Name: Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde gerçek zamanlı cAMP tahlili kullanarak koku alma reseptörlerinin aktivasyonunu nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, reseptör-ligand çiftlerinin farmakolojik karakterizasyonunu kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Çin Ulusal Bilim Vakfı (31070972), bilim ve teknoloji Komisyonu, Shanghai Belediyesi (16ZR1418300), yenilikçi araştırma ekibi Şangay Belediye Eğitim Komisyonu, Shanghai Doğu için Program tarafından desteklenmiştir Akademik Program (J50201) ve Çin (2012CB910401) ulusal temel araştırma programı.

1. Culturing ve Hana3A hücreleri bakım <ol><li>10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 ile minimum temel orta (MEM) hücrelerde koru µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B 100 mm hücre kültür çanak 37 ° C hücre kültür kuluçka %5 CO 2. Her diğer geçişiyle plazmid (bkz: giriş) istikrarlı transfection korumak için 1 µg/mL puromisindir eklemek. 
	Not: steril ortam sağlamak için bir sınıf II biyolojik Emanet dolabı hücre kültüründe içeren tüm adımları.</li>
	<li>100-mm yemeklerinde 2-3 günde % 10-20 oranında alt kültür.</li>
</ol> 2. Hücreleri Transfection için kaplama <ol><li>Hana3A hücreleri hücre canlılığı sağlamak ve izdiham tahmin etmek için bir faz kontrast mikroskop altında dikkat.</li>
	<li>Tüm hücre kültür çanak ortamından Aspire edin.</li>
	<li>Yıkama hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL tabağa ekleme, çanak dönen ve PBS aspirating.</li>
	<li>3 mL % 0.05 tripsin-etilen diamin tetraacetic asit (EDTA) plaka üzerine ekleyin. Mix 1 dk ya kadar tüm hücreleri ayakta. 
	Not: plaka gerektiği gibi mikroskop altında alt ayırma hücreleri ilerlemesini gözlemlemek.</li>
	<li>%10 FBS ve yukarı ve aşağı parçalarını kırmak için pipet ile 5 mL MEM de ekleyerek Yinele tripsin hücre Mass 
	Not: transfection önce kaplama için kullanılan orta antibiyotik içermelidir. Ayrıca antibiyotik transfection etkinliğini azaltmak.</li>
	<li>15-mLl tüp transfected için tabak sayısına bağlı olarak uygun bir miktar hücre aktarın. Her 96-şey plaka, plaka 2 x 10 6 hücre veya yaklaşık %1/5 100 Konfluent 100 mm çanak için bir hücre sayısı 2 x 10 4 hücreleri her şey veya yaklaşık % 15-30 izdiham yoğunluğu iyi vererek. Santrifüj kapasitesi 200 x g 5 min için de tüpler ve hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin. 
	Not: overgrowing veya hücreleri stimülasyon önce undergrowing önlemek için 96-şey plakalar üzerine kaplama hücrelerinin doğru tutarını hesaplamak.</li>
	<li>MEM uygun bir miktar % 10 ile 15 mL içine FBS tüp ve yukarı ve aşağı pipet hücre topakları kadar kitle kırmak için ekleyin. Her 96-şey plaka için MEM 6 mL % 10 ile hücrelerle resuspend FBS. 
	Not: Hava kabarcıkları tüp değil oluşturmak için dikkatli olun.</li>
	<li>Askıya alınan hücreler bir rezervuar ekleyin. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her şey bir 96-şey plaka üzerine hücrelerinin 50 µL pipet. Gecede %5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol> 3. Plazmid transfection <ol><li>transfection önce iyi bir faz kontrast mikroskop altında başına yaklaşık % 30-50 uygun bir izdiham sağlamak ve kuluçka makinesi için dönmek için kaplama hücreleri gözlemlemek.</li>
	<li>Hazırla şimdiden Rho öğesini OR yapı 11 , 21 , 22 , 28, Aksesuar faktörü (RTP1S oluşturur. 22 , 36 ve M3R 23), ve Biyoalgılayıcı değişken miniprep tarafından 29 , 30. DNA toplama tarafından Spektrofotometre ölçmek ve gerekli distile su ile plazmid DNA konsantrasyonları (örneğin, 100 ng/µL için) ayarlamak.</li>
	<li>Transfection hazırlaması <ol><li>Tablo 1 göre her 96-şey plaka için MEM 500 µL bir plazmid transfection karışımı hazırlayın. 
