Name: Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Öğrenin, erken endozomlardan F-aktin polimerizasyonunu in vitro mikroskopi bazlı analizle nasıl çalışılacağını. Bu yöntem, HeLa hücreleri kullanarak aktin dinamiklerini ve membran trafiklemesini araştırmak için değerli bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Destek İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan aldığı; İsviçre Sinergia programı; Lehçe-İsviçre araştırma programı (2010/PSPB-094); NCCR Kimya Biyoloji; ve LipidX İsviçre SystemsX.ch girişimi üzerinden değerlendirilir (J. G. için) İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından. O. M. bir EMBO uzun vadeli Bursu (ALTF-516-2012) tarafından desteklenmiştir.

1. çözümleri ve ürünleri Not: tüm arabellekleri ve çözümleri (dd) H çift distile 2 ' O. hazırlanmalıdır Sükroz hidrasyon durumu değiştiğinden, tüm Sükroz çözümler son konsantrasyonu bir Refraktometre kullanarak belirlenmelidir.
<ol><li>Hazırla fosfat tamponlu tuz olmadan divalent katyonlar (PBS-): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 ve 6.5 mM Na 2 HPO 4. PH 7.4 için ayarlayın. Isıyla (15dk için 121 ° C'de 1 dönüşü) tarafından sterilize ve mağaza oda sıcaklığında.</li>
	<li>300 mM imidazole stok çözeltisi hazırlamak: 0,204 g imidazole GKD 2 pH 7.4 HCl. filtre sterilize-0.22 mikron kullanarak kullanarak 4 ° C'de için boyut filtresi gözenek ve depolamak saat 4'te O.Adjust 10 ml ° C.</li>
	<li>Hazırlama homojenizasyon arabellek (HB; yaklaşık 100 mL hazırlamak): 250 mM Sükroz 3 mM imidazole içinde. PH 7.4 pH-metre kullanarak 4 ° C'de için ayarlayın. 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize ve depolamak saat 4'te ° C. tamamlayıcı HB kullanmadan önce proteaz inhibitörleri 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A ve 10 ng/mL aprotinin karşılık gelen son konsantrasyonlarda bir kokteylle.</li>
	<li>Adım flotasyon degradeler için %62, % 39 ve 3 mM imidazole, pH 7.4, % 35 Sükroz çözümleri aşağıda açıklandığı gibi hazırlamak. Tam bir Refraktometre kullanarak tüm Sükroz çözümler son konsantrasyonu belirlemek.
	<ol><li>3 mM imidazole, pH %7,4 62 Sükroz çözümde hazırlamak 100 mL. Erime 80,4 g Sükroz GKD 2 içinde O karıştırma tarafından önceden ısındı 35 ° C. Ekle 1 ml 300 mM imidazole hisse senedi çözüm ve dolgu GKD 2 O. ayarlama ile 100 ml pH 7.4 için saat 4'te ° C. filtre sterilize etmek-bir 0,22 mikron gözenek boyutu filtre ve mağaza kullanarak 4 ° C'de</li>
		<li>100 mL % 35 Sükroz çözeltisi içinde 3 mM imidazole, pH 7.4 hazırlayın. 300 mM imidazole hisse senedi çözüm GKD 2 O. eklemek 1 ml sukroz 40,6 g karıştırma tarafından dağıtılması ve GKD 2 O. ayarlama ile 100 ml pH 4 ° C. filtre sterilize kullanarak 0,22 mikron gözenek boyutu filtre ve depolamak saat 4'te 7.4 için doldurmak ° C.</li>
		<li>50 mL 3 mM imidazole, pH %7,4 39 Sükroz hazırlayın. % 35 Sükroz çözüm % 62 Sükroz Çözümle sulandırmak. Mağaza 4 ° C'de</li>
	</ol></li> <li>Dropwise 1 M NaOH ekleme süre karıştırma 100 ml PBS-ön warmed 60 ° c tarafından 3 g-in paraformaldehyde (PFA) dağıtılması; son pH 7.4 NaOH kullanarak için ayarlayın. 0,22-mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize ve depolamak -20 ° c 
	Dikkat: %3 PFA olan toksik bir reaktif.</li>
	<li>1 M KCl hazırlamak hisse senedi çözüm. 50 ml GKD 2 O. filtre sterilize-0,22-mikron gözenek boyutu filtre karıştırma tarafından KCl 3.73 g dağıtılması ve mağaza oda sıcaklığında.</li>
