen monte edilmiş meme bezleri için, NA = 1.3 yağ nesnesiyle 40X kullanarak görüntü elde edinettik. 1,024 x 1,024&#39;lük bir optik kesit çözünürlüğü ve 1,0 ila 1,2 μm&#39;lik bir katman ayrımı ile Z yığınlarının kiremit taramalarını edinin. Not: Doğru floresan ışık sinyalini elde etmek için, filtre kiriş dağıtıcı, üç renkli dikdörtgen (TD) 488/553/638 olarak ayarlanmalıdır ve kazanç ayarı PMT Kazanç 600-800&#39;dir. Aşağıdaki uyartım / emisyon kaynakları kullanılmalıdır: mGFP, uyarma / emisyon maksimumu 488/509 nm; 532/588 nm uyarma / emisyon maksimumu ile mTomat; Uyarım / emisyon azami değeri 594/665 olan Alexa-647; Ve 350/470 uyarma / emisyon maksimumu ile DAPI. </li></ol></li></ol> 4. Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modeli Kullanarak Lineage Tracing <ol><li> Procr + VESC&#39;leri fare modeli kullanarak tespit edin. <ol><li> Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + ( Procr CreERT2 olarak anılacaktır) knock-in fare suşunu kullanın. Not: Bu fare modelinde bir CreERT2-IRES-tdTomato kasedi Procr 11&#39;in ilk ATG kodonundan sonra eklenir. <ol><li> In vivo endojen Procr + EClerin kaderini izlemek için Rosa26 mTtomatomGFP ( R26 mTmG olarak anılacaktır) raportör suşu ile çapraz Procr CreERT2 fareleri 11 . Etiketli tüm endojen Procr + EC&#39;leri ve bunların soyunu GFP ifadesi kullanarak tanımlayın. </li></ol></li><li> Pubertal evre (5 hafta) sırasında 4 mg / 25 g vücut ağırlığı dozunda intraperitoneal olarak intraperitoneal olarak tamoksifen solüsyonu 11 (1 mL fıstık yağı içinde çözülmüş 10 mg tamoksifen + 10 mg / mL stok solüsyonu oluşturmak için% 10 etanol) uygulayın Eski) Procr + ECs gelişim kaderini takip etmek. </li><li> Etiketli hücrelerin klon oluşturan verimliliğini 3. adımda belirtilen hazırlama adımlarını izleyerek tüm montajlı immün boyama ile analiz edin. Hem meme yağ pedlerini hem kısa süreli (2 gün) ve uzatılmış zaman periyotları (10 aya kadar). Bkz. Şekil 3 . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+infusion+of+bone+marrow+in+patients+receiving+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy.</a> N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).</li>
<li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li>
<li>Bompais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+derived+from+circulating+progenitors+display+specific+functional+properties+compared+with+mature+vessel+wall+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells.</a> Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).</li>
<li>Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+blood+vessels+from+a+single+c-kit%2B+adult+vascular+endothelial+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell.</a> PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).</li>
<li>Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+resident+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+population+in+preexisting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels.</a> EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracking adult stem cells.</a> Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).</li>
<li>Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+blood+vascular+endothelial+stem+cells+by+the+expression+of+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor.</a> Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+mammary+stemcells+by+protein+C+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression.</a> Nature. 517, 81-U201 (2015).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Retina+as+an+Angiogenesis+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The Mouse Retina as an Angiogenesis Model.</a> Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Fibrin+Gel+on+Mouse+Lung+to+Study+Lung-specific+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Anjiyogenez tahlilleri, vasküler dinamiklerin çalışılması için iyi bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Postnatal olarak gelişen fare retinal vaskülatürü, anjiyogenezi incelemek için çekici bir model olduğu kanıtlanmıştır 12 . Nispeten erişilebilir olmasına rağmen, retina vasküler yatağı içinde fiili manipülasyon oldukça zordur. Şimdiye kadar, en iyi tarif edilen in vivo transplantasyon, bir bazal membran matriks kütlesi içindeki hücreleri kapsayan ve bir alıcı fare kenar bölgesinde subku...

