Name: Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Keşfedin, protein bazlı hidrojellerin üç boyutlu mimarisini hücre kültürü uygulamaları için nasıl optimize edeceğinizi. Bu yöntem, farklı hücre tiplerine göre malzeme özelliklerini ayarlamanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Baden-Württemberg Stiftung (BioMatS-14) "Bioinspired malzeme sentezi" çerçevesinde finansal destek için teşekkür etmek istiyorum.

1. hidrojel hazırlık
<ol>
	<li>BSA 200 mg %20 (w/v) BSA stok (stok çözelti A) oluşturmak için deiyonize H2O 1 mL ile karıştırın.</li>
	<li>THPC çözüm (134 mg/mL) Mix 165 µL 4.835 mL THPC oluşturmak için deiyonize su ile stok çözüm (hisse senedi çözüm B).</li>
	<li>KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptid (veya eşdeğer bir hücre yapışkanlı peptid) 1 mg tartmak ve 10 mg/mL solüsyon (hisse senedi çözüm C) elde etmek için steril H2O 100 µL içinde seyreltik. Not: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca hidrojel hücre kültür uygulama için gerekse dahil edilmesi gerekiyor.</li>
	<li>96-şey plaka altındaki çıkarın ve çıkarılabilir plastik wrap ile değiştirin. Not: Burada kullanılan plakalar için alt her kuyunun için basınç uygulayarak kolayca kaldırılabilir; ince plastik alt sadece düşecek.</li>
	<li>BSA hisse senedi çözüm mix 100 µL (A) ve THPC 100 µL stok çözüm (B) (isteğe bağlı: functionalized, hücre yapışkanlı hydrogels için hisse senedi çözümü C 4 µL) hidrojel 200 µL elde etmek için 96-şey plaka. Bileşenleri yukarı ve aşağı en az 5 kez bir üniforma hidrojel polimerizasyon sonra garanti pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Kadar tüm hydrogels düzgün polimerli, oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 10 dakika için 96-şey plaka koyun.</li>
	<li>Dikkatli ve yavaş plastik wrap kalenin altından kaldırın.</li>
	<li>Hydrogels küçük bir damga kullanarak 96-şey plaka dışında basın ve steril PBS, pH 7.4 ile 1,5 mL tüpler için aktarabilirsiniz. Not: Hydrogels silindir şeklinde, çapı yaklaşık olarak 4 mm ve 8 mm yüksekliğe sahip.</li>
	<li>Hydrogels fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ° C'de için birkaç ay kadar saklayın.</li>
</ol>
2. Hydrogels dağılması
<ol>
	<li>1.5 mL tüpler steril deiyonize H2O 500 µL ile doldurun ve kapağını çıkarın. Hydrogels bir spatula kullanarak 1,5 mL tepki tüpler aktarın.</li>
	<li>1.5 mL tüpler parafin film, en az üç katmanları için her şişe ile sıkıca sarın. Tüp gaz yayın etkinleştirmek için film küçük delik delmek için bir iğne kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki adımlardan birini yapın:
	<ol>
		<li>Şişe su ve hidrojel tamamen dondurma güvence altına almak 5 min için sıvı azot çözüm aktarın. Sıvı azot dan hemen kaldırıldıktan sonra dondurma çözdürme üzerinden malzeme önlemek için kurutma şişeleri aktarın. Not: Bu yordam hakkında gözenekleri sonuç 10-15 µm yarıçap içinde.</li>
		<li>Şişeleri-20 ° C'de yavaş yavaş hydrogels dondurmak için gecede devam et. -20 ° c hemen kaldırıldıktan sonra dondurma çözdürme üzerinden malzeme önlemek için kurutma şişeleri aktarın. Not: Bu yordam hakkında gözenekleri sonuçları yarıçap içinde 50-60 µm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24 h (ve tam buharlaşma ve hidrojel çevresinde su) sonra malzeme Donma kurutma makinesi kaldırarak çözülme. Not: Gözenek boyutları mikroskobu (Adım 5, "Hidrojel görselleştirme") tarama confocal lazer ile çözümlenebilir.</li>
</ol>
3. parçacık Leaching
<ol>
	<li>Hidrojel 1,1-1,5 adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Doğrudan bileşenleri karıştırma sonra doygunluk (36 mg/mL) oluşana kadar NaCl ekleyin. Tuz kristal çözümde bir beyaz çökelti görülebilir kadar tuz ekleyin.</li>