	<li>-20, pH 7,0 ve 75 mm MgOAc 2 GKD 2 O. Aliquot ve store 0.625 M Hepes içeren konsantre hazırla 50 X hisse senedi çözüm ° C.</li>
	<li>Hazırlık montaj orta. Poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) 2.4 g 6 g gliserol ile karıştırma karıştırın. GKD 2 O 6 mL ekleyin ve oda sıcaklığında en az 2 h için bırakın. 12 0.2 mL ekleyin M Tris-Cl (pH 8,5) ve ısı yaklaşık 53 ° PVA eriyene kadar ara sıra karıştırarak ile c.</li>
	<li>Tarafından Santrifüjü 5000 x g oda sıcaklığında 20 dakika için de çözüm açıklamak. Süpernatant toplamak ve % 2.5 (w/v) 1,4 eklemek - diazabicyclo-[2.2.2] oktan photobleaching floresan algılama sırasında önlemek için (DABCO). Yaklaşık 30 için girdap çözülmeye s. Aliquot 1.5 mL plastik tüpler ve mağaza -20 ° c</li>
</ol> 2. Hücre kültür <ol><li>Dulbecco kültür HeLa hücreleri &#39; s % 10 fetal buzağı serum ile % 10 esansiyel olmayan amino asitler, takıma modifiye kartal orta %10 L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin. %5 CO 2 kuluçka 37 ° C'de proje.</li>
	<li>Hücreleri ile ticari transfection reaktif üreticiye göre kullanarak GFP-RAB5 10 deneme önce 24 h transfect &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Gerektiğinde, endosomal kesirler ve faiz (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) ve/veya wildtype ya da mutant formu protein ilgi overexpressing bir protein tükenmiş hücrelerden sitozol hazırlayın.</li>
</ol> 3. Endosomal kesir hazırlık Not: endosomes ve diğer hafif membranlar içeren hücre altı fraksiyonları basit hazırlanması bu protokolünü açıklar. Gerekirse, saf endosome kesirler de kullanılan 11 olabilir. Konfluent hücre GFP-RAB5 malzeme başlangıç olarak ifade 2 Petri yemekler (10 cm dış çap; 57 cm 2) hazırlayın. 2 Petri yemeklerinde Konfluent HeLa hücreleri toplam sayısı yaklaşık 2.5 x 10 7 hücreleri karşılık gelir. Ne zaman endosomes de hazırlıklı bir protein (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) faiz ve/veya wildtype ya da mutant formu faiz protein overexpressing, her zaman GFP-RAB5 ifade tükenmiş hücrelerden.
 dikkat: Ayırma Protokolü'nün tüm merdiven-meli var olmak kılınmak buz üzerinde
<ol><li>İçinde düz bir buz kovası Petri yemekler ıslak bir metal plaka üzerine yerleştirin ve hemen buz gibi PBS - 5 mL iki kez hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Tüm PBS - son yıkama servisinden kaldırın ve buz gibi PBS-çanak başına 3 mL ekleyin. Hücreleri değil işleme sırasında kuru: gerekirse, yeterli sıvı içeren hücreleri kapsayacak şekilde sallanan bir platform üzerinde buz kovası yerleştirin.</li>
	<li>Mekanik PBS Petri yemekler bir esnek kauçuk polis (Yani, ev yapımı hücre kazıyıcı) kullanarak hücreleri kaldırın. Hücreleri bulaşıkları dışına ilk yemeğin ortasında aşağı doğru bir hareket ardından yemeğin dışında etrafında hızlı, dairesel bir hareketle kazı. Yavaşça elde etmek için yara &#34; çarşaf &#34; bağlı hücre. Yavaşça buz üzerinde 15 mL konik polipropilen boru için geniş bir açılış ile bir plastik Pasteur pipet kullanarak hücreleri transferi</li>
	<li>175 x g de 5 dk santrifüj ve 4 ° c</li>
	<li>Yavaşça süpernatant (SN) kaldırın ve HB 1-3 mL Pelet için ekleyin. Bir plastik Pasteur pipet geniş bir açılış ile kullanarak yavaşça pipet yukarı ve aşağı bir kez hücreleri resuspend için.</li>
	<li>1,355 x g ve 4 ° C. yavaşça kaldır SN, 7-10 dk santrifüj.</li>
	<li>Hücre homojenizasyon gerçekleştirmek. 