		Not: farklı ORs aynı 96-şey plaka üzerinde test ettiğimizde, hacmi transfection karışımı ve plazmid DNA eklenen miktarı verilen OR ile transfected kuyu sayısı işlevindeki adapte olmalı.</li>
		<li>Hazırlama bir transfection karışımı bir tüp ile lipid-aracılı transfection reaktif MEM. 500 µL içinde 18 µL</li>
	</ol></li> <li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından plazmid karışımı transfection karışımı ile karıştırın. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Reaksiyon MEM 5 mL % 10 ekleyerek durdurmak FBS.</li>
	<li>Steril kağıt havlu hücre kültür kapüşonlu kalın bir tabaka dışarı yayılır. 96-şey plaka hücrelerle kuluçka makinesi alın. Böylece orta tamamen kağıt havlu tarafından emilir plaka baş aşağı kağıt havlu yığını üzerinde yavaşça ve tekrar tekrar dokunun. 
	Not: bir hücre kaybedebilir gibi zorla veya aniden plaka dokunun değil.</li>
	<li>Kombine transfection karışımdan 50 µL 96-şey plaka her şey için transfer ve gecede 18-24 h 37 ° c % 5 CO 2 için kuluçkaya. 
	Not: birden fazla 96-şey plaka test edilirken bir deneyde aynı transfection zaman ve uyarıcı pozlama süresi sonra ölçülen tüm plakaları için bir saat tarafından yönetilen transfection ve stimülasyon zamanlama ölçüm öncesinde.</li>
</ol> 4. Stimülasyon ve ölçüm veya gerçek zamanlı kampı tahlil kullanarak etkinliğini <ol><li>şey başına 50-%80 uygun bir izdiham sağlamak ve kuluçka makinesi için dönmek için faz kontrast mikroskop altında transfected hücreleri gözlemlemek.</li>
	<li>Uyarım orta 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ve 5 mM ekleyerek glikoz Hank'e hazırlamak &#39; s dengeli tuz çözüm (HBSS).</li>
	<li>Gerçek zamanlı kamp tahlil Substratı reaktif aliquots buz çözme. Substrat reaktif-80 ° c, tüp başına 55 µL PCR tüpleri saklayın. Plaka başına 1 tüp kullanın.</li>
	<li>% 2 denge çözüm 55 µL Substratı reaktif ve 2750 µL HBSS/HEPES/glikoz çözüm karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Kağıt havlu tezgah üzerine kalın bir tabaka dışarı yayılır. Böylece transfection orta tamamen kağıt havlu tarafından emilir yavaşça ve art arda tabak kağıt havlu üzerinde ters dokunun.</li>
	<li>HBSS/HEPES/glikoz çözüm her şey için pipetting 50 µL tarafından hücreleri yıkayın.</li>
	<li>HBSS/HEPES/glikoz çözüm 96-şey plaka yavaşça ve tekrar tekrar pes.</li>
	<li>Pipet 25 µL % 2 denge çözüm her şey ve 2 h. için karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Önceden 1 M DMSO ve store-20 ° c kadar kullanılır propil hisse senedi çözümleri hazırlayın.</li>
	<li>Kuluçka kıyamete öncesinde propil hisse senedi çözümleri çalışma konsantrasyonları HBSS/HEPES/glikoz stimülasyon orta sulandırmak. 
