Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

İn vitro teste dayalı bu mikroskobun genel amacı, in vitro endozomlardan aktin polimerizasyonunu incelemektir. Bu yöntem, asidik yoldaki aktin dünyası gibi membran kaçakçılığı ve aktin alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ve bu tekniğin ana avantajı, test tüpündeki erken endozomal membranlar üzerinde F-aktinin çekirdeklenme polimerizasyonunu yeniden oluşturmaktır.

Bu, bu karmaşık reaksiyonlar dizisini benim kimyasal manipülasyonlarıma uygun hale getiriyor. Prosedürü laboratuvardan Jorge Larios ve Olivia Muriel gösterecek. Hela hücrelerinin tabaklarını düz bir buz kovasındaki ıslak metal bir plakaya yerleştirerek başlayın.

Ve hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi son yıkamadan çıkardıktan sonra, tabak başına üç mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Ardından, bulaşıkların dışındaki hücreleri hızlı dairesel hareketlerle bulaşıklardan sıyırmak için esnek bir lastik polis memuru kullanın.

Ardından yemeğin ortasında aşağı doğru bir hareket gelir. Ekli hücrelerin tabakalarını elde etmek için hafifçe kazıyın. Daha sonra, hücreleri buz üzerinde 15 mililitrelik konik polipropilen tüplere nazikçe aktarmak için geniş bir ağzı olan plastik bir pastör pipeti kullanın.

175 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yavaşça çıkarın ve peletlere bir ila üç mililitre homojenizasyon tamponu ekleyin. Geniş bir ağzı olan plastik bir pastör pipeti kullanarak, hücreleri yeniden askıya almak için bir kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra 1, 355 kez G ve dört santigrat derecede yedi ila 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, her hücre paletine proteaz inhibitörleri içeren bilinen bir hacimde homojenizasyon tamponu ekleyin. Ve hücreler yeniden askıya alınana kadar hava kabarcıkları oluşturmadan nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Bir mililitrelik tüberkülin şırıngasını homojenizasyon tamponu ile durulayın ve hava veya kabarcık içermediğinden emin olun. Ardından, hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için şırıngayı hücre süspansiyonu ile yavaşça doldurun. İğnenin konik ucunu tüpün duvarına yerleştirin ve bağlı hücrelerin plazma zarlarını kesmek için hücre süspansiyonunu hızla dışarı atın.

Daha sonra her homojenattan küçük bir alikot alın, bir cam slayt üzerinde 50 mikrolitre homojenizasyon tamponuna seyreltin ve karıştırın. Daha sonra bir cam kapak astarı ile örtün, homojenatları 20 kat veya 40 kat objektif ile donatılmış bir faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. Optimal koşullar altında, çoğu hücre kırılır, ancak koyu gri görünen çekirdekler yuvarlaktır ve değildir.

Çoğu hücre kırılana kadar kesme adımını tekrarlayın, genellikle iğne boyunca üç ila altı yukarı ve aşağı vuruş gereklidir. Protein tayini için her homojenattan küçük bir alikot bulundurun. Daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, nükleer sonrası süpernatanı dikkatlice toplayın.

Protein tayini için her bir nükleer süpernatan ve nükleer peletin küçük alikotlarını ayırın ve ardından nükleer peletleri atın. Nükleer sonrası süpernatantları, yüzde 62 sakaroz çözeltisine bire bir oranında ekleyerek yüzde 40.6 sükroz seviyesine ayarlayın. Hava kabarcıkları oluşturmadan nazikçe ama iyice karıştırın.

Yüzde 40.6 sükroz içindeki post nükleer süpernatanları ultra santrifüj tüplerine aktarın. İki nokta beş mililitre yüzde 35 sükroz çözeltisi ile dikkatlice kaplayın ve santrifüj tüpünü homojenizasyon tamponu ile doldurun. Gradyanları yaklaşık 165.000 kez G ve dört santigrat derecede bir saat boyunca ultra santrifüjleyin.

Ultra santrifüjlemenin ardından, gradyanların üzerindeki beyaz lipit tabakasını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, homojenizasyon tamponu ile yüzde 35 sükroz arasında bulunan endozomları içeren arayüzü toplamak için kesilmiş uçlu 200 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanın. Sitozolü toplamak için, post nükleer süpernatanı bir ultra santrifüj tüpüne pipetleyin.

Ve yaklaşık 250.000 kez G ve dört santigrat derecede 45 dakika boyunca ultra santrifüj. Ardından, üstteki beyaz tabakayı dikkatlice çıkarın ve mikrozom peletini bozmadan sitozol fraksiyonu olan süpernatanı toplayın. Buz gibi soğuk saflaştırılmış GFP sarılı beş endozomu, buz gibi bir nokta beş mililitre konik test tüpünde bir ila 10 protein konsantrasyonu oranında sitozol ile nazikçe karıştırarak teste başlayın.