	<li>96-şey plaka bir shaker aktarmak ve polimerizasyon gerçekleşir (yaklaşık 10 dakika) kadar çalkalanır. Hydrogels plaka, 1.7-1.8 adımlarda açıklandığı gibi kaldırın.</li>
	<li>Hydrogels hidrojel şablondan tüm tuz elute RT bir shaker (20 devir/dakika) steril su içinde en az 24 saat için kuluçkaya. Hydrogels 4 ° C'de PBS için birkaç ay kadar saklayın.</li>
</ol>
4. kanal oluşumu
<ol>
	<li>Hydrogels 1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir hidrojel bir kıskaç kullanma çözümden kaldırmak, aşırı su ile yüksek emici kağıt çıkarın ve kuru buz kalıbı üzerine yerleştirin.</li>
	<li>30 hidrojel dondurmak s ve dikkatli bir şekilde blok çıkarın. Hidrojel zarar vermeyen; dikkatli bir spatula bloktan kazımak için kullanın. 1.5 mL tüp hidrojel aktarmak ve gecede 37 ° C'de Kuru</li>
</ol>
5. hidrojel görselleştirme
<ol>
	<li>Rodamine B hisse senedi çözüm rodamine B PBS 10 ml 1 mg sulandrarak hazırlayın. Bir seri seyreltme konsantrasyonu 0.001 mg/mL ulaşılana kadar PBS rodamine hisse senedi çözümde sulandrarak hazırlamak (seyreltme faktörü: 100)</li>
	<li>Depolama çözümü (Örneğin, adım 2.4.) hidrojel kaldırmak ve 1 mL 0.01 mg/mL rodamine B çözeltisi ile 1,5 mL tüp aktarmak. RT rodamine B çözüm geceleme hidrojel leke</li>
	<li>Ertesi gün, PBS (pH 7,4) ve yıkama için en az 3 h 10 ml görüntülenmeyecektir için hidrojel aktarın.</li>
	<li>Bir slayda bir µ-8 hidrojel de transfer ve PBS ile kaplayın.</li>
	<li>Bir bıçak kullanarak hidrojel (yaklaşık 0.5 mm içinde yükseklik) dışında küçük dilimler kesin.</li>
	<li>Mikroskop, tarama confocal lazer kullanarak görselleştirmek hidrojel bir dalga boyu 514, nm (Amaç: EC planı-Neofluar 40 x / 1,30 petrol DIC M27, uçak tarama modu: 514 nm ve yakınlaştırma: 1 X).</li>
</ol>
6. hücre kültür fizibilite
<ol>
	<li>Steril-filtre 0,45 µm filtre ile tüm stok Çözümleri (A, B ve C).</li>
	<li>Hidrojel 1.1-1.4 hidrojel polimerizasyon önce hücre yapışkanlı peptid de dahil olmak üzere, adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>De alt tamamen kaplıdır kadar bileşenleri karıştırma sonra hemen bir µ slayt 8 karışımı pipette. Not: polimerizasyon slayt dakika içinde yer alır gibi bu adımı diliye hizli ve dorudan bileşenleri, karıştırma sonra gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Kültür yapışma hücre ve bir tek hücre süspansiyon Standart hücre kültürü teknikleri kullanarak elde etmek için geçiş. Hücreleri Önceden ısıtılmış, steril DMEM hücre kültür fetal sığır serum (FBS, % 10 (w/v)), penisilin-streptomisin (%1 (w/v)) ve gerekli olmayan amino asit çözüm (MEM, %1 (w/v)) ile desteklenmiş orta içine aktarın.</li>
	<li>Sayım odası ve dikkatle pipet 200 µL hidrojel yüzeyine (2 x 105 hücreleri/cm2) hücrelerinin istenilen sayının bir Neubauer ile hücreleri saymak.</li>
	<li>Μ-slayt 8 de kapaklı kapağı ve bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) aktarın. En az 4 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>Hücresel eki en az 4 saat sonra hücreleri iki kez 200 µL steril hücre kültür PBS ile yıkayın.</li>
	<li>200 µL % 3.7 (v/v) formaldehit RT, 10 dk ile hücreleri tamir ve yıkama ile iki kez PBS (~ 200 µL). Not: uygun kişisel koruyucu ekipman formaldehit işleme giyerler.</li>
	<li>İki kez PBS ile 5 dk. yıkama için %0,1 Triton X 200 µL hücrelerle permeabilize.</li>
	<li>Methanolic stok 5 µL PBS 195 µL ile karıştırma ve RT. leke 20 dk için hücreleri karanlıkta hücrelere ekleme tarafından phalloidin-rodamine hücrelerle leke. İki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>514 confocal bir mikroskop kullanarak hücre adezyon özellikleri araştırmak nm (Amaç: EC planı-Neofluar 40 x / 1,30 petrol DIC M27, uçak tarama modu: 514 nm ve yakınlaştırma: 1 X). Uygun yazılımı kullanarak görüntüleri analiz ( Tablo reçetesigörmek).</li>
</ol>
7. hidrojel özellikleri
<ol>
	<li>Şişme oranı.
