Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Bu metodolojinin genel amacı, hücre kültürü uygulamaları için değişen gözenek boyutlarına sahip makro gözenekli hidrojeller oluşturmaktır. Bu yöntem, 3D hücre kültürü uygulamaları için yeni bir hidrojel malzemesinin prensip fizibilitesi gibi 3D hücre kültürü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu metodolojinin temel avantajı, yeni bir materyali farklı hücre türlerinin gereksinimlerine göre optimize etmek ve ayarlamak için bir dizi teknik sunmasıdır.

Başlamak için, mililitre başına 10 miligram çözelti elde etmek için bir miligram RGD peptidini veya eşdeğer bir hücre yapışkan peptidini 100 mikrolitre steril su içinde seyreltin. Ardından, 96 oyuklu bir plakanın altını çıkarın ve çıkarılabilir plastik sargı ile değiştirin. 200 mikrolitre hidrojel elde etmek için 100 mikrolitre BSA stok çözeltisi ve 100 mikrolitre THPC stok çözeltisini 96 oyuklu plakada karıştırın.

Polimerizasyondan sonra homojen bir hidrojel elde etmek için bileşenleri en az beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 96 oyuklu plakayı, tüm hidrojeller uygun şekilde polimerize olana kadar yaklaşık 10 dakika oda sıcaklığında yerleştirin. Polimerizasyonun ardından, plastik sargıyı plakanın altından dikkatlice ve yavaşça çıkarın.

Küçük bir bıçak kullanarak hidrojelleri 96 oyuklu plakadan dışarı bastırın ve steril PBS pH 7.4 olan 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Hidrojelleri fosfat tamponlu tuzlu suda dört santigrat derecede birkaç aya kadar saklayın. Hidrojelleri dondurarak kurutmak için önce 1,5 mililitrelik tüpleri 500 mikrolitre steril deiyonize su ile doldurun ve kapakları çıkarın.

Hidrojelleri forseps kullanarak 1.5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın. 1.5 mililitrelik tüpleri, her şişe için en az üç katman kullanarak parafin film ile sıkıca sarın. Tüplerden gaz tahliyesini sağlamak için filmdeki küçük delikleri delmek için bir iğne kullanın.

Suyun ve hidrojelin tamamen donmasını sağlamak için, şişeyi beş dakika boyunca sıvı nitrojen çözeltisine aktarın. Sıvı nitrojenden çıkardıktan hemen sonra, malzemenin çözülmesini önlemek için şişeleri dondurarak kurutucuya aktarın. Alternatif bir dondurma adımı olarak, hidrojelleri yavaşça dondurmak için şişeleri gece boyunca eksi 20 santigrat derecede tutun.

Eksi 20 santigrat dereceden çıkarıldıktan hemen sonra, malzemenin çözülmesini önlemek için şişeleri dondurarak kurutucuya aktarın. 24 saat sonra ve hidrojelin içindeki ve etrafındaki suyun tamamen buharlaşmasından sonra, malzemeyi dondurarak kurutucudan çıkararak çözün. Partikül liçi için, hidrojelin bileşenlerini daha önce olduğu gibi karıştırın.

Karıştırdıktan sonra, doygunluk oluşana kadar hemen sodyum klorür ekleyin. Çözeltide beyaz bir çökelti olarak tuz kristalleri görülene kadar tuz ekleyin. Gözenek boyutları, kullanımdan önce tuz kristallerinin öğütülmesiyle değiştirilebilir.

96 oyuklu plakayı bir çalkalayıcıya aktarın ve polimerizasyon gerçekleşene kadar çalkalayın. Yaklaşık 10 dakika sonra, hidrojelleri daha önce olduğu gibi plakadan çıkarın. Hidrojelleri, hidrojel şablonundan tüm tuzu çıkarmak için bir döndürücü üzerinde steril suda oda sıcaklığında en az 24 saat inkübe edin.

Hidrojelleri PBS'de dört santigrat derecede birkaç aya kadar saklayın. Nazik oluşum için, hidrojelleri tarif edildiği gibi hazırlayın. Daha sonra bir kıskaç kullanarak bir hidrojeli çözeltiden çıkarın.

Fazla suyu yüksek emici kağıtla alın ve bir kuru buz bloğunun üzerine yerleştirin. Hidrojeli 30 saniye dondurun ve dikkatlice bloktan çıkarın. Hidrojele zarar vermeyin.