Daha sonra, reaksiyon karışımını 125 milimolar potasyum klorürün nihai konsantrasyonlarına ayarlamak için potasyum klorür stok çözeltisi kullanın. 12.5 milimolar hepes ve 1.5 milimolar magnezyum asetat. Daha sonra proteaz inhibitörleri ile karışımı, 10 milimolar leupeptin, bir milimolar pepstatin a ve mililitre aprotinin başına 10 nanogram nihai konsantrasyonlara ayarlayın.

Reaksiyon karışımını içeren test tüpünü çalkalamadan 37 santigrat dereceye yerleştirin ve istenen süre boyunca inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, test tüpünü buzun üzerine yerleştirerek ve bir ila 10 hacimsel oranda önceden soğutulmuş yüzde üç PFA çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun. Polimerize aktini lekelemek için sıfır nokta üç ila 10 hacimsel oranında kırmızı turuncu boyaya konjuge edilmiş mililitre başına 200 mikrogram falloidin ekleyin.

Karışımın 12 mikrolitresini bir mikro cam slayt üzerindeki 12 mikrolitre PVA montaj ortamına pipetleyin. Üstüne 18 x 18 mililitrelik bir cam kapak fişi koyun. Daha sonra numuneyi floresan konfokal mikroskopi kullanarak analiz edin.

Cama protein bağlanmasını en aza indirmek için mikroskobik görüntüleme odalarının temiz yüzeyini yüzde bir beta kazein ile buz üzerinde 20 dakika inkübe ederek başlayın. İnkübasyonun ardından, üç milimolar imidazol ile iki kez yıkayın. Rodamin aktini, daha önce gösterildiği gibi tahlil için endozomları ve sitozol karışımını içeren önceden soğutulmuş bir nokta beş mililitrelik bir test tüpüne ekleyin.

Karışımın son kırılma indisini, yüzde 26,5'lik bir nihai konsantrasyona yüzde 39 sükroz çözeltisi ekleyerek bir nokta üç yedi beşe ayarlayın. Karışımı önceden işlem görmüş 35 milimetrelik tabağa dağıtın ve önceden işlem görmüş 18 milimetrelik kapak fişi ile örtün. Odayı daha önce olduğu gibi üç veya otuz dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Daha sonra floresan konfokal mikroskopi ile analiz edin ve yazılı protokoldeki önerileri kullanarak aktin ağını ölçün. Aşağıdaki görüntüler, bir aktin kaynağı olarak sitozol ile inkübe edilen GFP-RAB5 eksprese eden hücrelerden saflaştırılan erken endozomları göstermektedir. Tahlil karışımı sabitlendi, örneklendi ve mikroskobik bir slayt üzerine yerleştirildi ve f aktin, kırmızı bir floraya konjuge edilmiş falloidin ile görselleştirildi.

Aktin çekirdeklenmesi ve polimerizasyon süreci hızlıydı, çünkü f aktin bir dakika sonra bazı endozomlarda zaten tespit edilebiliyordu. Bu kısa aktin yapıları, 30 dakikalık bir süre boyunca hızla büyüdü ve birbirine bağlandı ve dallandı ve sonunda ipliksi bir ağ oluşturdu. Muhtemelen in vitro olarak dengesiz aktin dinamiklerini yansıtıyor.

Bu görüntüler, testin cam tabanlı tabaklarda hücre sitozolüne ek olarak saflaştırılmış rodamin etiketli aktin ile gerçekleştirilmesiyle elde edildi. Böylece yapılar herhangi bir bozulma olmadan doğrudan görüntülenebilir. Burada görüldüğü gibi, benzer çekirdeklenme ve polimerizasyon oranları gözlenmiştir.

Burada açıklanan tahlilde, erken endozomlar seçici olarak de novo aktin polimerizasyonunu çekirdeklendirir. Endozom veya sitozol atlandığında aktin polimerizasyonu tespit edilmediğinden. Bu gözlemler, erken endozomların aktin çekirdeklenmesini ve polimerizasyonunu tetiklemek için içsel ve spesifik kapasiteye sahip olduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, in vivo olarak nispeten düşük düzeyde RAP5 ekspresyonu koşullarının tercih edildiğini hatırlamak önemlidir. Ve bu hücresel zarlar nispeten kırılgandır ve biyokimyasal veya kimyasal şoklara karşı hassastır. Benzer şekilde, in vitro aktin ağı da çok kırılgandır ve çökmeyi veya kırılmayı önlemek için hassas bir şekilde ele alınmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, test tüpündeki erken endozomal membranlar üzerinde f aktinin çekirdeklenme polimerizasyonunun nasıl yeniden oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknikle, zar üzerindeki aktin çekirdeklenmesiyle veya f aktin filamentlerinin müteakip uzaması, dallanması veya çapraz bağlanmasıyla ilgili faktörler dünyasını inceleyebileceksiniz.