Orta Ölçekli Hazırlanışı Drosophila Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri
30 Mayıs 2017
Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).
Bu deneyin genel amacı, Drosophilia Embriyolarını orta ölçekte toplamak için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır. Ve afinite saflaştırma kütle spektrometresi gibi alt Proteomik uygulamalarda kullanılabilecek protein ekstraktlarının hazırlanması. Bu yöntem, hücre sinyalizasyonu ve gelişim biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Örneğin, spesifik protein, protein etkileşimlerinin organizma gelişimi sırasında hücre iletişimini nasıl gerçekleştirdiği. Bu tekniğin ana avantajı, bir Drosophila embriyo Lizisi oluşturmak için kolay ve ucuz bir yöntem olmasıdır. Protein afinite saflaştırması gibi alt uygulamalar için kullanılabilir.
Geleneksel olarak, araştırmacılar Drosophila embriyolarını çok büyük popülasyon kafeslerinde topladılar. Ancak, herhangi bir laboratuvarda kolayca kurulabilen orta büyüklükteki kafeslerde embriyoları toplamak için kullanıcı dostu bir prosedür sunuyoruz. Beş litrelik kaplar hazırladıktan ve metin protokolüne göre 25 x 25 santimetre karelik naylon ağ kestikten sonra, ağı kabın üzerine yerleştirin ve kapakla aşağı doğru bastırın.
Ağın sıkı olduğundan ve kapağın eğilmediğinden emin olun. Kafes artık sineklerle doldurulmaya hazırdır. Bir litrelik plastik kavanozların ve 18 x 18 santimetre naylon ağ karelerinin hazırlanmasının ardından, ağı kavanozun üst kenarına yerleştirin ve sıkmak için kapağı vidalayın.
Ağın sıkı olduğundan ve kapağın eğilmediğinden emin olun. Transgenik sinek hatlarını büyütmek, ilgilenilen yazılan proteini taşır. Ve her sinek hattı için 25 ila 30 şişe birikene kadar şişeleri iki günde bir aktarın.
Bir kontrol stoğunu da benzer şekilde büyütün. Sonra, elma suyu tabaklarını oda sıcaklığına ısıtın. Daha sonra eldivenli bir parmak kullanarak plakaların ortasına biraz ıslak maya macunu sürün.
15 santimetrelik bir plaka için yaklaşık altı santimetrelik bir daire yapmak. Ve 10 santimetrelik bir plaka için dört santimetrelik bir daire. Sinekleri uyuşturduktan ve ağ aşağı bakacak şekilde hazırlanan kafeslere aktardıktan sonra, kafesleri elma suyu plakaları ile örtün.
Sineklerin uyanmasına izin verin. Sonra kafesleri ters çevirin ve sinekleri oda sıcaklığında iki ila üç gün kuluçkaya yatırın. Kafesi ters çevirerek plakaları günde iki kez değiştirin ve plakayı kafese tutarken bandı plakadan soyun.
Tüm kafesi tezgahın üzerine hafifçe vurun ve sineklerin kaçmasına izin vermemeye çalışarak eski plakayı hızlı bir şekilde yenisiyle değiştirin. Sineklerin embriyoları gece boyunca veya istenen herhangi bir süre boyunca taze elma suyu plakalarına bırakmasına izin verin. Ertesi sabah, embriyo toplama için ağ kaplarını işaretleyin ve tartın.
Kullanılan her sinek hattı için bir tane. 50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre 5x konsantre Lizis Tamponuna 40 mililitre su ekleyerek, önceden yapılmış reaktifleri kullanarak 50 mililitrelik bir tüpte 1x Lizis Tamponu hazırlayın. Bir mili molar'ın son konsantrasyonunda 50 mikrolitre bir molar DTT ekleyin.
İyice karıştırın ve çözeltiyi iki adet 50 mililitrelik tüp arasında bölün. Tüplerden birine bir proteaz inhibitör tableti ekleyin. Ve tüpü 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin.
Tablet çözülürken, kullanılan sinek hatlarının genotipleri ile kafeslerin üzerindeki elma suyu plakalarını işaretleyerek embriyoları toplamaya başlayın. Ve plakaları yenileriyle değiştirin. Her bir elma suyu tabağını kaplayacak kadar su ekleyin.
Daha sonra yumuşak bir boya fırçası ile embriyoları plakadan nazikçe çıkarın. Embriyoları önceden tartılmış ve işaretlenmiş ağ kabına dökün ve fazla suyu boşaltın. Ardından, fazla suyu çıkarmak için ağı kağıt havluların üzerine kısa bir süre kurulayın.
Embriyoları dekoryonlaştırmak için, altı santimetrelik bir Petri kabını yarıya% 50 çamaşır suyu ile doldurun. Sonra su ile iki büyük Petri kabı hazırlayın. Kafes kabını embriyolarla birlikte 90 saniye boyunca% 50 ağartıcıya batırın.