	Not: Koşullar böylece hücrelerin plazma zarı koptu ama endosomes korunacak nazik olmalıdır.
	<ol><li>Ekle HB birimi her hücre Pelet (hücre Pelet başına yaklaşık 100 μL) üzerine proteaz inhibitörleri ile bilinen bir. Hücreleri resuspended kadar 1.000-µL micropipette kullanarak, yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Yapma Hava kabarcıkları tanıtmak.</li>
		<li>1 mL tüberkülin şırınga 22 G iğne ile önceden HB ile durulanır ve hava veya bubbles ücretsiz hazırlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ile nispeten yavaş yavaş (Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmak için) şırıngaya doldur, eğimli tüp duvara iğne ucu yerleştirin ve hızla ekli hücreler plazma zarı yamultmak için hücre süspansiyon sınırdışı.</li>
		<li>Homogenate (yaklaşık 3 µL) küçük bir aliquot al ve HB 50 µL bir cam slayt üzerinde içine oranında seyreltin. Mix ve bir cam coverslip ile kaplayın. Homogenate X 20 veya 40 X amacı ile donatılmış bir faz kontrast mikroskop altında incelemek. 
		Not: optimum koşullar altında en hücreleri kırık, ama koyu gri görünür ve yapıları turu, çekirdek değildir ( şekil 1).</li>
		<li>Tekrarlama adım 3.7.3 ve 3.7.4 en hücreleri kadar kırık; genellikle, iğne ile 3-6 alçalarak vuruş gereklidir. Homogenate protein tayini için küçük bir aliquot (10-30 µL) devam.</li>
	</ol></li> <li>1,355 g x ve 4 7 dk santrifüj homogenate ° C. 
	Not: Santrifüjü sonra Pelet (tanımlı nükleer Pelet; Çekirdekleri ve (postnuclear süpernatant; tanımlanan süpernatant NP) içerir PNS) içeren sitozol ve üzerine homojenizasyon ve ücretsiz süspansiyon piyasaya organelleri.</li>
	<li>Dikkatle PNS toplamak. Protein tayini için PNS ve NP küçük aliquots (10-30 µL) tutmak ve NP atın.</li>
	<li>PNS:62% Sükroz 1:1.1 oranını kullanarak PNS ile % 62 Sükroz çözüm sulandrarak PNS %40.6 Sükroz için ayarlayın. Yavaşça ama iyice, hava kabarcıkları oluşturmadan karıştırın. Refraktometre kullanarak Sükroz konsantrasyonu kontrol.</li>
	<li>PNS %40.6 Sükroz ultrasantrifüj tüp alt yerleştirin. Yerleşimi dikkatle 2.5 mL % 35 Sükroz çözeltisi ve santrifüj tüpü ile HB doldurun. 
	Not: arabirimleri açıkça görünecek şekilde Sükroz çözümleri katmanlı.</li>
	<li>Ultracentrifuge ̴165, 000 x g ve 4 1 h için degradeleri ° C.</li>
	<li>Lipidler geçişin üstüne beyaz tabakası dikkatli bir şekilde çıkarın. Ardından, endosomes, sert kapak Ciltli ve % 35 sukroz, 200 μL micropipette ile kesilmiş bir ucu kullanarak arasında içeren arabirim toplamak. 