	<ol>
		<li>Tamamen hydrogels 37 ° C'de en az bir gün kuru.</li>
		<li>Her hidrojel tartmak ve tam ağırlık not edin.</li>
		<li>2 mL tepki tüp PBS 1,5 mL ile doldurulması.</li>
		<li>Bu 2 mL tepki tüpüne hidrojel aktarmak ve tamamen PBS içinde bırakın.</li>
		<li>Hidrojel PBS RT denge PBS ile ulaşmak için en az iki gün için bırakın.</li>
		<li>Üç gün sonra hidrojel çözümden kaldırmak ve hidrojel yüzeyindeki aşırı su çıkarmak için kağıt mendil ile kurulayın.</li>
		<li>Hidrojel tartın.</li>
		<li>Şişme oranı aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> Wd ağırlık kurutulmuş jel (adım 7.1.2.) ve Ws nerede ıslak jel (adım 7.1.7) ağırlığıdır. Şişme oranı yüzde 100 ile çarpmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pH ve sıcaklık istikrarı.
	<ol>
		<li>5 mL PBS de 15 mL tepki tüp aktarın.</li>
		<li>NaOH ve HCl. Bring uygun sıcaklık (Örneğin, RT, 37 ° C veya 80 ° C) çözümü ile çözüm uygun pH (Örneğin, pH 2, 7 veya 10) için ayarlayın.</li>
		<li>Uygun bir çözüm içine onun istikrar için soruşturma olması için hidrojel aktarın. PH gerekirse yeniden ayarlayabilirsiniz. Not: Tüm hydrogels tamamen bu noktada (bkz: şişme oranı) ağırlık malzeme şişmesi nedeniyle yanlış yorumlanması önlemek için şişmiş.</li>
		<li>Belirli zaman aralıklarında sonra çözüm (Örneğin, her saat için 2 gün) hidrojel kaldırmak, aşırı su kaldırmak ve tartmak çok emici kağıt mendil ile Makinası.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enzimatik bozulması.
	<ol>
		<li>300 U tripsin ve pepsin, üreticinin yönergelerine göre bir hisse senedi enzim çözüm hazırlamak.</li>
		<li>Hidrojel (Örneğin, adım 1.8) için uygun bir çözüm aktarın. Not: Tüm hydrogels tamamen bu noktada ağırlığı yanlış yorumlanması önlemek için şişmiş.</li>
		<li>Belirli zaman aralıklarında sonra hidrojel (Örneğin, her saat) eriyik--dan kaldırmak için aşırı su kaldırmak ve tartmak çok emici kağıt mendil ile kuru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomimetic+hydrogel+based+on+methacrylated+dextran-graft-lysine+and+gelatin+for+3D+smooth+muscle+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture.</a> Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).</li>
<li>Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+macroporous+PEG+hydrogels+as+3D+scaffolds+for+the+multiplication+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).</li>
<li>Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-component+protein-engineered+physical+hydrogels+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).</li>
<li>Zhu, J., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+properties+of+hydrogel+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devic%22%5BJournal%5D)">Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds.</a> Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).</li>
<li>Samaryk, V., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/app.30426/abstract">Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties.</a> J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).</li>
<li>Park, H., Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Swelling+Ratio+of+Injectable+Hydrogel+Composites+on+Chondrogenic+Differentiation+of+Encapsulated+Rabbit+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro.</a> Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).</li>
<li>Stokols, S., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fabrication+and+characterization+of+linearly+oriented+nerve+guidance+scaffolds+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury.</a> Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).</li>
<li>Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+guidance+channels+facilitate+regeneration+of+adult+rat+brainstem+motor+axons+after+complete+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection.</a> J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).</li>
<li>Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+hydrogels+used+in+cell+encapsulation%3A+An+in+vitro+comparison+of+alginate+and+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose.</a> Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).</li>
<li>Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+physical+and+mechanical+properties+of+porous+poly+%28ethylene+glycol%29-co-%28L-lactic+acid%29+hydrogels+during+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation.</a> PloS One. 8 (4), e60728(2013).</li>
<li>Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm202640w">Peptide- and Protein-Based Hydrogels.</a> Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).</li>
<li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bread+and+beer%3A+whole+cell+protein+extracts+from+baker%27s+yeast+as+a+bulk+source+for+3D+cell+culture+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biot%22%5BJournal%5D)">Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices.</a> Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/slct.201600206/abstract">A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties.</a> Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).</li>