Embriyoları ağartma solüsyonunda askıya almak için inkübasyon sırasında ağa birkaç kez hafifçe vurun. Kuluçka işleminin sonunda, iki kabın her birinde ağ kabını yaklaşık 10 saniye boyunca yıkamak için su kullanın. Ardından, ağ kabını yanlar ve dış kısımlar da dahil olmak üzere iyice durulamak için bir fışkırtma şişesinde 18.2 megohm santimetre su kullanın.
İyice yıkandıktan sonra çamaşır suyu kokusu algılanmamalıdır. Ağ kabını kağıt havluların üzerine kurulayın. Daha sonra kafes kabı embriyolarla tartın ve boş kabın ağırlığını çıkarın.
Embriyoların ortaya çıkan ağırlığını kaydedin. Embriyo ekstraktını hazırlamak için, bir Dounce cam homojenizatöre proteaz inhibitörleri içeren bir mililitre Lysis Buffer ekleyin ve buz üzerinde tutun. Daha sonra embriyoları ağ kabından homojenizatöre aktarın.
Ağ üzerinde kalan embriyoları yıkamak için bir mililitre Lizis Tamponu kullanın. Ve embriyoları ekleyin ve homojenizatördeki malzemeye tamponlayın. Daha sonra embriyoların homojenizatörün dibine çökmesine izin verin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Daha sonra, homojenizatöre proteaz inhibitörleri içeren Lizis Tamponu ekleyin ve bir gram embriyo başına beş ila altı mililitre Lizis Tamponu hedefleyin. Daha sonra embriyoları dört ila altı vuruşla homojenize etmek için gevşek bir tokmak tokmağı yerleştirin. İlk vuruşlar sırasında daha fazla direnç olacaktır.
Çözeltinin sıçramasını önlemek için havaneli sürekli bir hareketle hareket ettirmeye çalışın. Ardından sıkı oturan bir tokmağa geçin. Ve embriyoları sekiz ila 10 vuruşla homojenize edin.
Homojeni buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra homojeni mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ve 13.000 zaman G'de ve 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin.
En üst lipit tabakasındaki peletlerden kaçınırken, süpernatanları buz üzerindeki taze mikro santrifüj tüplerine aktarın. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, süpernatanları dikkatlice toplamak için bir mililitrelik bir uç kullanın. Ve bunları 045 mikrometre filtreler takılı olarak soğutulmuş, 10 mililitrelik şırıngalara aktarın.
Çözeltinin tamamını buz üzerinde etiketli iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine itin. Numuneleri sıvı Nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Veya protein saflaştırma deneyleri için hemen kullanın.
Bu videoda açıklanan protokol kullanılarak, arm-odillo promotörü kontrolü altında EGFP-ERK proteinini her yerde eksprese eden Drosophila embriyolarından Lysates hazırlandı. Protein ekspresyonu, sırasıyla 42 kilodalton ve 69 kilodaltonda göç eden endojen ve transgenik EGFP-ERK seviyelerini aynı anda tespit etmek için toplam ERK proteini için Western Blotting ile doğrulandı. Sarı beyaz kontrol hattında etiketlenmemiş endojen ERK'ya karşılık gelen tek bir bant tespit edildi ve bu da embriyolardan ERK ve EGFP-ERK'nin başarılı bir şekilde çıkarıldığını doğruladı.
Ekstraksiyon protokolünün etiketli proteinin müteakip saflaştırılması için uygun olup olmadığını test etmek için, sarı beyaz ve arm-EGFP-ERK sineklerinden elde edilen ekstraktlar, GFP Agaroz Boncukları kullanılarak afinite saflaştırmasına tabi tutuldu. Gradyan bir SDS-PAGE üzerinde çalıştırılan numunelerin gümüş boyanması, yem proteini EGFP-ERK'nin başarılı bir şekilde saflaştırılmasını gösterir. EGFP-ERK'nin yanı sıra, deney şeridi, kontrol numunesinde gözlenmeyen ek bantlar içeriyordu, bu da saflaştırmanın potansiyel ERK etkileşimli proteinleri geri kazandığını düşündürüyor.
Bir kez ustalaştıktan sonra, embriyo toplama ve ekstraksiyon adımları yaklaşık iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ekstraksiyon adımlarını buz üzerinde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Ve protein bozulmasını en aza indirmek için proteaz inhibitörleri kullanmak.
Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila popülasyon kafeslerinin orta ölçekte nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Ve embriyolardan tam hücre protein özleri yapın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, orta ölçekte Drosophila embriyoları toplamak ve protein ekstraktları hazırlamak için basit ve düşük maliyetli bir yöntemi özetlemektedir. Bu ekstraktlar, afinite saflaştırma-kütle spektrometrisi (AP-MS) dahil olmak üzere çeşitli proteomik uygulamalarda kullanılabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Hücre Sinyalizasyonu
- Proteomik
Arka Plan
- Drosophila embriyoları, gelişimsel süreçlerin incelenmesi için değerlidir.
