Görüntü Analizi için Saat Tarama Protokolü: ImageJ Eklentileri

Bu saat tarama protokollerinin genel amacı, seçilen ilgi alanlarının içindeki, sınırları boyunca ve/veya dışındaki ortalama piksel yoğunluğunun hızlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve görüntü analistlerine belirli ilgi alanları içindeki ortalama piksel yoğunluğu hakkında bilgi verebilir. Buradaki saat tarama tekniğinin temel avantajları, yörüngedeki tek veya birden fazla ilgi alanından ortalama piksel yoğunluğunu hızlıca karakterize etmek için kullanılabilmesidir.

Standart saat tarama analizi için, uygun ImageJ programındaki Dosya menüsü altından Aç seçeneğini belirleyerek ilgilenilen görüntü dosyasını açın. Örneğin burada, ilgilenilen bir protein için işaretlenmiş nöronlar içeren bir doku kesiti analiz edilecektir. Uygun bir çizim aracını seçin ve ilgi bölgesinin ana hattını belirleyin.

Standart saat tarama protokolü açılır seçenek penceresini açmak için Dosya menüsünden Plugin'ler ve Clock Scan'i seçin. Taslağı otomatik olarak eklenmiş olan ilgi alanı yöneticisi penceresi de açılacaktır. Plugin seçenek penceresinde, uygun şekilde ilgi alanının merkezindeki x ve y koordinatlarını değiştirmek için kaydırma çubuklarını kullanın.

Nesnenin dışındaki arka plan bölgesinin ne kadarının tarama tarafından kapsanması gerektiğine bağlı olarak, tarama sınırlarını ayarlamak için tarama sınırı kaydırma çubuğunu kullanın. Deneysel olarak uygun şekilde gerçek yarıçap, arka planı çıkar, polar dönüşüm ve/veya standart sapma ile çizdir onay kutularını seçin. Ardından, eklentiyi çalıştırmak için Tamam'a tıklayın.

Analiz tamamlandığında, daha ileri analizler için sayısal verilere erişmek üzere list komutunu kullanın. Birden fazla bölgenin saat taraması analizi için, birden fazla ilgi alanı içeren bir görüntü dosyası açın. Örneğin burada, az önce gösterildiği gibi, aynı doku kesiti içinde yakalanmış bir çerçeve paneli analiz edilecektir.

Analyze, ardından Tools ve daha sonra Region of Interest Manager'a tıklayın ve her bir ilgi bölgesini belirlemek için uygun çizim aracını kullanın. Segmented line tool, asimetrik ilgi bölgelerini seçmek ve arka plan etiketlemelerini hariç tutmak için kullanışlıdır. Seçilen her bir ilgi bölgesini yöneticiye eklemek için Region of Interest Manager penceresindeki Add düğmesine tıklayın.

Eklentiler menüsünden, protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için Multi Clock Scan'i seçin ve gerekirse tarama sınırını sıfırlayın. Deneysel olarak uygunsa, standart sapma ile grafiği kontrol edin ve/veya arka planı çıkar kutucuklarını işaretleyin. Ardından, iki çıktı grafik penceresi oluşturacak olan protokolü çalıştırmak için Tamam'a tıklayın.

Bir görüntü yığınının saat taraması analizi için, ilgili görüntü yığınını açın. Burada, hücre içi elektrot stimülasyonu öncesi ve sonrası görüntülenen, kalsiyuma duyarlı floresan ile işaretlenmiş izole bir dorsal kök ganglionuna ait görüntü yığını analiz edilecektir. Görüntü yığını içindeki ilgi bölgesini ana hatlarıyla belirleyin.

Az önce gösterildiği gibi, seçilen görüntü yığınını ilgi alanı yöneticisine ekleyin ve protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için Multi Clock Scan'i seçin. Gerektiğinde tarama sınırını sıfırlayın ve deneysel olarak uygunsa standart sapmalı grafiği ve/veya arka plan çıkarma kutucuklarını işaretleyin. Ardından, protokolü çalıştırmak için Tamam'a tıklayarak iki çıktı grafik penceresi oluşturun.

Floresanla işaretlenmiş nöronların bir doku kesitinin bu temsili analizinde, ilgilenilen proteine ait parlak sinyal üzerinden bir ilgi bölgesi (ROI) çizilmiş ve ilgi bölgesinin merkezinden belirlenen tarama sınırına kadar radyal piksel yoğunluğu taramaları toplamak için standart bir saat yönlü tarama analizi gerçekleştirilmiştir. Radyal taramalar, tarama yönündeki ilgi bölgesi yarıçapına göre normalize edilmiştir. İntegral bir radyo piksel yoğunluk profili oluşturmak için alınan ortalama, ilgilenilen proteinin çoğunluğunun hücrenin plazma membranında ölçüldüğünü ortaya koymuştur.

Bu analiz için standart sapmalı grafik seçildiğinden, dikey standart sapma çizgileri, tarama başlangıcından belirli bir mesafedeki bireysel radyal tarama profillerinin piksel yoğunlukları arasındaki farkı göstermiştir. Bu analizde, az önce gösterildiği gibi, nöron doku örneği içindeki birden fazla ilgi alanı taranmış ve ilgi alanı yöneticisine eklendikleri sırayla, taranan her bir nesne için integral bir piksel yoğunluk profili oluşturulmuştur. Ayrıca, seçilen her bir ilgi alanı için ortalama bir piksel yoğunluk profili elde edilmiştir.

Bu nedenle, bu standart sapma çubukları, bireysel radyal taramalardan ziyade, bireysel nesnelerin integral taramaları arasındaki değişkenliği temsil etmektedir. Burada, hücre içi elektrot aracılığıyla stimülasyondan önce ve sonra, farklı zamanlarda görüntülenen izole bir dorsal kök ganglion nöronunun görüntü yığını analizi gerçekleştirilmiştir. Analizin sonunda, yığındaki farklı görüntülerde yer alan ilgi odağı nesnenin bireysel örneklerine ait bir integral piksel yoğunluk profili ve nesnenin tüm örnekleri için ortalama bir piksel yoğunluk profili görüntülenmiştir.

Ayrıca, bir saat tarama (clock scan) görüntü yığınına uygulanan standart sapma analizi, görüntü yığını boyunca gerçekleştirilen integral taramalar arasındaki veri değişkenliğini ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, saat tarama eklentilerini kullanarak piksel yoğunluklarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu eklentileri geliştirme amacımız, bu tür görüntü analizlerini her araştırmacı için ücretsiz olarak erişilebilir kılmaktı.

Saat tarama protokolünün, biyolojik, kimyasal ve fiziksel görüntüleme uygulamaları da dahil olmak ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, birçok araştırma alanında kullanılacağına inanıyoruz. Bu saat tarama eklentilerini geliştirmeye ve işletmeye devam ederken, ilgili taraflardan bu araçların nasıl iyileştirilebileceğine dair her türlü geri bildirimi ve öneriyi memnuniyetle karşılarız.