	Not: Bu adımda hazırlanan propil dilutions konsantrasyonları her şey doğru son konsantrasyonlarda vermeye iki katına.</li>
	<li>Bir Kemiluminesan kullanarak plaka okuyucu ve propil toplamadan önce iyi 34 başına 1000 ms oranında 2 ardışık kez için plaka Bazal ışıldama düzeyini ölçmek.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde plaka plaka okuyucu kaldırmak ve her şey için 25 µL propil dilutions ekleyin ve hemen bütün Wells sürekli ışıldama ölçümlerinde 20 devir başlatmak 30 dk. içinde 
	Not: farklı odorants ve/veya aynı odorants farklı konsantrasyonlarda aynı plaka kullanırken dikkatle komşu kirletici önlemek için pipet kuyuları.</li>
</ol> 5. Veri analizi <ol><li>Kemiluminesan plaka okuyucu yazılım veri ihraç.</li>
	<li>Hesaplama formülü kullanarak her zaman için OR yanıt normalleştirilmiş 
	(ışıldama N &#8211; ışıma Bazal) / (ışıldama en yüksek &#8211; ışıma Bazal) nerede N = belirli bir ışıldama değeri iyi; Bazal Bazal iki ortalama ışıldama değeri = Işıma değerleri; en yüksek en yüksek ışıma değer bir plaka veya bir tabak =. 
	Not: alternatif grafiksel gösterimleri deneme amaçlı bağlı olarak kabul edilebilir. Örneğin, (bkz: şekil 1) deneyleri süzmek için ve konsantrasyon-yanıt eğrileri, en büyük değer gibi Kinetik ölçüm sırasında istenilen zamanda noktada bazı iyi bir ışıldama değerini oluşturmak için veya son değer-ebilmek var olmak kullanılmış.</li>
</ol>

<ol><li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+scent+of+avian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li>
<li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037663578290033X">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li>
<li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors%3A+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+holy+grail%3A+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li>
<li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors%3A+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640(2014).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li>
<li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MouSensor%3A+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+retention%2C+degradation%2C+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1(2011).</li>
<li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li>
<li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li>
<li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li>
<li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/~/media/files/resources/reprints/glosensor_gen_2009_gr001.ashx?la=en">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li>
<li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li>
<li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OR2M3%3A+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li>
<li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2%2C4-nonanedione%2C+a+key+food+odorant+in+aged+wines%2C+tea%2C+and+other+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling+Sulfur%3A+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li>
<li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-transporting+protein+1+short+%28RTP1S%29+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li>
<li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li>
<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

AMELİYATHANEYİ'ın etkinleştirme maruz bir belirli propil için üzerine doğru ölçme koku bilgi kodlama deşifre ilk adımdır. Deneyler nasıl bir örneği, bir vitro kullanarak tanımlayabilirsiniz bu çalışma temsil OR ifade sistem, duyarlı ORs uygun faiz ve daha sonra reseptör karakterize kokulu gelir insan OR repertuar arasında gösterilen çeşitli kimyasal konsantrasyonları kullanarak Farmakoloji. Bizim sonuçları OR5AN1 muscone için bir bona fide reseptör olarak onaylamak. Bu bir önceki rapor...

Onlar yiyecek elde kaçının saldırganlar ve tehlike tür ayırt etmek ve dostum1,2seçin için koku alma yeteneklerini üzerinde itimat gibi koku alma duygusu hayvanların hayatta önemli bir rol oynar. Bu işlevlerin gerçekleşme tek tek koku epitel (OE) bulunan silier yüzeyi koku duyusal nöronların (OSNs) ifade edilir propil reseptörleri (ORs), bağlıdır. ORs en büyük ailesi G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) süper yaklaşık 400 ve 1200 farklı OR genleri olan insan ve fare, sırasıyla3,4,5oluşturmaktadır. Odorants tarafından aktive ORs koku G-protein (Golf) sıralı harekete geçirmek yolu ile hücre içi kamp düzeyinin için kurşun ve III gozlemler cyclase (ACIII) yazın. Hücre içi kampı ortaya çıkan artan düzeyde Ca2 + ve aksiyon potansiyelleri de dahil olmak üzere ve sonuçta ilk adım katyonlar akını tetikleme hücre yüzeyinde nükleotit Geçitli kanal açan ikinci habercisi olarak, işlev olabilir Nöro-potansiyel iletim ve koku algı. Saptama ve çok sayıda odorants ORs tarafından ayrımcılık işlemi koku algı6,7ilk adımı olarak kabul edilir.