- Protein etkileşimleri, gelişim sırasında hücre iletişimi için kritik öneme sahiptir.
- Afinite saflaştırma-kütle spektrometrisi, proteomikte temel bir tekniktir.
- Bu yöntem, protein fonksiyonları ve etkileşimleri hakkında içgörüler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Embriyo toplama için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem geliştirmek.
- Alt uygulamalar için protein ekstraktları hazırlamak.
- Hücre sinyalizasyonu ve gelişim biyolojisi araştırmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Orta ölçekte (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması.
- Toplanan embriyolardan protein ekstraktlarının hazırlanması.
- Ekstraktların afinite saflaştırma-kütle spektrometrisi yönteminde uygulanması.
- Hücre iletişimi ile ilgili protein etkileşimlerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, embriyoların verimli bir şekilde toplanmasına ve işlenmesine olanak tanır.
- Protein ekstraktları AP-MS çalışmalarında başarıyla kullanılabilir.
- Gelişim sırasındaki protein etkileşimlerine dair bilgiler edinilmiştir.
- Protokolün maliyet etkinliği ve basitliği kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, Drosophila embriyolarının incelenmesi için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Gelişimsel biyolojide protein fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Yöntem, alandaki araştırmacılar için erişilebilirdir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Alaka
Bu protokol, proteomik uygulamalar için Drosophila embriyo lizatlarının ölçeklenebilir ve düşük maliyetli bir şekilde hazırlanmasını sağlayarak, erken keşim aşamasındaki hedef doğrulamayı ve mekanik risk azaltmayı destekler. In vivo kaynaklı bir protein etkileşim ağı sunarak, yolak analizindeki öngörüsel güvenilirliği artırır ve ilaç hedefi seçimindeki biyolojik belirsizliği azaltır. Bu yöntem, özellikle fizyolojik açıdan ilgili biyolojik sistemler gerektiren tarama ve analiz geliştirme iş akışları için uygundur.
Biyofarmasötik Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik olarak işlenebilir bir sistemde, in vivo protein-protein etkileşimi haritalaması yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fonksiyonel hedef doğrulamayı ve yolak açıklığını destekleyen biyolojik olarak ilgili lizatlar sağlar.
- Stratejik Değer: Erken hedef değerlendirmesindeki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini ve portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Afinite saflaştırma-kütle spektrometrisi gibi sonraki uygulamalar için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için analiz standardizasyonu, tekrarlanabilirlik ve kantitatif çıktı üretimi sağlar.
- Stratejik Değer: Ölçeklenebilir, düşük maliyetli embriyo toplama ve liz prosedürleri aracılığıyla tarama hazırlığını ve platform yeniden kullanımını artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Gelişimsel sinyal yolakları ile ilgili olan ve embriyogenez sırasında eksprese edilen proteinleri yakalayarak hastalığa özgü sistem içgörüleri sunar.
- Operasyonel Değer: Tutarlı ve ekstraksiyona hazır lizatlar aracılığıyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar translasyonel sürekliliği kolaylaştırır.
- Stratejik Değer: Hücre iletişimi ve gelişime dahil olan hedeflerin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olarak, aşağı yönlü proteomik uygulamalar için mekanistik olarak bilgilendirilmiş lizatlar sağlar.
- Keşif Biyolojisi: İn vivo kaynaklı protein etkileşim ağları aracılığıyla hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış embriyo toplama ve protein ekstraksiyonu ile analiz hazırlığını ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Analizler: Karşılaştırmalı durum analizi ve etkileşim profilleme için kütle spektrometresi ile uyumlu kantitatif lizatlar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Gelişimsel hastalık modelleriyle ilgili embriyogenez aşaması lizatları sağlayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve sinek hattı genelinde orta ölçekli embriyo lizat üretimi için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güveni, hedef doğrulaması, sinyalizasyon ve gelişimsel yolaklardaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: 0,5-1 g ölçeğinde embriyo toplama ve liz işleminin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Erken mekanistik içgörüler aracılığıyla daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış in vivo etkileşim verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Drosophila işlemleri, embriyo toplama ve protein ekstraksiyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Kafesler, tel örgü, homogenizatörler, santrifüjler ve filtrasyon sistemlerini içeren standart laboratuvar ekipmanlarına ihtiyaç duyar.
- Tutarlı embriyo evrelemesi, toplama zamanlaması ve lizis tamponu hazırlığı için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Farklı transgenik sinek hatları ve genetik arka planlar için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Ekstraksiyonun buz üzerinde gerçekleştirilmesi ve degradasyonu minimize etmek için proteaz inhibitörlerinin kullanılması gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
