Beyaz sinekten Endosimbonların Çıkarılması İçin Yöntemler Bemisia tabaci

Bu deneyin genel amacı, daha ileri deneyler için küçük böceklerden endosimbiyontları çıkarmaktır. Bu yöntem, entomoloji ve makrobiyoloji görüşündeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, çünkü çoğu endosimbiyont in vitro kültürlenemez. Yöntemin yeterli miktarda bakteri izole edildiğini göstermek daha sonraki deneyler için çok önemlidir.

Bu tekniğin temel avantajı, beyaz sinek bakteri endosimbiyontlarını rahatça izole edebilmemizdir. Bu aynı zamanda endosimbiyotiklerin yaprak bitleri, bitki hunileri ve tripsler gibi diğer böceklerden izolasyonuna da uygulanabilir. Başlamak için, tek bir yetişkin beyaz sinek toplayın ve 30 mikrolitre lizis tamponunda homojenize edin.

Homojenatı 65 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Sonra 10 dakika boyunca 100 santigrat derece. Beyaz sinek DNA'sı ve mitokondiyal sitokrom oksidaz 1 primerlerini kullanarak, aşağıdaki reaktifleri kullanarak 25 mikrolitre PCR reaksiyonu hazırlayın.

Ardından, burada gösterilen programı kullanarak PCR reaksiyonlarını çalıştırın. Ardından, PCR ürününü temizlemek için önerilen protokolü izleyerek bir DNA jeli ekstraksiyon kiti kullanın. Ardından, metin protokolüne göre dizi analizi yapın.

Beyaz sinek içindeki her bir endosimbiyotun spesifik genlerini amplifiye etmek için, beyaz sinek DNA'sı üzerinde PCR gerçekleştirin. Daha önce yayınlanmış bir protokole göre, beyaz sinek içindeki bakteri türlerini belirlemek ve her bakterinin spesifik genini tanımlamak için amplifiye edilmiş numuneyi agaroz jel elektroforezi ve dizilimine tabi tutun. Beyaz sinek bakteriyomunu incelemek ve saflaştırmak için, bir mikroskop lamı üzerine 100 mikrolitre 1x PBS çözeltisi ekleyin.

Ardından, pamuk yapraklarından üçüncü veya dördüncü instar nimflerini toplayın. Ve onları PBS'ye daldırın. Mikroskop altında, bakteriyomları beyaz sinek vücudundan çıkarmak için ince entomolojik iğneler kullanın.

Küçük ve kırılgan olduğu için bakteriyomu izole ederken dikkatli olun. Nimf bir tarafında yavaşça bir delik açın ve bakteriyomları dışarı çıkarmak için diğer tarafa hafifçe bastırın. Ardından, 20 mikrolitrelik bir mikro yükleyiciyi 0,5 ila 10 mikrolitrelik bir pipete monte edin ve tek tek bakteriyi PBS'den mikro yükleyiciye çıkarın.

Bakteriyomu PBS'ye pipetleyerek ve ekstrakte ederek diğer beyaz sinek dokularının kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için bakteriyomu yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın. Mümkün olduğunca fazla kirlenmeyi önlemek için yıkamanın tekrarlanması şiddetle tavsiye edilir.

Yıkanmış bakteriyomu hemen 60 mikrolitre PBS içeren bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Şırınga, monte edilen bakteriyomu beş mikrometrelik bir filtre zarından süzer. Karıştırılan sıvıyı zardan iyice hareket ettirmek için filtrelemeyi birkaç kez tekrarlayın.

Filtratı amplifiye etmek için, genomik DNA'nın kandan veya hücrelerden bazı modifikasyonlarla amplifikasyonu için önerilen protokolle birlikte kullanılacak tampon D2'yi hazırlayın. Doğrudan bir santrifüj tüpüne 1.5 mikrolitre süzüntü ekleyin, ardından 1.5 mikrolitre tampon D2 ekleyin. İyice karıştırın ve numuneyi 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından 1,5 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin.

15 mikrolitre reaksiyon tamponu ve bir mikrolitre DNA polimeraz ekleyin ve yavaşça karıştırın. Karışımı 30 santigrat derecede 16 saat, ardından 65 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Bakteri türlerini doğrulamak için bakteriler için tasarlanmış özel primerler kullanarak PCR'yi doğrudan amplifiye edilmiş filtrat üzerinde gerçekleştirin.

Ayrıca, daha önce yayınlanan yönteme göre beyaz sinek genleri beta-aktin ve EF1 için primerler kullanarak konakçı genomundan kontaminasyon olup olmadığını doğrulamak için PCR yapın. Son olarak, metin protokolüne göre meta genom dizilemesi yapın. Bu şekilde, beyaz sineklerin yetiştirilmesi için pamuk ve beyaz sineklerin çeşitli gelişim aşamaları gösterilmiştir.

Bir yetişkin ve birinci, ikinci ve dördüncü instar perileri dahil. MEAM1'in dördüncü instar nimf içindeki endosimbiyontlar Portiera ve Hamiltonella'nın FISH analizi burada gösterilmiştir. İki bakterinin örtüşmesi gözlenir ve her ikisi de beyaz sineğin bakterisitleri ile sınırlıdır.

Burada, Portiera'nın hücre duvarını kaybedebileceğini gösteren beyaz sineğin Portiera endosimbiyontunun transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri gösterilmektedir. Adaptörler ve çoğaltmalar için kontaminasyon verilerinin dizilenmesi ve temizlenmesinden sonra, zorunlu simbiyont Portiera'nın tam genomu elde edildi. 358.232 baz çiftinden oluşan dairesel bir genom ile sonuçlanır.

Ek olarak, eşleştirilmiş uç ilişkilere dayalı olarak 89 iskeleye monte edilen 138 contig içeren bir Hamiltonella taslak genomu elde edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa 20 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numuneleri çevresel bakterilerin kontaminasyonundan korumayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, endosimbiyont gen ekspresyonu ve metabolizma gibi ek soruları yanıtlamak için RA dizisi ve kütle bakteriyomu gibi diğer analizler yapılabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, entomoloji ve mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların böceklerde veya eklembacaklılarda endosimbiyontların işlevini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, böcek bakteriyomlarından simbiyontların nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bazı reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.