Fotoğrafa Duyarlı Polimerik Nanokarbonlardan SiRNA Salınımının Spatiotemporal Kontrolü ile Gen Silenceresinin Öngörülmesi

Bu yöntemlerin genel amacı, küçük enterferans yapan RNA aracılı gen susturma verimliliklerinin tahminini başaramamak ve sonuçta ortaya çıkan protein ekspresyon seviyeleri üzerinde mekansal zamansal bir şekilde kontrolü kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, yapıyı, işlevi, ilişkileri ve uyaranlara duyarlı dağıtım araçlarını açıklayabilir. Bağlanma ve serbest bırakma üzerinde daha iyi kontrol elde etmek, çevrilebilir platformların ve ilaç keşfinin yanı sıra rejeneratif tıp teknolojilerinin kilidini açabilir.

Bu tekniğin temel avantajları, gen ekspresyonundaki değişikliklerin basit bir siRNA salım tahlilleri ve kinetik modelleme olarak baz üzerinde kontrol edilebilmesi ve tahmin edilebilmesidir. Bu yöntemler yeni ışığa duyarlı polimerler kullansa da, bu tahlil seti, çok çeşitli diğer uyaranlara duyarlı sistemleri test etmek için kolayca uyarlanabilir. Başlamak için, pH altıda 20 mikromolar HEPES çözeltisine siRNA ekleyerek mililitre başına 32 mikrogramlık bir siRNA çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra, pH altıda 20 milimolar bir HEPES çözeltisine çözünmüş mPEG blok poliAPN BMA polimerleri ekleyerek bir polimer çözeltisi hazırlayın. Mililitre başına 220 mikrogramlık bir konsantrasyon elde etmek için, bu konsantrasyon dörtlük bir N ila P oranı ile sonuçlanacaktır, yani polimer üzerinde siRNA üzerindeki fosfat gruplarından dört kat daha fazla amin grubu olacaktır. Daha sonra, bir girdap makinesinde hafifçe karıştırırken, polimer çözeltisini eşit hacimde siRNA çözeltisine damla damla ekleyin.

Polimer ilavesini takiben 30 saniye boyunca girdaba devam edin. Ardından, numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. STS çözeltisini, bir girdap makinesinde hafifçe karıştırırken her bir nanotaşıyıcı çözeltisine damla damla ekleyin.

SDS sürümünü takiben 30 saniye boyunca girdaba devam edin. Numuneleri 3.000 Gs'de beş saniye santrifüjleyin, ardından numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 365 nanometre filtreli bir UV lazeri metrekare başına 200 watt yoğunluğa kalibre edin ve ayarlayın.

Ardından, lastik contaya bir delik açın, lastik contayı yıkanmış ve kurutulmuş bir cam kızak üzerine yerleştirin. Nanocarrier SDS solüsyonunu lastik contanın deliğinin içindeki cam sürgüye pipetleyin. Lastik conta ile temastan kaçınırken cam kızağın üzerine fazla miktarda çözelti yükleyin.

İkinci cam sürgüyü sürgü contasının üzerine yerleştirin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, önce sürgünün bir ucunu aşağı yerleştirin ve ardından diğer ucunu yavaşça indirin. Yakın tutmak için cam haznenin her iki tarafına bağlayıcı klipsler takın.

Metrekare başına 200 watt yoğunlukta 365 nanometre filtreli UV lazer kullanarak numuneleri istenen süre boyunca ışınlayın. Bağlayıcı klipsleri çıkarın ve hazneyi açın. Daha sonra, ışınlanmış nanotaşıyıcı SDS örneklerinden 25 mikrolitre pipetleyin mikro santrifüj tüplerine yerleştirin.

Çözeltileri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Her nanocarrier SDS örneğinin 25 mikrolitresine beş mikrolitre yükleme tamponu çözeltisi ekleyin. Numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Ardından, her bir nanotaşıyıcı SDS örneğinden 30 mikrolitreyi, etidyum bromür ile önceden boyanmış %2'lik bir agaroz jele yükleyin. Jeli karanlıkta 100 voltta 30 dakika çalıştırın. Etidyum bromür filtreli bir jel görüntüleme sistemi kullanarak jeli görüntüleyin.

Jel görüntü dosyalarını kaydedin ve metin protokolünde açıklandığı gibi büküm yoğunluğu ölçümüne devam edin. Yapışkan yüzeyi ortaya çıkarmak için kağıt parçalarını çift taraflı yapışkan ara parçadan çıkarın. Ara parçayı bir cam kapak sürgüsüne takın.

Nanocarrier SDS solüsyonunu kapak fişine pipetleyin. Ardından, önceden yıkanmış bir cam sürgüyü, yapışkan ara parçadan gelen delik numunenin etrafında ortalanacak şekilde kapak sürgüsünün üzerine yerleştirin. Cam sürgünün ve kapak sürgüsünün iyi bir şekilde takıldığından ve bir conta oluşturduğundan emin olmak için cam sürgüyü itin.