Buck ve Axel8 ilk başarıyla propil reseptörleri klonlanmış ve ORs tarafından başlatılan koku algı mekanizmasının aydınlatılmamıştır beri deorphanization OR ailesinin bu alandaki hotspots biri haline geldi. OR harekete geçirmek ölçmek için çeşitli içinde vivo, ex vivo ve in vitro yöntemleri bildirilen9,10,11,12olmuştur. Ca2 + görüntüleme tek hücreli RT-PCR tarafından OSNs üzerinde takip kullanılan geleneksel bir yöntem Alifatik odorants13,14,15farklı ORs tanımlaması etkin. Daha yakın zamanlarda, büyük ölçekli transcriptome analizleri gelişiyle daha yüksek üretilen iş in vivo yöntemler geliştirme teşvik. Kentucky tahlil eugenol ve muscone duyarlı fare ORs S100a5-tauGFP muhabir fare zorlanma ve Mikroarray analiz9kullanımı ile tespit edilmiştir. OR mRNA düzeyleri azalma propil maruz kaldıktan sonra dayanarak, rüya teknoloji OR etkinleştirme profilleri her iki tür omurgalı ve omurgalılar16belirlemek için bir transcriptomic yaklaşım istihdam. Benzer şekilde, S6 fosforilasyon nöronal activations içinde göz önüne alındığında, Matsunami grup duyarlı ORs12tanımlamak için fosforile ribozom immunoprecipitations gelen Sıralı mRNA'ların. Son olarak, Feinstein grup içinde vivoMouSensor teknoloji17olarak bilinen, kodlama koku çalışma için bir platform olarak hizmet verebilir süper sniffer fareler bildirdi.
Vitro alanda OSNs kültür meydan OR fonksiyonel ifade içinde vivo taklit eden bir kapaklı ifade sistemi kokulu kimyasallar büyük ölçekli tarama ORs için yapmak için ideal bir çözüm yapar. Yine de, kültürlü hücre hatları sigara koku kökenli yerel OSNs farklı veya proteinler endoplazmik retikulum ve plazma zarı trafik için korunur beri OR bozulması ve reseptör işlevi18 kaybı ile sonuçlanan , 19. bu sorunu çözmek için kapsamlı çalışmalar OR fonksiyonel ifade Contegra hücre hatlarında hücre zarı üzerinde çoğaltmak için yapılmıştır. Krautwurst ve ark. ilk rhodopsin (Rho-etiket) ilk 20 amino asit OR protein N-terminal bağlı. ve bu bazı ORs insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri20hücre yüzeyine ifade yükseldi. Gen ifade (adaçayı) Kütüphane analizi tek OSNs, üzerinden seri bir analiz tarafından Saito ve ark. ilk klonlanmış reseptör taşıma protein (RTP) aile üyeleri, RTP1 ve RTP2 ve OR hücre zarı ticareti kolaylaştırdı ve propil-aracılı yanıtları ORs HEK293T hücrelere Gelişmiş reseptör ifade artırıcı protein 1 (REEP1) 21. bu bulgulara dayanarak, Matsunami grup başarılı Hana3A hücre kültürünü kurdu, stabil RTP1, RTP2, REEP1 ve Gαolf içinde HEK293T ile transfected ve geçici verimli veya fonksiyonel Rho öğesini ORs ile transfected ifade. Sonraki çalışmaları 1) RTP1, RTP1S, daha sağlam teşvik veya işlev özgün RTP1 protein ve β-arrestin-2 inhibisyonu yoluyla OR etkinliği artıran 2) Tip 3 muscarinic asetilkolin reseptörü (M3R) daha kısa biçimi ortaya İşe Alım, ikisi de deneysel optimize etmek için kapaklı ifade sistem kullanılmaya başlanan22,23çıktı.