Gelişme ve homeostaz sırasında, vasküler büyüme ve yeniden şekillendirme, organ gelişimine ve onarımı uyarınca sadık kalarak gerçekleşir. Anjiyogenez, mevcut kan damarlarından yeni damarların oluşumunu açıklar ve bu dinamik vasküler değişikliklere aracılık eden önemli bir kuvvet olarak kabul edilir. Her kan damarı, bir dizi endotel hücresi (EC) ile astarlanmış olup, bunlar gemi yapısının temelini oluşturmuş gibi görünmektedir. Uzun süre, homeostaz sırasında EC havuzunun doldurulması mekanizması belirsiz kaldı ve vasküler ciro, olgunlaşan AT çoğalmasının bir sonucu olup olmadığı veya vasküler kök / progenitör hücre aktivitelerinin katkısı olup olmadığı üzerine tartışmalar yapıldı. Doğrudan fizyolojik kanıt bulunmaması nedeniyle, vasküler endotelyal kök hücrelerin (VESC&#39;ler) varlığı ve hücresel kimliğini de tartışmalı olarak kaldı. Kök hücre davranışını doğrulamak için kullanılan en yaygın yaklaşımlardan biri transplanstan geçmektedirFarazi kök hücrelerin alıcı farelere tayin edilmesi. Bu yöntem, aday kök hücrelerin köklenme potansiyelini in vivo olarak ölçer . Transplantasyon ilk hematopoietik sistem 2 hiyerarşik özellikleri kurulmasına katkıda kemik iliği kök hücrelerinin 1, çalışma uygulanmıştır. Endotel sahasında, yan deri altına subkutan yoldan sokulan bir bazal membran matrisi ( ör., Matrigel) tıpası, nakledilen EC&#39;lerin damar oluşum yeteneklerini ele alan standart bir in vivo anjiyogenez tahlilidir. 3D kültür sistemlerinde koloni oluşumu ve transplantasyon da dahil olmak üzere çok sayıda deneysel yöntem, EC progenitörü / VESC popülasyonunda 3 , 4 , 5 , 6&#39;yı önermişlerdir. Bununla birlikte, bazal membran matrisine gömülü EC&#39;ler,Çevredeki doku, bu, nakledilen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini tam olarak keşfetmek için gerekli en uygun niş ortamı sağlamaz. Sonuç olarak, matris tıpası içerisinde oluşan kaplar ağırlıklı olarak kılcal benzeri olup fonksiyonel olarak ölçülemezdirler. Memeli bezi postnatal dönemde gelişir, en sağlam büyüme ergenlik ve gebelik sırasında gerçekleşir. Ergenlik evresinde, meme epiteli tüm meme yastığını işgal etmek için hızlı genişlemeye, çevredeki vasküler yapıların etkili şekilde yeniden şekillenmesine eşlik eder. Böylece, meme bezi anjiyogenez çalışması için mükemmel bir model sunar. Uzanan meme epitelinden boşluk, matris ve zengin anjiyojenik uyaranlar sağlar ve bu nedenle ekzojen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için ideal bir aşılama alanıdır. Buna ek olarak, meme yağ yastığı, oluşturulan eksojen damarların ev sahibi dolaşım sistemi ile entegrasyonunu sağlar ve daha fazla fTek dereceli değerlendirme ve subkutan transplantasyona kıyasla bir avantaj sağlamaktadır. In vitro kültürleme ve transplantasyon tahlilleri, bir hücre popülasyonunun rejenerasyon özelliklerini araştırmak için etkili bir yol olmasına rağmen , hücrelerin doğal yaşam alanlarından uzaklaştırıldıklarında bu tahlillerin plastisiteyi uyardığı bilinir ve hücreler koparsa değişiklikler meydana gelebilir Fizyolojik çevreleri 7 . Dolayısıyla, doğrudan in vivo hücre akıbetiyle ilgili kanıt elde etmek, endotel popülasyonlarının mevcut davranış anlayışının geliştirilmesine yönelik temel yaklaşımdır. VESC&#39;lerin tanımlanması ve vücut sistemindeki özelliklerinin incelenmesi için, fizyolojik bağlamında in vivo kök hücre davranışını ortaya koyabileceği ve gerçek köklenme olabileceği için genetik kader haritalaması zorunludur ( örn., In vivo soy travması) değerlendirdi. Lineage traciNG, aday VESC&#39;lerin uzun süreli kalıcılığının ( örn. Kendiliğinden yenilenmesi) ve orijin dokusu için hücre tipleri üretme kabiliyetinin ( yani, farklılaşma potensi) doğrudan kanıtını sağlar. Bu protokol, yeni bir meme yağ padi transplantasyon tekniğini ve VESC&#39;lerin damar üretim yeteneğini gözlemlemek için bir soy travma metodunu açıklamaktadır. Bu teknikler mevcut testlerin eksikliklerinin üstesinden gelir ve VESC&#39;lerin kök hücre özelliklerini en iyi şekilde değerlendirmenin yeni bir yolunu sağlar. Bu yaklaşımlar, patolojik bir ortamda vasküler hücre potens alterasyonunu belirlemenin yanı sıra, endotel popülasyonlarının damar oluşum özelliklerini ve davranışı değerlendirmek için kullanılabilecek etkili araçlardır.