	Not: Endosomal kesirleri doğrudan vitro aktin polimerizasyon assay olarak kullanılabilir veya buz, flash-sıvı azot içinde donmuş bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.</li>
	<li>PNS ve endosomal kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 
	Not: Bu konsantrasyon en az 100 µg/mL olması gerekir. Yaklaşık 2.5 x 10 7 hücreleri 2 Petri yemeklerinde yetiştirilen bir PNS en az 100 µg/mL ile elde etmek için ihtiyaç vardır (yukarıdaki nota bakın).</li>
</ol> 4. Sitozol hazırlık Not: malzeme başlangıç olarak Konfluent HeLa hücrelerin hazırlamak 2 Petri yemekler (10 cm çapında; 57 cm 2). Gerektiğinde, sitozol faiz (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) ve/veya wildtype veya ilgi proteinin mutant formu overexpressing bir protein tükenmiş hücrelerden de hazırlanabilir. Endosome Ayırma Protokolü gelince, tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirilmesi gereken
<ol><li>3.1-3,8 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Bir santrifüj tüpü ve ultracentrifuge için ̴250, 000 x g ve 4, 45 dk PNS yeri ° C.</li>
	<li>Dikkatle üstüne beyaz katmanı kaldırın ve microsome Pelet bozmadan SN (sitozol kesir) toplamak. Bir aliquot protein tayini için sitozol fraksiyonunun devam. 
	Not: Sitozol doğrudan vitro aktin polimerizasyon assay olarak kullanılabilir veya buz, flash-sıvı azot içinde donmuş bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.</li>
	<li>Sitozol protein konsantrasyonu belirlemek. 
	Not: En az 3 mg/mL olmalıdır.</li>
</ol> 5. Tahlil ölçüm Endosome bağımlı aktin polimerizasyon In Vitro Not: Endosome bağımlı aktin polimerizasyon gerçekleştirilen iki alternatif yaklaşımlar kullanarak. İlk yaklaşımda malzemeler bir test tüpü içinde karışık, sabit ve bir coverslip transfer ve analiz. Burada, açıklanan ikinci yaklaşımda tahlil doğrudan görüntüleme odasında gerçekleştirilebilmesi ve sabit ve mekanik pertürbasyon ( şekil 2C) analiz. Bu ikinci yaklaşımda tahlil karışımı bir test tüpünden bir coverslip için aktarılmaz ve böylece soğukkanlı, F-aktin ağlara fiziksel aktarım sırasında tedirgin tehlikesi azalan kalır. Buna ek olarak, bu ikinci yaklaşım F-aktin polimerizasyon hızlandırılmış bir analizi ile uyumludur. F-aktin polimerizasyon analizi hiçbir fark her iki yaklaşım ile gözlenmiştir unutulmamalıdır. 
Not: Kullanım ipuçları protokol boyunca kesti.
<ol><li>Bir test tüpü içinde <ol><li>yavaşça karışımı buz gibi saf GFP-RAB5 endosomes (Adım 3) sitozol (Adım 4) 1:10 (protein konsantrasyonu) olan bir buz gibi 1.5 mL konik test tüpünde oranında ile. 
		Not: Tipik bir deney ile yaklaşık 40-50 µL gerçekleştirilir.</li>
		<li>125 mM (1 M KCl hisse senedi çözüm kullanarak) KCl, 12,5 mM Hepes ve 1.5 mM MgOAc 2 (50 x hisse senedi çözüm kullanarak) son konsantrasyonları buz gibi tepki karışıma ayarlayın. Sonra karışımı proteaz inhibitörleri 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A ve 10 ng/mL aprotinin son konsantrasyonları ile ayarlayın. Tüm bileşenleri karışımı yavaşça.</li>
		<li>Sallayarak olmadan, 37 ° C'de tepki karışımı içeren deney tüpü yerleştirin ve istenen süre kuluçkaya. 