<li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biome+Mater%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biome Mater. 5 (2), 21001(2010).</li>
<li>Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrospinning+highly+concentrated+cellular+suspensions+containing+primary+living+organisms+into+cell-bearing+threads+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds.</a> Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).</li>
<li>Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+strategies+for+generating+cell-encapsulating+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels.</a> Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).</li>
<li>Annabi, N., Nichol, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+porosity+and+microarchitecture+of+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+pore+generation+and+their+influence+on+physio-chemical+properties+of+a+protein+based+hydroge%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge.</a> Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).</li>
<li>Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+and+redox+sensitive+albumin+hydrogel%3A+A+self-derived+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial.</a> Sci Rep. 5, 15977(2015).</li>
<li>Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+crosslinking+methods+to+design+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliver+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel crosslinking methods to design hydrogels.</a> Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).</li>
<li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrakis%28hydroxymethyl%29+phosphonium+chloride+as+a+covalent+cross-linking+agent+for+cell+encapsulation+within+protein-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).</li>
<li>Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014305714004091">Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products.</a> Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).</li>
<li>Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+transformation+and+physical+properties+of+a+hydrogel-forming+peptide+studied+by+NMR%2C+transmission+electron+microscopy%2C+and+dynamic+rheometer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer.</a> Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).</li>
<li>Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li>
<li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li>
<li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li>
<li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li>
<li>Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm06053h">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763(2011).</li>
<li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+cell+adhesion%3A+RGD+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Makro gözenekli matrislerin üretimi birçok farklı alan için faydalı olabilir. Hidrojelin tanımlanmış yapısı ve belirli malzeme özelliklerini kontrol etme ve ayarlama yeteneği nedeniyle yüksek teknik ve ekonomik potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, gözenekler veya kanallar gibi supramoleküler yapısal elemanların bir 3 boyutlu şablona dahil edilmesi, bir malzemenin şişme oranı veya sertlik gibi genel özelliklerini etkileyebilir. Bu, ağın istenmeyen şekilde ayrışmasına, bozulmasına veya bozulmasına neden olabilir, böylec...

Hydrogels çözünmez 3D ağlar büyük miktarda su bağlama yeteneğine sahip formu malzemelerdir. Bu materyalleri canlı hücreler için mükemmel çevre koşulları sağlayabilir. Şu anda, orada ilgi üç boyutlu hidrojel yapıları nesil ve onların kimyasal ve fiziksel özellikleri terzi süreçlerinin geliştirme artmaktadır. Bir kez bu elde edilir, hücrelerinin büyümesini ve hücresel davranış manipülasyon için şablon oluşturulan1,2,3,4olabilir. Bu 3D yapılar sadece bir daha doğal ve gerçekçi daha geleneksel iki boyutlu yaklaşımlar, ama onlar da reveal kök hücrelerin büyüme için yeni olanaklar ortamı veya tümör5modelleri. Farklı malzeme esas olarak jel6gözenek boyutu üzerine bağlıdır özellikleri bir dizi sahip. Gözenekleri hücre kültür uygulamaları, doku Mühendisliği ve kök hücrelerin yönlendirilmiş büyüme çok önemli bir rol oynamaktadır. Örneğin, oksijen ve besin matris ile diffüz ve yeterli miktarda hücreleri7ulaşmak mümkün olması gerekir. Öte yandan, zararlı metabolitleri kısa zamanda kaldırılması ve hücre büyümesi için yeterli alanı7kullanılabilir olması gerekir. Sonuç olarak, malzeme ve böylece gözenek boyutu özelliklerini ciddi potansiyel yararı ve olası uygulamalar Matrix etkisi. Malzeme özellikleri bağlı olarak, farklı hücre büyüme süreçleri nöronal yapıların oluşumu da dahil olmak üzere 3D hücre kültüründe ortaya çıkabilir; büyüme ve farklılaşma deri ya da kemik hücreleri; ve tetkikine veya fibroblastlar2,3,8,9,10,11gibi özel kök hücre satırları yönlendirilmiş büyüme. Başka bir önemli nokta bir malzeme mümkün uygulanması etkileyen istikrarı dış uyaranlara12doğru olduğunu. Örneğin, hidrojel mekanik bütünlüğünü hücre kültür medya veya insan vücudu korumak gerekir.