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 Tripsin-Etilen Diamin Tetraasetik Asit (EDTA) (1x)</td> <td>Gibco (Yaşam Teknolojileri)</td> <td>25300-062</td><td>%0.05 Tripsin</td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m</td><td>Filtre Ünitesi Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Filtre 2-Metilbutanol-2, ReagentPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>Tert Amil Alkol</td></tr><tr><td>222, Tribrometanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, Tribrometanol</td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 ve mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 & mikro; m Hücre Süzgeci</td></tr><tr><td>Yapışma Mikroskobu Slaytları</td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>Cam slaytlar</td></tr><tr><td>Anti-fare CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82,</td><td>1 ve mikroda FACS analuzisi kullanımı için klon MJ7/18; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-fare CD201 Biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td>, <td>2.5 & mikro'da FACS analuzisi kullanımı için; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-fare CD31 PE-Siyanin 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82,</td><td>1 ve mikro'da FACS analuzi kullanımı için klon 390; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz Hücre Sıralayıcısı</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>Kollajenaz III</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskopi</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>Konfokal</td></tr><tr><td>Sığır pankreasından deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>İkincil antikor, 0.5 & mikro'da kullanım; g/mL</td></tr><tr><td>Dumont Forseps</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Dumont Forseps - Mikro Körelmiş Uçlar</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>Forseps</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3 / Gr1 / CD11b / CD45R (B220) / Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>FACS analizi için kan soy kokteyli, 25 & mikro'da kullanım; L test başına</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Gliserol</td></tr><tr><td>Iscov'un Modifiye Dulbecco'nun Orta Gibco'su</td><td>(Yaşam Teknolojileri)</td> <td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia'dan IMDM İzolektin GS-IB4, Alexa Fluora&nbsp; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>İzolelektin-647</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; Matris (büyüme faktörü azaltılmış)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Fare suşu (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>Fare suşu (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Fare suşu&nbsp; (BALB/c çıplak)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c çıplak</td><td>Çıplak fareler</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco (Yaşam Teknolojileri)</td><td>5140-122</td><td>Kalem/Strep</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (pH7.2) 1x</td><td>Gibco (Yaşam Teknolojileri)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Yaşam Teknolojileri)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reaktifi</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Montaj Ortamı</td></tr><tr><td>Sıçan anti CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>tam montaj analizi için, endotelyal sıkı bağlantı için anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy, 2.5 & mikro'da kullanım; g / mL</td></tr><tr><td>Sıçan anti CD31-biotin</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>tam montajlı analuzi için, endotelyal yüzey yapışma molekülü için anti-CD31 / PECAM1 antikoru, 10 & mikro'da kullanın; g / mL</td></tr><tr><td>Kırmızı Hücre Lizis Tamponu</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>Kırmızı kan hücresi parçalama tamponu</td></tr><tr><td>Düz / Keskin-Künt / 10cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>İnce Makas</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-4317-82</td><td>FACS analizi için 0.5 ve mikroda kullanın; g/mL</td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>Balmumu Kaplı Örgülü İpek (Boyut 5-0 USP (1 Metrik), 18 inç (45 cm) SİYAH C-1 İğnesi üzerinde)</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>Sütür&nbsp;</td></tr><tr><td>Steril Tek Kullanımlık Scaplels</td><td>Swann Morton</td> <td># 10</td><td>Neşter</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng Tıbbi</td><td>20160101</td><td>Antiseptik çözelti</td></tr></tbody></table>