		Not: Genellikle, aktin polimerizasyon endosomes ve geniş bir ağ oluşumu için 30 dk algılamak için yaklaşık 3 dakika sürer.</li>
		<li>İstediğiniz zaman (Yani, 3 dk ya da 30 dk), buz üzerinde test tüpü yerleştirerek reaksiyonu durdurmak ve 1/10 (vol:vol) precooled % 3 PFA çözüm eklemek.</li>
		<li>, Kırmızı-turuncu boya polimerli aktin leke Birleşik 200 adet/mL (~6.6 mikron) phalloidin 0.3:10 (vol:vol) ekleyin.</li>
		<li>Yer 12 μL 12 üzerine karışımı μL PVA montaj orta bir mikro cam slayt üzerinde. 18 x 18 mm 2 cam coverslipon top koyun.</li>
		<li>Confocal mikroskobu ile örneğini analiz.</li>
	</ol></li> <li>Görüntüleme odasında <ol><li>mikroskobik görüntüleme chambers, plazma temizleyici 1 dakika yuvarlak 18 mm çaplı coverslip ve bir yuvarlak 35 mm çapı 20 mm cam alt ile donatılmış Petri kabına temizlemek için yapmak, (0.16-0,19 mm).</li>
		<li>% 1 β-kazein protein bağlayıcı cama en aza indirmek 20 dakika ile temizlenmiş yüzeyler kuluçkaya. 3 mM imidazole ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Ekle endosome ve aynı sitozol tahlil karışımı olduğu gibi 5.1.1 ve 5.1.2, precooled 1,5 mL tüp bebek adımları ve tahlil karışımı 0,1 μg/μL rodamine-aktin ile tamamlayıcı.</li>
		<li>Son kırılma % 39 Sükroz çözüm kullanarak dizin 1.375 (%26,5 Sükroz) için karışımı ayarlayın. 
		Not: Genellikle, aynı birimin eklenir; Ancak, bu ampirik olarak yeniden Sükroz konsantrasyon biraz deneme deneme değişebilir bu yana bir refractomer kullanarak toplanan kesir Sükroz konsantrasyonu bağlı olarak ayarlanmış olmalı.</li>
		<li>Ön işleme 35-mm çanak (Adım 5.2.1) karışımı yerleştirin ve ön işleme 18 mm coverslip (Adım 5.2.1) ile yeter.</li>
		<li>Odası, sallayarak olmadan 37 ° C'de yer.</li>
		<li>Confocal floresan mikroskopisi kullanılarak örneğini analiz.</li>
	</ol></li></ol> 6. Görüntü Acquisition ve aktin ağ analizi <ol><li>resim alma <ol><li>elde etmek belgili tanımlık imge üstünde ters bir tarama confocal mikroskobu. 
		Not: 63 X 1,25 NA petrol amaç ters bir tarama confocal mikroskopla için görüntü alma ayarlarını optimize. İyi bir sinyal / gürültü oranı elde etmek için lazer güç (genellikle % 50) ayarlamak.</li>
	</ol></li> <li>Miktar aktin ağının <ol><li>Floresan Filmler analiz. Açık kaynak kodlu yazılım CellProfiler (v2.1.1) 12 aktin endosome ücret miktarını ölçmek için kullanın (alternatif yazılım kullanılabilir).
		<ol><li>İlk, GFP-RAB5 sinyal kullanarak birincil nesne olarak endosomes belirlemek. O zaman, F-aktin aktin sinyal yayma kullanarak bireysel endosomes ile ilişkili ölçmek (kırmızı-turuncu boya Birleşik Phalloidin) ikincil bir nesne olarak.</li>
			<li>Ortalama ve her nesne için denetim durumu için ilişkili malzeme sayısı normale.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li>
<li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+Maturation%2C+Transport+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li>
<li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting%3A+all+WASHed+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li>
<li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer%3A+a+master+conductor+of+endosome+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).</li>
<li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+bodies%3A+co-ordinated+progression+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ESCRT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li>
<li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li>
<li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li>
<li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4%2C+Rab5%2C+and+Rab11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li>
<li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li>
<li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li>
<li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li>
<li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616(2014).</li>
<li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Aktin, endosome membran dynamics4,14' te önemli bir rol oynar. Biz daha önce aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon erken endosomes üzerinde oluşan küçük F-aktin yamalar veya ağları kurma bildirdi. Bu F-aktin ağlar membran taşıma düşmesine yol boyunca erken endosomes ötesinde için kesinlikle gereklidir. Bu çekirdekleşme ve polimerizasyon sürecinin herhangi bir aşamasında müdahale endosome olgunlaşması ve böylece geç endosomes andlysosomes9<...