Son yıllarda yoğun 3D hücre kültür hydrogels üzerinde araştırma ve birçok çalışma sistemleri133D mimarileri çözmek için yapılmıştır. Hydrogels kimyasal olarak sentezlenmiş bileşenlerden oluşur çünkü kolayca sentezlenmiş ve kimyasal olarak değiştirilmiş ve onlar yüksek kararlılık göstermek en yaygın olarak incelenmiştir (bkz: Zhu vd., 2011 için bir daha gözden geçirme)5. Ancak, proteinler birçok yararlı özellikleri var: kadar sözde "hassas polimerler," onlar Biyouyumlu; Onlar tanımlanmış bir uzunluğu var; Onlar değiştirmek nispeten kolaydır; ve onlar-si olmak çok sayıda hedef siteleri14,15. Bu bağlamda, çok özel, yenilikçi yapıları çok alanda uygulama için oluşturulabilir. Bu çalışmada, bir protein bazlı hidrojel16 3D mimari malzeme etkilemek için köklü yöntemlerden yeteneğini göstermek için kullanıldı. Ayrıca, yeteneği ve gözenek üretimi uygulanabilirliği da araştırıldı.
Çok farklı teknikler basit yöntemleri ve malzeme bilimi farklı alanlardan sofistike, alanında son derece uzman teknikleri dahil olmak üzere 3D yapılar değiştirmek kullanılabilir. İyi tanımlanmış yapılar17oluşturmak için electrospinning kullanımı yaygın bir tekniktir. Şarj edilmiş lifler bir çözümden bir elektrik alanı tarafından alınır ve oksijen maruz üzerine kuvvetlendirmek. Bu şekilde, lifleri birkaç nanometre kadar birkaç mikron aralığındaki üretilebilir. Boyutu, yapısı ve gözenekleri matris içinde dağılımını ayarlamak için ek teknikler vardır yumuşak litografi, fotolitografi, hidrodinamik odaklama, elektro-püskürtme ve biyo-baskı18,19,20. Bu tekniklerin önemli bir dezavantajı özel, pahalı ekipman ve özel kimyasallar veya malzeme üzerine kendi bağımlılık olduğunu. Ayrıca, bu teknikleri ile deneyim çoğu zaman doğrudan protein bazlı malzeme için transferrable değildir ve birçok kimyasal madde ve yöntemleri hücre uyumlu değildir.
Öte yandan, birçok teknik yapım onları daha kolay ve ucuz uygulamak için ve yeniden üretmek için özel ekipman güvenmeyin. Yapısı manipülasyon için yaygın bir yöntem solvent döküm21,22,23' tür. Parçacıklar polimerizasyon reaksiyonu önce eklenir ve homojen çözüm emdirmek dağıtılır. Gözenekleri malzeme içinde kalırken polimerizasyon sonra parçacıkların solvasyon bir seyreltme veya bir pH değişikliği gibi koşulları değişimine yol açar. Tuz, şeker, parafin, jelatin ve tebeşir, gibi bu teknikleri kullanılan kimyasalların ucuz ve kullanılabilir durumda. Dağılması, şişmiş hydrogels dondu. Bir vakum altında sıvı aşamadan sonraki süblimasyon ise23,24,25gerçekleştirilen. Su süblimasyon ağdan malzemenin belirli 3D yapıları korumak için nazik. Polimerizasyon gözenekleri jel21içinde bırakarak gerçekleştikten çalışırken köpük gaz, gaz ile bir çözüm akışla gönderilir. Gözenekleri dağılımı ve boyutu gaz akışı bağlı olarak ayarlanabilir.
Protein hidrojel oluşturmak için BSA ile tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC) Birincil aminler ve dört kollu bağlayıcı molekül26hidroksi grupları arasında Kovalent bağlar oluşumu için izin vermek için bir Mannich tipi tepki tepki. Reaksiyon oluştuktan sonra olası zararlı ara malzeme aşırı yıkama tarafından kaldırılır.
Bu çalışmada BSA-esaslı malzeme işlemek ve gözenekleri boyutunu terzi için farklı teknikler ile tedavi olasılığını gösterir. Hiçbir özel ekipman gerekli olduğu gibi tekniklerin herbirini herhangi bir laboratuvar olarak dünya çapında kullanılabilir. Şişme oranı, enzimatik çözünebilirlik, pH istikrar ve sıcaklık hassasiyeti, muayene ve her diğer, karşılaştırıldığında gibi Ayrıca, farklı parametreleri, özellikle farklı teknikleri etkisi için 3D mimarileri nesil üzerinde saygı duyuyorum. Son olarak, malzemeler ile hücre kültürü mümkün uygulamaya malzemelerin araştırmak için hücre yapışkanlı peptidler functionalized. İki farklı model hücre satır kullanılmıştır: A549 ve MCF7.