vasküler endotelyal kök hücrelerin damar oluşumunu görselleştirmek İçin yeni bir göğüs göğsü transplantasyon tekniği

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endotel hücreleri (AK) vasküler mimarisinin temel yapı taşlarıdır ve uygun damar gelişimini ve homeostazı sağlamak için vasküler büyümeye ve yeniden şekillenmeye aracılık eder. Bununla birlikte, endotelyal soy hiyerarşisi üzerine yapılan çalışmalar, erişim kazanma araçlarının eksikliği ve davranışlarını doğrudan in vivo olarak değerlendirmeleri nedeniyle hala kaçınılmazdır. Bu eksikliği gidermek için meme yağ pedini kullanarak anjiyogenezi incelemek için yeni bir doku modeli geliştirildi. Memeli bezi, ergenlik ve gebelik de dahil olmak üzere doğum sonrası evrelerde gelişirken, bu süreçte sağlam epitel çoğalması geniş damar tadilatıyla birlikte gerçekleşir. Meme yağ yastıkları, büyüyen meme epitelinden alan, matris ve zengin anjiyojenik uyaranlar sağlar. Dahası, meme yağ padleri peritoneal boşluğun dışında bulunur ve bu sayede ekzojen hücrelerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için kolayca erişilebilir bir aşılama alanı haline getirilir. Bu çalışma ayrıca,Vivo endotel kök hücre hedefli popülasyonunu (VESC&#39;ler) in vivo olarak özel olarak etiketlemek için floresan muhabir farelerini kullanan nt izlem yaklaşımı. Bu soy takibi yöntemi, daha sonra doku bütün montaj mikroskopisi ile birleştiğinde, çoğalma kapasitesinin ölçülebileceği ve farklılaşma taahhüdünün kader eşleştirilebileceği hedeflenen hücrelerin ve torunlarının doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemleri kullanarak, VESC&#39;leri ifade eden iki kutuplu protein C reseptör (Procr) popülasyonu son zamanlarda birçok vasküler sistemde tanımlanmıştır. Procr + VESC&#39;ler hem yeni EC&#39;lere hem de perisitlere neden olarak, gelişme, homeostaz ve hasar onarımı sırasında anjiogenezise aktif olarak katkıda bulunurlar. Genel olarak, bu el yazması VESC&#39;lerin kök hücre özelliklerini değerlendirmek için kullanılabilecek yeni bir göğüs yağ padi transplantasyonunu ve canlı organizma izleme tekniğini tanımlamaktadır.

Meme VESC&#39;lerin İzolasyonu: Sonuçtaki transplantasyon testi için endotel popülasyonunu izole etmek için olgun (8 haftalık) bakire fare meme bezleri donör madde olarak hasat edildi. Endotel hücreleri bir antikor bazlı hücre ayırma tekniği kullanılarak izole edildi. 8 haftalık C57BL / 6 meme bezi EC&#39;lerindeki VESC popülasyonunun FACS analizinin temsili parselleri Şekil 1&#39;de gösterilmektedir...

Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC&#39;lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC&#39;lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Bu deneyin genel amacı, meme yağ pedi transplantasyon tekniği ve ardından mikroskobik gözlem için tüm mount doku hazırlığı yoluyla vasküler endotelyal kök hücrelerin proliferasyon, diferansiyasyon ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmektir. Bu yöntem, vasküler endotelyal kök hücrelerin in vivo ortamdaki kökselliği özelliklerini optimize bir şekilde değerlendirmek için yeni bir yol sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, ergenlik döneminde meme bezinin, yeni oluşan damarların üretimi ve entegrasyonu için ideal bir anjiyojenik ortam sağlamasıdır.Bu, nakledilen endotel hücrelerin fonksiyonel değerlendirmesine olanak tanır. Bu tekniğin etkileri yalnızca endotelyal fonksiyonun test edilmesiyle sınırlı değildir; lokal damar yeniden şekillenmesi üzerinde anjiyojenik faktörlerin etkisini değerlendirmeye kadar genişleyebilir.Bu yaklaşımlar, tümör ortamındaki endotelyum popülasyonu ve hücre potansiyelindeki değişimlerle ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere birçok disipline uygulanabilen etkili araçlardır. Prosedürü, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Wenqian Song uygulamalı olarak gösterecektir. Metin protokolüne uygun olarak doku sindirim tabanlı besiyerini hazırladıktan ve sekiz haftalık Actin-GFP matür bakire reporter fareleri sakrifiye ettikten sonra, önce alt abdominal orta hat boyunca dikey bir cilt insizyonu yaparak skalpel yardımıyla dördüncü inguinal meme bezi çiftini diseke edin.Doğranmış dokuyu tartın ve 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Sindirim tamponunu hazırlamak için, 10 mililitre sindirim temelli ortama 300 ünite tip üç kollajenaz ekleyin. Homojen bir şekilde karıştırın ve doğranmış dokuya ekleyin.50 mililitre santrifüj tüpünü yatay olarak sallama platformuna yerleştirin, hızı 100 rpm ve sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın. Meme dokusunu iki saat boyunca ajite edin. Sindirim işleminden sonra, 50 mililitre santrifüj tüpünü önceden ısıtılmış steril PBS ile tamamlayın ve tüpü homojen bir şekilde karıştırmak için ters çevirin.Ardından tüpü 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve hücre peletini gevşetmek için tüpün altına hafifçe vurun. Daha sonra, eritrositleri yok etmek için üç mL eritrosit lizleme tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.10 mililitre steril PBS ekleyin ve tüpü homojen bir şekilde karıştırmak için tersyüz edin. Ardından dokuyu santrifüjleyip süpernatantı attıktan sonra, kalan dokuyu daha fazla sindirmek için tüpe önceden ısıtılmış 0,05% tripsin ekleyerek tüpü 37 derece Celsius'ta beş dakika inkübe edin. Sonrasında, üç mililitre önceden ısıtılmış IMDM ve ardından 100 mikrolitre DNase I çözeltisi ekleyin.DNA filamentlerini parçalamak için tüpü 37 °C'de inkübe edin. Ardından, hücre solüsyonunu elde etmek için doku karışımını 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Enzimatik sindirimi nötralize etmek için süzgeci iki kez durulamak amacıyla 2 mL %5 FBS içeren PBS kullanın.Hücre karışımını 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve hücre peletini, antikor boyama işlemi için 1 mL PBS artı %5 FBS içinde yeniden süspande edin. Antikor boyama işleminden sonra, hücreleri PBS artı %5 FBS ile tamamlayın ve ardından örneği 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından süpernatan atıldıktan sonra, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için 1 mL PBS artı %5 FBS kullanın. Süspansiyonu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden filtreleyin. Daha sonra, metin protokolüne uygun olarak protein C reseptörü pozitif vasküler endotelyal kök hücreleri izole etmek için FACS tabanlı ayırma işlemini gerçekleştirin.FASC ile ayrıştırılmış hücrelerin hacmini 10 mililitre PBS artı %5 FBS ile tamamlayın ve ardından hücrelerin tüpün dibine çökmesi için numuneleri 200 xg'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Sıvıyı dikkatlice aspire ettikten sonra, hücre sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın ve hücre peletini, 15 mikrolitreye 15.000 hücre düşecek şekilde bazal membran matrisi karışımı ile yeniden süspanse edin. Final enjeksiyon hacimlerinin 15 mikrolitreyi geçmediğinden emin olarak, ayrıştırılmış ve sayılmış hücreleri 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde gerekli giriş konsantrasyonlarına ulaşacak şekilde seri olarak seyreltin.Ardından, transplantasyon sırasında içeriğin daha iyi görüntülenmesi için her tüpe %0.1 trypan blue ekleyin. Karıştırmak için iyice pipetleyin ve tüpleri kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Primer endotel hücrelerini veya EC'leri meme yağ pedine transplant etmek için, her fareyi sırtı ameliyat masasına gelecek şekilde sırtüstü pozisyona getirin.Ardından, uzuvleri sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Bir pamuklu çubuğu iyot bazlı antiseptik çözeltiye batırın. Cerrahi işlemden önce cilt yüzeyini sterilize etmek için farenin tüm karın bölgesini iyice silin.Ardından, farenin karın derisini tutup kaldırmak için pens kullanın. Daha sonra cerrahi bir bistüri ile bir santimetrelik küçük dikey bir kesi yapın. Ters Y şeklinde bir kesi elde etmek için arka bacağa doğru uzunlukları yaklaşık 0,5 ile bir santimetre arasında olan iki kesi daha yapın.Cildi abdomenden nazikçe ayırmak için pens ve pamuklu çubuk kullanın ve inguinal meme bezlerini açığa çıkarmak için cildi yanlara doğru iğneleyin. Ardından fareyi bir stereoskop altına yerleştirin ve büyütmeyi 2X'e ayarlayın. Ön soğutma için 27 gauge 1/2 inch bir iğneyi buz üzerine yerleştirin.