Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi

3D insan iPSC serum serbest embriyoid cisimleri için bu protokolün genel amacı, ilaç keşfi için kullanılabilecek insan erken kortikal gelişimine yaklaşan bir in vitro sistem sağlamaktır. Bu yöntem, nöronların iPSC'lerden nasıl türetildiği, 3D dokuda işlevsel ağlar oluşturduğu gibi kök hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalıklı bireylerin genetiğini içeren insan dokusundan bir tabakta kortikal gelişimin yönlerini modellememize izin vermesidir, böylece sistem, ölçeklenebilir ve birçok farklı nörobiyolojik bozukluğu incelemek için kullanılabilen ilaç taraması için hücre tabanlı bir platform olarak hizmet eder.

Bu yöntem nörobiyolojik veya nöro gelişim bozuklukları hakkında bilgi sağlayabilse de, nöroimmün fonksiyon veya sinirsel bilgi modellerine odaklananlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu protokol için fetal hücrelerin oluşturulmasıyla başlayın. Bu kültürü oluşturmak için, her kuyu başına 300 mililitre ortam olacak şekilde altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 600.000 fetal hücre yerleştirin.

Fetal hücreleri 48 saat boyunca kültürledikten sonra, ortamı değiştirin. Kök hücreleri hazırlarken plakaları bir saat inkübe edin. Kök hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda çözdürün.

Çözüldükten sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü damla damla eklenen kültür ortamı ile beş mililitreye kadar doldurun. Daha sonra, hücreleri dört dakika boyunca nazikçe santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve peleti ROCK inhibitörü ile bir mililitre kök hücre ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Hücre yoğunluğunu ölçtükten sonra, 300.000 kök hücreyi besleyici hücrelerin üzerine yerleştirin.

Daha sonra, hücreleri genişletme ve yedekleme için dondurma işleminden sonra, sağlıklı hücreleri periyodik olarak seçerek kültürleri büyütün ve genişletin. Kök hücre kolonilerini standart plakalar üzerinde %50 ila %70 birleşmeye ulaşana kadar büyütün. Ardından, nöro öncü hücre farklılaşması için hiPSC'leri hasat etmek için hafif bir enzimatik işlem ve bir mililitrelik pipet ucuyla hafif

Süspansiyonu nazikçe santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve peleti beş mililitre insan iPSC ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu% 0.1 jelatin kaplı beş santimetrelik bir hücre kültürü kabına aktarın ve plakayı bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, yapışmayan hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından plakayı üç mililitre orta ile nazikçe durulayın ve aynı tüpe aktarın. Daha sonra, yeniden süspansiyon adımını nazik santrifüjleme ile tekrarlayın, ardından hücre yoğunluğunu belirleyin ve hücreleri, oyuk başına 9.000 hücrede 96 kuyulu, düşük yapışma V alt plakasına yerleştirin. Şimdi, plakayı üç dakika döndürün ve hücreleri kültürlemeye başlayın.

Önümüzdeki 14 gün boyunca, her gün yarım orta maddeyi yeni farklılaştırıcı orta olanla değiştirin. Hücrelerin kültürlenmesinden iki hafta sonra, 40 mikron hücre kültürü ekleri ve bir mililitre DM1 ortamı içeren altı kuyucuklu plaka hazırlayın. Kültürlenmiş hücreleri eklemeden önce bu plakaları en az dört saat inkübe edin.

Daha sonra, 200 mikrolitrelik geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, yaklaşık 20 mikrolitre ortam değerinde iki haftalık hücre agregalarını toplayın. Minimum çözelti ile her bir kesici uç üzerine dört ila altı agrega aktarın, fazlalıkları giderin. Bu adım sırasında, hızlı ve sabit bir elle çalışmak önemlidir, SFEB'lerin etrafından ortamı çıkarırken, yüzey gerilimi nedeniyle SFEB'lerin çözelti boyunca hareket ettiğini görebilirsiniz.

Ortam kaldırıldıktan sonra bunları yeniden konumlandırmanızda bir sakınca yoktur. Tüm agregalar kesici uçlara yüklendikten sonra, ortamı bir mililitre DM2 olarak değiştirin ve hücreleri her gün kültürlemeye devam edin. Ortamın dörtte üçünü yeni ortamla değiştirin.