Daha yüksek ökaryotik hücrelerde, proteinler ve yağlar sıralama oluştuğu erken endosomes içselleştirilmiş. Bazı proteinler ve yağlar, reutilized kaderinde vardır, erken endosomes borulu bölgelere dahil ve plazma zarı veya trans-Golgi ağ (TGN)1,2nakletti. Buna karşılık, diğer proteinler ve yağlar multivesicular bir görünüm sergileyen erken endosomes bölgelere seçmeli olarak paketlenir. Bu bölgeleri genişler ve erken endosomal membran üzerinden dekolmanı sonunda kart ücretsiz endosomal taşıyıcı veziküller veya multivesicular organları (ECV/MVBs), hangi kargo taşımacılığı geç endosomes1, karşı sorumlu değil 2.
Aktin endosomal sıralama kapasite ve endosome Biyogenez ile ilişkili membran tadilat sürecinde önemli bir rol oynar. Plazma zarı veya TGN geri dönüşüm yolları sıralama protein retromer karmaşık ve ilişkili proteinler bağlıdır. Bu sıralama makine oluşumu geri dönüşüm tübüllerin yolu ile etkileşimleri karmaşık, retromer, eşek ARISI ve yara izi homologue (yıkama) karmaşık ve dallı aktin3,4,5 ile birleştiğinde olabilir gibi görünüyor . Buna ek olarak, moleküller bozulması için mukadder, özellikle sinyal reseptörleri aktive, intraluminal veziküller (ILVs) taşıma (ESCRT)2,6içingerekli kompleksleri sıralama endosomal göre sıralanır, 7. Aktin ESCRT bağlı sıralama sürecinde olası rolü bilinen değil iken, F-aktin ECV/MVBs Biyogenez ve taşıma erken endosomes ötesinde önemli bir rol oynar. Özellikle, A2 annexin kolesterol zenginleştirilmiş bölgeler erken endosome ve spire1 ile birlikte bağlar, F-aktin polimerizasyon nucleates bulduk. Endosomes üzerinde gözlenen dallı aktin ağ oluşumu aktin ile ilgili protein (ARP) 2/3 dallanma etkinliğin gerektirdiği kompleksi, hem de ERM protein moesin ve aktin bağlayıcı protein cortactin8,9.
Burada, biz çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklayın. Bu tahlil A2 F-aktin çekirdekleşme içinde annexin ve moesin ve cortactin endosomal aktin ağları8,9oluşumunda rol araştırmak için daha önce kullanılmış. Bu vitro protokolü ile endosomes aktin polimerizasyon sırasında ortaya çıkan tepkiler karmaşık dizi aktin çekirdekleşme, doğrusal bir işlemi, sıralı adımları biyokimyasal ve moleküler analiz mükellef haline polimerizasyon, dallanma ve çapraz.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun asetat tetrahidrat</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Moleküler Problar</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Aktin rodamin</td><td>Hücre İskeleti. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poli (vinil alkol), Mw ~ 31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -kazein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 0.22 & mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü için yuvarlak 10 cm'lik tabaklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Pastör pipet</td><td>Yardımcı</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polipropilen tüp</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Hipodermik İğne 22G Siyah 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Steril Luer-slip 1mL Şırıngalar iğne</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Mikro cam kızaklar</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm cam lamel</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 santrifüj tüpü</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 santrifüj tüpü</td><td>Beckman coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L sarı uçlu</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1.000-&mu; L Mavi Dereceli Uç</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL test tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18 mm çapında yuvarlak lamel</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>35 mm çapında 20 mm cam tabanlı yuvarlak tabak (0,16 - 0,19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refraktometre</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultrasantrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü ultrasantrifüj</td><td>Beckman sürgü</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotor</td><td>Beckman sürgü</td><td>335649</td> TLS-55 rotor Beckman sürgü 346936 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskopi</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD transfeksiyon reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Protein tahlil reaktifi A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Protein tahlil reaktifi B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Protein tahlil reaktifi S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Yaklaşık 2 cm'lik silikon kauçuk parça, çok keskin bir açıyla kesilmiş ve metal bir çubuğa tutturulmuş veya forseps ile tutulmuş</td></tr><tr><td>Refraktometre</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta Kartal (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH Metre 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

vitro f-aktin üzerinde erken endosomes polimerizasyon

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Birçok erken endosome işlev, özellikle kargo protein sıralama ve membran deformasyon, endosomal membran parçalanmayabilir kısa F-aktin filamentleri yamalari bağlıdır. Biz böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi genetik ve biyokimyasal mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil kurduk manipülasyonlar. Endosomal kesirler flotasyon erken endosomal protein GFP-RAB5 ifade hücrelerden Sükroz Degradelerde tarafından hazırlanır. Sitozolik kesirler hücreler ayrı gruplar halinde hazırlanır. Hem endosomal hem sitozolik kesirler sıvı azot içinde donmuş gerekirse depolanabilir. Tahlil, endosomal ve sitozolik kesirler karıştırılır ve karışım uygun koşullarda (çevre azaltılmasıÖrneğin, iyonik gücü,) 37 ° C'de inkübe. İstenen zamanda tepki karışımı sabit ve F-aktin phalloidin ile ortaya çıkar. Aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon Floresans mikroskobu tarafından incelenir. Burada, bu tahlil ya aktin çekirdekleşme membran veya sonraki uzama, dallanma veya F-aktin filamentleri polietilenin söz konusu faktörler rol araştırmak için kullanılabilir raporu.