Şırınga hazırlandıktan sonra, 15 µL bazal membran matriks solüsyonunu mikrocentrifüj tüpünün kapağına pipetleyin ve ardından tüm hacmi hazırlanmış olan şırıngaya aspire edin. Hücre içeriğinin tamamen enjekte edildiğinden emin olmak için, hazırlama ve hücre alma işlemlerinden sonra iğne içinde hava kalmadığından emin olun. İnce bir cımbız kullanarak, inguinal lenf düğümünün önündeki meme yağ yastığını tutun ve kolay enjeksiyon için hafifçe kaldırın.Ardından, şırınga iğnesinin yaklaşık 1/4'ünü nazikçe yağ yastığına yerleştirin. Şırınga iğnesini kavramak ve sabitlemek için cımbızı yağ yastığından bırakın. Sıvı sızıntısını önlemek için solüsyonu yavaşça enjekte edin.Ardından, iğne çıkarılırken sızıntıyı en aza indirmek için hücre karışımının katılaştığından emin olmak amacıyla iğneyi birkaç saniye boyunca yerinde tutun. Cilt flebini kapatmak ve dikmek için 5-0 gut emilebilir sütürler kullanın ve yaraları, her bir düğüm yaklaşık 0,3 santimetre ara olacak şekilde cerrah tarzı düğümlerle kapatın. Dokuyu hasat etmek için, PBS içindeki Isolectin 647 boyasını kuyruk veni enjeksiyonu ile uygulayarak alıcı sistemik dolaşımı işaretleyin.Beş ila 10 dakika dinlenme süresi tanıyın. Fareler metin protokolüne uygun olarak sakrifiye edildikten sonra, hücrelerin başlangıçta enjekte edildiği meme dokusu bölgesini çıkarmak için cerrahi makas kullanın. Altı santimetrelik bir Petri kabı içinde, dokuyu yaklaşık üç ila dört kübik milimetrelik küpler halinde parçalamak için cerrahi bir bistüri kullanın.Ardından, doku parçalarını sindirmek için bunları, kollajenaz üç ile desteklenmiş ve önceden ısıtılmış 10 mililitre sindirim ortamı ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Doku yapısını gevşetmek ve fazla adiposit dokusunu uzaklaştırmak için 15 mililitrelik santrifüj tüpünü, bir sallama platformu üzerinde, yatay konumda, 100 rpm ve 37 degrees Celsius'de yaklaşık bir saat boyunca bekletin. Sonrasında, dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS kullanarak yıkayın.Ardından, floresansı korumak için parçaları %4 PFA ile yarıya kadar doldurulmuş altı santimetrelik bir Petri kabına dikkatlice yerleştirerek bütün mount dokuyu sabitleyin. Petri kabını sallama platformuna yerleştirin ve dokuyu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazikçe çalkalayın. Dokuyu yıkadıktan ve metin protokolüne uygun olarak seyreltilmiş primer antikor içinde inkübe ettikten sonra, boyayı uzaklaştırın ve yıkama tamponu kullanarak dokuyu üç kez, her biri 10 dakika olacak şekilde yıkayın.Ardından dokuyu, sallama platformu üzerinde oda sıcaklığında dört saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca sekonder antikor ve DAPI ile inkübe edin. Numuneyi metin protokolüne göre yıkadıktan sonra, daha iyi koruma sağlamak amacıyla dokuyuledehidrat etmek için gece boyunca %80 gliserol veya %80 sakroza aktarın. Dokuyu monte edin ve metin protokolüne göre konfokal mikroskopi işlemini gerçekleştirin.FACS kullanılarak yapılan hücre izolasyonunun temsili bir sonucu burada gösterilmektedir. Kan soyları dışlandırılarak, endotel hücrelerini tanımlamak için CD31 pozitif ve CD105 pozitif belirteçler kullanılmış, ardından protein C reseptörü pozitif endotel kök hücrelerinin zenginleştirmesi gerçekleştirilmiştir. Bu konfokal görüntü, transplantasyon bölgesindeki alıcı meme yağ pedini temsil etmektedir.Transplante edilen protein C reseptörü pozitif endotel hücrelerden oluşan kan damarları, konakçı meme vaskülaritesine entegre olmuş ve buna katkıda bulunmuştur. Alıcı meme vaskülaritesi bu şekilde sunulmuştur. Alıcı farelere yapılan intravenöz Izolektin enjeksiyonu, protein C reseptörü pozitif endotel hücrelerin lümenli fonksiyonel damarlar oluşturduğunu ortaya koymuştur.Hâkim olunduğunda, transplantasyon prosedürü doğru şekilde gerçekleştirilirse beş dakikanın altında tamamlanabilir. Prosedürü uygularken, ameliyat sonrası alıcı hayvanları yakından izlemeyi hatırlamanız önemlidir. Distres ve enfeksiyon belirtileri gözlemlendiğinde uygun bakım prosedürleri uygulanmalıdır.Prosedürün ardından, hedeflenen hücrelerin in vivo çeşitli biyolojik süreçler sırasındaki davranışlarını incelemek amacıyla hücre soy hattı izleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesiyle birlikte, vasküler biyoloji alanındaki araştırmacılar, endotelyum alt popülasyonlarının hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altındaki potansiyellerini keşfetme imkanı bulmuşlardır. Bu videoyu izledikten sonra, endotelyum popülasyonlarının damar oluşturma yeteneğini araştırmak ve ayrıca oluşan damarların işlevselliğini değerlendirmek için meme yağ pedi transplantasyonu ve bütün doku preparasyonu yöntemlerinin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.