<table><tbody><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (yüksek glikoz)</td><td>Yaşam Teknolojileri / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri / Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit</td><td>Çözeltisi Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA %0.05 Fenol Kırmızı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %99.8, verg & auml; llt</td><td>&ouml; lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Albümin Fraksiyonu V</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>% 0.1 Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Hafif toksik</td></tr><tr><td>Phalloidin-rhodamine&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>%3,7 Formaldehit&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&mikro; slayt 8 kuyu</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS peptid</td><td>UPEP Ulm</td><td>Özel sistem</td><td></td></tr><tr><td>Etanol% 99.8, verg & auml; llt</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polisteren Yuvarlak Tabanlı Tüp&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler 50 ml&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler 1.5 ml & nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler 2 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>HÜCRE KÜLTÜRÜ MİKROPLAKASI, 96 KUYU, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>Dondurarak Kurutucu Epsilon 1-6D,&nbsp;</td><td>Christ, Osterode Harz, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Yazılım Sürümü 2012 SP1, siyah baskı, 407 sürüm 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analizör Yazılımı, GSA Görüntü Analizörü, GSA, Sürüm 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein bazlı hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels hücre kültür uygulamaları nedeniyle son derece sulu hücre ortamları sağlamak için yeteneklerini için umut verici malzemeler kabul edilmektedir. 3D şablonların alan bu malzemeleri potansiyel benzerliği nedeniyle doğal hücre dışı matriks artıyor. Protein bazlı hydrogels özellikle umut verici, çünkü onlar kolayca functionalized ve ayarlanabilir fizikokimyasal özellikleri ile tanımlanmış yapılar elde edebilirsiniz. Ancak, üretim macroporous 3D şablonların doğal malzemeler kullanarak hücre kültür uygulamalar için genellikle sentetik malzemeler için göre daha zayıf mekanik özellikleri ile sınırlıdır. Burada, farklı yöntemler macroporous sığır serum albumin (BSA) üretmek için değerlendirildi-ayarlanabilir gözenek boyutları 10-70 µm çapındaki yelpazesi ile hidrojel sistemleri dayalı. Ayrıca, birkaç yüz mikron uzun olan bu protein bazlı malzeme kanalları oluşturmak için bir yöntem kuruldu. Gözenekleri gözenek boyutu oranı, pH, sıcaklık kararlılığı ve enzimatik bozulması davranış, şişme gibi malzeme özellikleri üzerinde etkisi üretmek için farklı yöntemler analiz edildi. Gözenek boyutları confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak hydrogels yerli, şişmiş durumda araştırıldı. Hücre kültür uygulamaları için fizibilite bir hücre yapışkanlı RGD peptid değiştirme-in protein sistemi ve iki modeli hücre satırları kullanarak değerlendirildi: insan meme kanseri hücreleri (A549) ve adenocarcinomic insan alveoler Bazal epitelyal hücreler (MCF7).

Hidrojel geliştirme, bilimsel araştırma arşivlerinde indekslenmiş binlerce kayıtla birlikte, malzeme araştırmalarıyla ilgili biyolojik çalışmaların en öne çıkan alanlarından biri haline gelmiştir. Birçok sistemin davranışı iyi çalışılmış olsa da, özellikle hassas protein bazlı malzemelerin 3B ağlarının manipülasyonu, malzeme biliminde genellikle temel bir sorundur. Yaygın olarak küçümsenen bir diğer zorluk ise, kriyoelektron mikroskopisi kullanılarak bir malzemenin doğal yapısının doğru ş...