F-aktin yamalar üzerinde erken endosome membran oluşumu anlayışlar kazanmak için Şekil 2' de belirtilen iletişim kuralı takip ettik. Kısaca, hücreleri GFP-RAB5 ile transfected ve o zaman erken endosomes hücre altı ayırma tarafından hazırlanmıştır. Bu saf erken endosomes kendisi gibi diğer faktörler tepki muhtemelen katılan aktin sağlamak sitozol ile inkübe. Kuluçka dönemi sonunda, reaksiyon karışımı fiksasyonu tarafından durduruldu. Bir örnek daha sonra topla...

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Mikroskopi tabanlı bu in vitro çalışmanın genel amacı, endozomlardan aktin polimerizasyonunu in vitro olarak incelemektir. Bu yöntem, asidik yolaktaki aktin dünyası gibi, membran trafiği ve aktin alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı ise, erken endozomal membranlar üzerindeki F-aktin nükleasyon polimerizasyonunu deney tüpünde yeniden oluşturabilmesidir.Bu durum, bu karmaşık reaksiyonlar serisini kimyasal manipülasyonlarıma uygun hale getiriyor. Prosedürü laboratuvardan Jorge Larios ve Olivia Muriel uygulamalı olarak gösterecektir. İşleme, hela hücreleri içeren kapları düz bir buz kovası içindeki ıslak metal bir plaka üzerine yerleştirerek başlayın.Hücreler, beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkanır. Son yıkamadan sonra PBS uzaklaştırılır ve her kaba üç mililitre buz gibi soğuk PBS eklenir. Ardından, hücreleri kaplardan kazımak için esnek bir kauçuk hücre kazıyıcı (policeman) kullanılarak kabın dış kenarları boyunca hızlı dairesel hareketler yapılır.Ardından, kabın ortasında aşağı doğru bir hareket yapın. Yapışık hücre tabakaları elde etmek için nazikçe kazıyın. Daha sonra, hücreleri buz üzerindeki 15 mililitrelik konik

in-vitro-polymerization-of-f-actin-on-early-endosomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen protein bileşenlerini kullanarak boncukların yüzeylerinde aktin kuyruklu yıldızlarının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu tür sistemler, hücrelerde bulunan çıkıntılı yapıları taklit eder ve kuvvet üretiminin fizyolojik mekanizmalarını basitleştirilmiş bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Burada, saflaştırılmış proteinlerden yarı iki boyutlu (2D) dolaşık, çapraz bağlı ve sıvı kristal aktin düzeneklerinin hazırlanması için yöntemler sunuyoruz.

Aktif Aktin Bazlı Montajların Kasılma ve Deformasyon Modlarının In Vitro Olarak Ayarlanması: İki Boyutlu Aktif Ağlardan Sıvı Kristal Damlalara

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Öğrenin, erken endozomlardan F-aktin polimerizasyonunu in vitro mikroskopi bazlı analizle nasıl çalışılacağını. Bu yöntem, HeLa hücreleri kullanarak aktin dinamiklerini ve membran trafiklemesini araştırmak için değerli bir çerçeve sunar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Daha fazla video keşfet