Birkaç algılama yöntemleri reseptörü harekete geçirmek Contegra sistemlerinde ölçmek için kullanılmaktadır. Salgılanan plasental alkalen fosfataz (SEAP) tahlil OR harekete geçirmek değerlendirmek için çekici bir seçenek yapma transcriptionally kamp yanıt öğeleri (CREs), tarafından düzenlenen bir muhabir enzim ile çalışır. Floresans kolayca SEAP algılama reaktif24ile kuluçka sonra kültür orta bir örneği algılandı. Bu yöntemi kullanarak, ikincil bir sınıf reseptörleri (TAARs) Amin ilişkili olmuştur OE-izlemesinde ifade chemosensory reseptörlerinin yanı sıra ORs fonksiyonları25,26,27ile karakterizedir. Başka bir ortak yöntem, luciferase yöntemi, bir ateş böceği luciferase muhabir gen kamp yanıt öğesi (CRE) kontrolü altında kullanır. Luciferase üretim tarafından üretilen ışıma ölçme OR harekete geçirmek10,11,28miktarının verimli ve güçlü bir araç sağlar.
Gerçek zamanlı kamp deneyleri de dinamik olarak kapaklı veya endojen GPCRs işlev izleme yaygın olarak kullanılmıştır. Bu tür gelişmiş deneyleri bir örnek luciferase mutant bir forma erimiş bir kampı-bağlayıcı etki sahip bir genetik olarak kodlanmış Biyoalgılayıcı değişken yararlanır. Kamp bağlandığında konformasyonal değişim luciferase, ışıma hangi sonra bir Kemiluminesan okuyucu29,30ile ölçülebilir aktivasyonu yol açar. Gerçek zamanlı kamp teknoloji HEK293 ve NxG 108CC15 hücrelerdeki insan propil reseptörlerinin de-orphaning için uygun bildirilmiştireşek "xref" = > olduğu gibi iyi HEK293T elde edilen Hana3A34,35hücreleri gibi 31,32,33,. Krautwurst grup aynı zamanda çift yönlü büyük ölçekli veya eleme yaklaşımlar32,33için uygun olmak için gerçek zamanlı kamp teknoloji ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Burada gerçek zamanlı bir kamp tahlil Hana3A hücrelerde kullanarak OR etkinleştirme ölçmek için bir protokol açıklayın. Bu protokol için önceden dengelenmiş canlı hücreleri ışıldama kinetically belirli uçucu bileşikler ile tedavi takip, üzere OR harekete geçirmek bir daha verimli ve doğru analiz temsil eden 30 dk ölçülür uzun zaman ve koku indüklenen hücre toksisite olan hücresel ortamda ortaya çıkan eserler. Bu gerçek zamanlı ölçüm ORs ve ligandlar büyük ölçekli bir tarama, hem de belirli OR-ligand çiftlere ilgi karakterizasyonu için sağlar. Bu yöntemi kullanarak, biz başarılı bir şekilde OR5AN1 olarak misk bileşik muscone reseptör 379 insan ORs karşı bir tarama gerçekleştirmek ve daha sonra olumlu tarama sonucunu teyit tespit.