Bloktan kazımak için dikkatlice bir spatula kullanın. Hidrojeli 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede kurutun. Metin protokolünde açıklandığı gibi bir Rhodamine B stok çözeltisinin yanı sıra seri seyreltmeler hazırlayın.

Hidrojeli depolanan çözeltiden çıkarın ve mililitre Rhodamine B çözeltisi başına bir mililitre 0.01 miligram olan 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hidrojeli gece boyunca oda sıcaklığında Rhodamine B çözeltisinde boyayın. Ertesi gün, görüntülenecek hidrojeli 10 mililitre PBS'ye aktarın ve en az üç saat yıkayın.

Bir bıçak kullanarak hidrojelden küçük dilimler kesin. Daha sonra hidrojeli sekiz kuyulu mikroskobik bir slayta aktarın ve PBS ile örtün. Konfokal bir lazer tarama mikroskobu kullanarak, hidrojeli 514 nanometre dalga boyunda görselleştirin.

0,45 mikron filtre ile tüm stok solüsyonlarını steril filtreleyin. Hidrojelin hazırlanmasına başlayın ve hidrojel polimerizasyonundan önce hücre yapışkan peptidini dahil edin. Bileşenleri karıştırdıktan sonra, karışımı hemen alt kısım tamamen kaplanana kadar sekiz kuyulu mikroskobik bir slayta pipetleyin.

Hücreleri, fetal sığır serumu, penisilin streptomisin ve esansiyel olmayan amino asit çözeltisi ile desteklenmiş önceden ısıtılmış steril DMEM hücre kültürü ortamına aktarın. Neubauer sayım haznesi ile hücreleri saydıktan sonra, istenen sayıda hücreden 200 mikrolitre dikkatlice hidrojel yüzeyine pipetleyin. Sekiz kuyulu mikroskobik slaytı bir kapakla örtün ve bir inkübatöre aktarın.

En az dört saatlik hücresel bağlanmadan sonra, hücreleri 200 mikrolitre steril hücre kültürü PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 mikrolitre% 3.7 formaldehit ile sabitleyin ve PBS ile iki kez yıkayın. PBS ile iki kez daha yıkamadan önce hücreleri 200 mikrolitre% 0.1 Triton X ile beş dakika boyunca geçirgen hale getirin.

Beş mikrolitre metanolik stoğu 195 mikrolitre PBS ile karıştırarak ve oda sıcaklığında hücrelere ekleyerek hücreleri Toluidin Rhodamine ile boyayın. PBS ile iki kez yıkamadan önce hücreleri karanlıkta 20 dakika boyayın. 514 nanometrede konfokal bir mikroskop kullanarak hücre yapışma özelliklerini araştırın.

Hidrojel özelliklerini metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Burada gösterildiği gibi, polimerize ve lekeli hidrojellerin ayırt edici mimarileri yoktur. Hidrojeller farklı sıcaklıklarda dondurularak kurutulduktan sonra, hidrojel içindeki gözeneklerin ortalama boyutu 60 mikrona kadar uzatılabilir.

Tuz liçi, yaklaşık 10 mikron gözenek boyutlarına sahip tek tip ağlarla sonuçlanır. Boyut, kullanımdan önce tuz kristallerinin öğütülmesiyle daha da ayarlanabilir. Bir kuru buz bloğu üzerinde gradyan dondurma yaklaşımının kullanılması, yaklaşık 20 mikron çapında ve birkaç yüz mikron uzunluğunda kanalların oluşumuna yol açar.

Hücre yapışkan parçası ile işlevselleştirmeden önce, hücreler hidrojelin yüzeyine yapışamaz ve yuvarlak bir morfoloji gösteremez. Sadece malzemeye hücre yapışkan peptit sağlandıktan sonra, hücreler, hücrenin bir malzemeye uygun şekilde yapışmasını sağlayan fokal yapışma noktalarını bulur. Bu, 3D hücre kültürü uygulamalarında yeni malzemelerin kullanımı için çok önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir hidrojelin mimarisini basit yöntemlerle nasıl manipüle edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu yöntem, hücre kültüründeki kullanım hakkında bilgi edinmek ve amaçlanan kullanıma bağlı olarak hidrojelin mimarisini optimize etmek için çoğu yeni hidrojel sistemi için uygulanabilir.