14 günlük kültürden sonra, kültürlere DM3 ortamı eklemeye başlayın. SFEB'leri büyütmek için 16 gün daha kültüre devam edin. Şimdi 200 mikrolitrelik geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak SFEB'leri uçtan nazikçe ayırın.

SFEB'leri 12 kuyucuklu plakaya aktarın ve kuyucuk başına dört ila sekiz yükleyin. Ardından, bunları metin protokolünde anahat olarak boyayın. 12 kuyuyu ve sekiz tabağı hazırlamak için önce üç kez steril suyla yıkayın.

Daha sonra bir kez %75 etanol ve bir kez daha %100 etanol ile yıkayın. Ardından, sterilizasyon işlemini tamamlamak için plakaları 50 santigrat derecede baş aşağı dört ila beş saat pişirin. Pişirdikten sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre% 0.2 PEI çözeltisi ekleyin ve plakayı bir saat oda sıcaklığında bekletin.

Daha sonra, PEI'yi aspire edin ve kuyuları steril damıtılmış suyla dört kez yıkayın ve gece boyunca havayla kurutun. Ertesi gün, L15 ortamında taze laminant hazırlayın ve her kuyucuğun ortasına 10 mikrolitre ekleyin. Ardından, buharlaşmayı önlemek için çevredeki rezervuarlara damıtılmış su ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Topraklama elektrotlarının boşluğunu aşmamaya dikkat ederek elektrotların ortasındaki laminantı ışınladığınızdan emin olun, bu boşluk aşılırsa, nöronlar topraklama elektrotları üzerinde büyüyerek gürültü artefaktlarına neden olur ve kaydın doğruluğunu etkiler. Şimdi, geniş delikli bir pipetle hafif emme kullanarak her kuyucuğa hazırlanmış bir SFEB ekleyin. Ardından, her bir oyuğa 200 mikrolitre DM2 ekleyin ve plakayı gece boyunca kültürleyin.

Daha sonra, nöral aktiviteyi kaydetmek için, plaka okuyucuya bir plaka koyun. Önceden 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, her kuyudan 10 dakikalık aktivite kaydetmek için yazılımı kullanın.

SFEB, tarif edilen yöntem kullanılarak büyütülür, geniş Tuj1 pozitif nöronların yanı sıra nöro progenitörlerle dolu erken gelişen bir kortikal subventriküler bölgeye benzeyen morfolojik özelliklere sahip doku elde edilir. Vücudun dış katmanlarında ve iç katmanlarında çok sayıda gelişen kortikal rozetler gözlendi. Gövdelerin dış kenarı, postmitotik nöronlar içeren gelişmekte olan bir kortikal plakaya benzer, bu, nöro progenitörler ve en ventralize dış kortikal tabakalar için bir belirteç olan Brn2'nin ekspresyonu ile desteklenir.

Dış katmanlar ayrıca sıradan gratzel hücreleri veya bunların ataları olabilen Reelin pozitif hücreleri içerir. Gövdeler ayrıca karışık kodal ve medial ganglionik immenantların kökeni ile tutarlı belirteçleri de ifade etti. Pişmiş TF2 ve Nkx2.1 işaretleyicilerinin ifadesine dayanmaktadır.

Kültürlenmiş SFEB'ler hem CalR hem de CalB pozitif inter nöronlarda verim sağlar. yanı sıra, VGLUT pozitif uyarıcı nöronlar ve Tbr1 pozitif glutamaterjik nöral progenitörler. Diğer raporlarla tutarlı olarak, vücuttaki hücrelerin% 61'i VGLUT pozitifve% 43'ü Tbr1 pozitifti.

Gövdelerden yapılan MEM kayıtları, uzun süreler boyunca alınabilmekte ve kayıtlar kortikal ağ seviyesinde patlama gelişimini göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, insan iPSC'lerinden SFEB'lerin nasıl yetiştirileceğini iyi anlamalı, NSFEB'lerle cezalandırıcı gelişen kortikal rozetlerin nevurula içeriğini karakterize etmelisiniz. ve olgunlaşan SFEB'ler üzerinde nörofizyolojik testler yapın.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edebilir, çünkü iPSC'lerin ve iPSC'nin davranışının kültürdeki nöronlara ulaşması için gerekli bilimsel alanı geliştirmek zaman ve pratik gerektirir. Kültürlenmiş hücreler günlük olarak izlenmelidir. Bu prosedürü takiben, ilaç tedavilerinin kortikal ağ salınımlarına ne yapabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.