FCS ölçümleri için 1.2 sayısal açıklığa sahip, 40 kat suya daldırıcı, aperkromal objektife sahip konfokal bir mikroskop kullanın. Örnek başına her biri 10 saniyelik en az 30 ölçüm toplamak için uygun uyarma lazer kanalını kullanın. Ardından, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, gen susturma tepkilerini tahmin etmek için FCS'den siRNA salım verilerini kinetik bir modele girin.

İn vitro siRNA dağıtımını hazırlamak için, önce altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin inkübatörde 24 saat boyunca yapışmasına ve iyileşmesine izin verin. Hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkadıktan sonra, 1.5 mililitre serum ve antibiyotik içermeyen transveksiyon ortamı ekleyerek transveksiyona hazırlayın.

Daha sonra, her biri 30 kuyucuk 30 pikomol siRNA tp içeren 25 mikrolitre nanotaşıyıcı çözelti ekleyin. Karıştırmak için ortamı yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri üç saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Transveksiyon ortamını çıkarın ve her birini PBS ile yıkayın. Ardından, bir mililitre takviye edilmiş büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca iyileşmek için inkübatöre yerleştirin. Hücreleri bir foto uyaranla tedaviye hazırlamak için, takviye edilen büyüme ortamını çıkarın.

Ardından, her kuyucuğa bir mililitre transveksiyon ortamı ekleyin. UV lazeri metin protokolünde açıklandığı gibi kalibre ettikten sonra, hücreleri 37 santigrat dereceye ayarlanmış sıcak bir plakaya yerleştirin. Kapağı altı kuyulu plakadan çıkarın.

Metrekare başına 200 watt yoğunlukta 365 nanometre filtreli UV lazeri kullanarak hücreleri plakanın üstünden istenen süre boyunca ışınlayın. Transveksiyon ortamını çıkarın ve iki mililitre takviye edilmiş büyüme ortamı ekleyin. Daha fazla analize kadar hücreleri inkübatöre yerleştirin.

365 nanometre ışığı tamamen bloke eden ve yansımaları en aza indiren bir fotoğraf maskesi hazırlamak için öncelikle fotoğraf maskesine istenen şekli kesin, delin ve/veya makineleyin. Fotoğraf maskesini altı oyuklu plakanın dibine yapıştırın, desen hücreleri içeren kuyuya ortalanmış ve yansıma önleyici taraf plakaya bakacak şekilde yapıştırın. Yaklaşık 25 metre aralıklarla iki halka ayağı kurun ve platformlar eşit yükseklikte olacak şekilde her bir halka ayağına bir platform ayırın.

Plakayı platformların üzerine koyarak hücre plakasını iki sehpa arasına asın. Metrekare başına 200 watt yoğunlukta 365 nanometre filtreli bir UV lazer kullanarak hücreleri numunenin altından istenen süre boyunca ışınlayın. Transveksiyon ortamını çıkarın ve iki mililitre takviye edilmiş büyüme ortamı ekleyin.

Ardından, hücreleri en az 24 saat iyileşmek için inkübatöre yerleştirin. Hücreleri daha önce açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Burada gösterilen, gen susturma dinamiklerinin basit kinetik modellemesine bir örnektir.

Model, foto-indüklenmiş siRNA salınımını takip eden zamanın bir fonksiyonu olarak mRNA, protein ve siRNA konsantrasyonlarını tahmin etmek için çalıştırıldı. Farklı ışık dozajlarını takiben salınan nispi siRNA miktarları, kinetik modelde ilk siRNA konsantrasyonu olarak girildi. Protein ekspresyon seviyeleri için ortaya çıkan model tahminleri, western blotlama yoluyla elde edilen deneysel olarak belirlenen ekspresyon seviyeleri ile bir uyum içindeydi.

Görselleştirme için, GFP eksprese eden hücreler, GFP hedefleme siRNA ile muamele edildi ve dairesel bir desen oluşturmak için ışınlamadan önce plaka üzerine halka şeklinde bir fotoğraf maskesi yerleştirildi. Işıktan korunan hücreler, siRNA ve ışıkla muamele edilmeyen kontrol örneklerinden ayırt edilemeyen floresan yoğunluğu sergiledi. Bununla birlikte, dairesel model içindeki hemen hemen tüm hücreler, verimli siRNA salınımını ve gen yıkımını gösteren hiçbir GFP ekspresyonu sergilemedi.

Ayrıca, ışık kullanımı, hücresel uzunluk ölçeklerinde kontrol edilmesi için tetikleyici bir gen ifadesidir. Özetle, bu yöntem, siRNA salınımını mekansal-zamansal olarak kontrol etmek ve gen susturulmasını a priori olarak tahmin etmek için ışınlama koşullarının hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu protokolün kullanılması, nano taşıyıcının stabilitesini ve etkinliğini yöneten yapı, fonksiyon, ilişkilerin aydınlatılmasına yardımcı olacaktır.

Bu teknik, gen ekspresyonu üzerinde uzaysal-zamansal kontrol gerektiren rejeneratif tıpta uygulamalara olanak sağlayabilir. Bu formülasyonlar ayrıca cilt kanseri gibi lokalize bozuklukların yanı sıra dermatolojik bozuklukların tedavisi için de çok uygundur.