a-novel-mammary-fat-pad-transplantation-technique-to-visualize-vessel

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makale DeOme KB tarafından geliştirilen yöntemle...

Meme Epitel Nakli Prosedürü

Kan ile temas eden otolog hücre ve test biyouyumluluk biyomalzemeler tohumlama titanyum için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, cerrahi implantasyon dakika içinde domuz venae kava numaralı seribaşı endotel progenitör hücrelerin ve titanyum tüpler, kullanır. Bu teknik, diğer birçok implante biyomedikal cihazlar için uyarlanabilir.

Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Ultrason ve endomikroskopi olmak üzere iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemi kullanarak kanser hücreleri tarafından salgılanan bir faktör havuzunun anjiyojenik potansiyelini göstermek için bir matrigel tıkaç testi tarif ediyoruz. Hücre dışı bir matriks (ECM) taklidi jeli olan matrigel, konağı (fare) şartlandırılmış ortama (CM) salgılanan anjiyojenik faktörlerle tanıştırmak için kullanılır.

Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Bu umut verici vaskülarizasyon birimlerini temsil adipoz doku türevli mikrovasküler fragmanları izole etmek için bir protokol mevcut. Bunlar hızlı bir şekilde izole edilebilir, bu nedenle, doku mühendisliği farklı alanlarında tek aşamalı prevascularization için kullanılabilmektedir, nitro işleme gerektirmez ve yoktur.

Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Burada, doku mühendisliği yapılmış bir vasküler greftin manşet tekniği kullanılarak fare karotis arterine implantasyonu için bir protokol sunulmakta ve vasküler doku rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için uygun bir hayvan modeli sağlanmaktadır.

Fare Karotis Arterine Manşet Tekniği ile Doku Mühendisliği Yapılmış Vasküler Greft İmplantasyonu

Bu makale, vasküler kök hücrelerin aort damar duvarına hassas ultrason eşliğinde verilmesi için bir protokol sunmaktadır. Teknik, damar duvarını etkili bir şekilde hedefler ve aort anevrizmalarında ve diseksiyonlarında vasküler onarımı destekler.

Aort Hastalıklarında Damar Onarımı için Hassas Ultrason Kılavuzluğunda Kök Hücre Verilmesi

Keşfedin, vasküler endotelyal kök hücrelerin damar oluşum potansiyelini meme yağ pedi transplantasyonu ve bütün-doku hazırlama teknikleriyle in vivo değerlendirmeyi. Bu yöntem kök hücre biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmalarında uygulanabilir.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Daha fazla video keşfet