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Bu metodolojinin genel amacı, hücre kültürü uygulamaları için değişken gözenek boyutlarına sahip makrogözenekli hidrojeller oluşturmaktır. Bu yöntem, yeni bir hidrojel materyalinin 3B hücre kültürü uygulamaları için temel fizibilitesi gibi, 3B hücre kültürü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu metodolojinin temel avantajı, yeni bir materyali farklı hücre tipi gereksinimlerine göre optimize etmek ve ayarlamak için bir dizi teknik sunmasıdır.Başlamak için, 10 mg/mL çözelti elde etmek amacıyla bir miligram RGD peptidini veya eşdeğer bir hücre yapışkan peptidini 100 µL steril su içerisinde seyreltin. Ardından, 96 kuyucuklu plakanın alt kısmını çıkarın ve yerine çıkarılabilir plastik film yerleştirin. 200 µL hidrojel elde etmek için 96 kuyucuklu plakada 100 µL BSA stok çözeltisi ile 100 µL THPC stok çözeltisini karıştırın.Polimerizasyon sonrası homojen bir hidrojel elde etmek için bileşenleri pipetle en az beş kez aşağı yukarı çekerek karıştırın. Tüm hidrojeller uygun şekilde polimerleşene kadar 96 kuyucuklu plakayı yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Polimerizasyonun ardından, plağın altındaki plastik örtüyü dikkatlice ve yavaşça kaldırın.Küçük bir çubuk kullanarak hidrojelleri 96 kuyucuklu plakadan çıkarın ve steril PBS pH 7.4 içeren 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Hidrojelleri fosfat tamponlu salin içerisinde dört derece santigrat sıcaklıkta birkaç aya kadar saklayın. Hidrojelleri dondurarak kurutmak için öncelikle 1,5 mililitrelik tüpleri 500 mikrolitre steril deiyonize su ile doldurun ve kapaklarını çıkarın.Hidrojelleri pens kullanarak 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın. 1,5 mililitrelik tüplerin her birini, en az üç kat olacak şekilde parafilm ile sıkıca sarın. Tüplerden gaz çıkışını sağlamak için film üzerinde bir iğne yardımıyla küçük delikler açın.Suyun ve hidrojelin tamamen donmasını sağlamak için tüpü beş dakika boyunca sıvı azot çözeltisine yerleştirin. Malzemenin çözünmesini önlemek için tüpleri sıvı azottan çıkardıktan hemen sonra liyofilizatöre aktarın. Alternatif bir dondurma adımı olarak, hidrojellerin yavaşça donması için tüpleri gece boyunca -20 °C'de bekletin.-20 °C'den çıkarıldıktan hemen sonra, materyalin çözülmesini önlemek için tüpleri liyofilize cihazına aktarın. 24 saat sonra ve hidrojelin içindeki ve etrafındaki suyun tamamen buharlaşmasının ardından, materyali liyofilize cihazından çıkararak çözdürün. Partikül sızıntısı (leaching) için hidrojel bileşenlerini daha önce olduğu gibi karıştırın.Karıştırma işlemini takiben, doygunluk gerçekleşene kadar derhal sodyum klorür ekleyin. Çözeltide beyaz bir çökelek şeklinde tuz kristalleri görülene kadar tuz eklemeye devam edin. Gözenek boyutları, kullanım öncesinde tuz kristallerinin öğütülmesiyle değiştirilebilir.96 kuyucuklu plakayı bir çalkalayıcıya aktarın ve polimerizasyon gerçekleşene kadar çalkalayın. Yaklaşık 10 dakika sonra, hidrojelleri daha önce yapıldığı gibi plakadan çıkarın. Hidrojel şablonundaki tüm tuzun elüe edilmesi için hidrojelleri, bir rotatör üzerinde, steril su içerisinde oda sıcaklığında en az 24 saat inkübe edin.Hidrojelleri PBS içinde dört °C'de birkaç aya kadar saklayın. Nazik oluşum için hidrojelleri tarif edildiği şekilde hazırlayın. Ardından, bir pens yardımıyla çözeltiden bir hidrojeli çıkarın.Fazla suyu yüksek emici bir kağıtla alın ve hidrojeli bir kuru buz bloğunun üzerine yerleştirin. Hidrojeli 30 saniye boyunca dondurun ve ardından bloktan dikkatlice çıkarın. Hidrojele zarar vermeyin.Bloktan sıyırmak için dikkatlice bir spatula kullanın. Hidrojeli 1,5 milliliter'lik bir tüpe aktarın ve 37 degrees Celsius'ta gece boyunca kurutun. Metin protokolünde açıklandığı gibi bir Rhodamine B stok çözeltisi ve seri dilüsyonlar hazırlayın.Hidrojeli saklama çözeltisinden çıkarın ve 1 ml 0,01 mg/mL Rhodamine B çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hidrojeli oda sıcaklığında, Rhodamine B çözeltisi içinde gece boyunca boyayın. Ertesi gün, görüntüleme yapılacak olan hidrojeli 10 ml PBS'ye aktarın ve en az üç saat boyunca yıkayın.Bir bıçak kullanarak hidrojelden küçük dilimler kesin. Ardından hidrojeli sekiz kuyucuklu mikroskobik bir lama aktarın ve üzerini PBS ile kapatın. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak hidrojelini 514 nanometre dalga boyunda görüntüleyin.Tüm stok çözeltileri 0,45 mikronluk bir filtre ile steril filtreden geçirin. Hidrojel hazırlığına başlayın ve hidrojel polimerizasyonundan önce hücre yapışkan peptidi ekleyin. Bileşenleri karıştırdıktan sonra, karışımı taban tamamen kaplanana kadar hemen sekiz kuyucuklu mikroskobik lama pipetleyin.Hücreleri; fetal bovine serum, penisilin streptomisin ve esansiyel olmayan amino asit çözeltisi ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış steril DMEM hücre kültürü ortamına aktarın. Hücreleri bir Neubauer sayım odası ile saydıktan sonra, istenilen sayıdaki hücreden 200 microliters miktarını dikkatlice pipetle hidrojel yüzeyine ekleyin. Sekiz kuyucuklu mikroskobik lamı bir kapakla kapatın ve inkübatöre yerleştirin.Hücrelerin en az dört saat boyunca tutunmasının ardından, hücreleri 200 µL steril hücre kültürü PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 µL %3,7 formaldehit ile sabitleyin ve PBS ile iki kez yıkayın. PBS ile tekrar iki kez yıkamadan önce, hücreleri 200 µL %0,1 Triton X ile beş dakika boyunca permeabilize edin.Beş µL metanolik stok çözeltiyi 195 µL PBS ile karıştırıp hücrelere oda sıcaklığında ekleyerek hücreleri Toluidine Rhodamine ile boyayın. Hücreleri, PBS ile iki kez yıkamadan önce karanlıkta 20 dakika boyunca boyayın. Hücre yapışma özelliklerini 514 nm'de konfokal mikroskop kullanarak inceleyin.Hidrojel özelliklerini metin protokolünde açıklandığı şekilde analiz edin. Burada gösterildiği gibi, polimerize edilmiş ve boyanmış hidrojeller belirgin mimarilere sahip değildir. Hidrojeller farklı sıcaklıklarda dondurularak kurutulduktan sonra, hidrojel içindeki gözeneklerin ortalama boyutu 60 mikrona kadar genişletilebilir.Tuz liçleme, yaklaşık 10 mikron gözenek boyutuna sahip üniform ağlar ile sonuçlanır. Boyut, tuz kristallerinin kullanım öncesinde öğütülmesiyle daha da ayarlanabilir. Kuru buz bloğu üzerinde gradyan dondurma yaklaşımının kullanılması, çapı yaklaşık 20 mikron ve uzunluğu birkaç yüz mikron olan kanalların oluşumuna yol açar.Hücre yapıştırıcı grup ile fonksiyonelleştirilmeden önce hücreler, hidrojelin yüzeyine tutunamazlar ve yuvarlak bir morfoloji sergilerler. Ancak materyale hücre yapıştırıcı peptid sağlandıktan sonra hücreler, hücrenin bir materyal üzerine uygun şekilde tutunmasını sağlayan fokal yapışma noktaları bulurlar. Bu durum, yeni materyallerin 3D hücre kültürü uygulamalarında kullanımı için kritik öneme sahiptir.Bu videoyu izledikten sonra, bir hidrojelin mimarisinin basit yöntemlerle nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, hücre kültüründeki kullanımını öğrenmek ve hidrojelin mimarisini hedeflenen kullanıma göre optimize etmek için çoğu yeni hidrojel sistemine uygulanabilir.

easy-manipulation-architectures-protein-based-hydrogels-for-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve...

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Üç boyutlu hücre kültürü uygulamaları için sentetik hidrojel matrislerinin ışık aracılı oluşumu ve ardından biyokimyasal modellemesi için sıralı bir süreci tanımlıyoruz. Hidrojellerin sitouyumlu fototıklama kimyası ile yapımı ve modifikasyonu gösterilmiştir. Ek olarak, bu hidrojeller içindeki kalıpları ölçmek ve gözlemlemek ve hücre canlılığını belirlemek için basit teknikler sunulmaktadır.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Keşfedin, protein bazlı hidrojellerin üç boyutlu mimarisini hücre kültürü uygulamaları için nasıl optimize edeceğinizi. Bu yöntem, farklı hücre tiplerine göre malzeme özelliklerini ayarlamanıza olanak tanır.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Daha fazla video keşfet