<table><tbody><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP reaktifi</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP plazmid</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A hücreleri</td><td></td><td></td><td>istek üzerine yazarlardan temin edilebilir</td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum veya magnezyum içermeyen</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr> M3R <tr>plazmiti<td></td><td></td><td></td>, EBSS ve L-glutamin Hyclone SH30024 <td></td></tr> Muscone <tr><td></td><td>Santa ile pCI MEM gibi bir memeli ekspresyon vektörüne klonlanmıştır</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Misk tibeten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>VEYA plazmitleri</td><td></td><td></td>, kalsiyum veya magnezyum olmadan <td>pCI PBS gibi bir memeli ekspresyon vektörüne bir Rho-tag ile klonlanmıştır</td></tr><tr><td></td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid mini hazırlık kiti</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S plazmiti</td><td></td><td></td>, <td>pCI gibi bir memeli ekspresyon vektörüne klonlanmıştır</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Hidroklon</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tüpü</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tüpü</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 17 mm x 120 mm konik tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8 oyuklu ve/veya 12 oyuklu çok kanallı pipetleyici</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu düz tabanlı beyaz hücre kültürü plakası</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm hücre kültürü kabı</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akışlı</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sınıf II biyolojik güvenlik kabini%5 CO2</td><td></td><td></td><td></td>Santrifüjlü hücre kültürü inkübatörü</tr><tr><td>, 15 ml konik tüpler</td><td></td><td></td><td></td>için sallanan kova rotorlu</tr><tr><td>Sonsuz F200 plaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>x10 ve x20 objektifli</td><td></td><td></td><td></td>faz kontrast mikroskobu</tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı dağıtım</td><td></td><td></td><td></td>için steril reaktif rezervuarları</tr><tr><td>Steril kağıt havlu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Memeli propil reseptör (OR) aileler büyük boyutları arasında çok sayıda uçucu Kimyasalları soydaş onların ligandlar bulmak için zorluklar. ORs verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde deorphanize için memeli ORs ve genetiği değiştirilmiş Biyoalgılayıcı plazmid kamp üretim aşağı OR etkinleştirme gerçek zamanlı olarak ölçmek için ifade etmek için bir kapaklı cep satırının kullanımını birleştirir. Bu tahlil için ekran odorants ORs ve ahlak bozukluğu çok yönlükarşı kullanılabilir. Pozitif propil-reseptör etkileşimleri ekranlar üzerinden daha sonra konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturma çeşitli koku konsantrasyonlarının karşı test ederek teyit edilmesi. Burada Hana3A hücrelerde ifade ve olumlu yanıt reseptör soydaş reseptör için faiz bileşik olduğunu doğruladı insan bir OR Kütüphane karşı kokulu bir bileşik bir yüksek-den geçerek tarama gerçekleştirmek için bu yöntem kullanılır. Verimli ve güvenilir OR harekete geçirmek değerlendirirken bu yüksek üretilen iş algılama yöntem bulduk ve bizim veri OR fonksiyonel çalışmalar potansiyel kullanım için bir örnek sağlar.

Muscone doğal misk üzerinden ana aromatik bileşenidir. Son muscone ve fare veya MOR215-1, fareler37,38davranışlar içinde muscone duyarlı glomeruli üzerinden klonlanmış homoloji dayalı diğer macrocyclic misk bileşikler için insan bir reseptör olarak tanımlanan OR5AN1 çalışmalar. İnsan OR repertuar, bizim grup ve Touhara grup Ayrıca tarama tarafından OR5AN1 olarak iki macrocyclic misk bileşikler, cyclopentadecanone ve muscone, büyük...

Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Bu gerçek zamanlı yüksek kapasiteli siklik AMP analizinin genel amacı, koku maddelerini koku reseptörlerine ve tersine koku reseptörlerini koku maddelerine karşı taramaktır. Fareler, hem koku reseptörlerinin hem de ligandların daha büyük ölçekli taranmasına ve ilgilenilen reseptör-ligand çiftlerinin farmakolojik karakterizasyonuna olanak tanıdığı için koku reseptörü işlevlerini araştırmak adına kullanışlıdır. Bu tekniğin temel avantajı, koku maddesinin reseptörü aktivasyonunu verimli ve güvenilir bir şekilde değerlendirebilmemizdir.Canlı hücreler kullanılarak heterolog koku maddesi-reseptör ekspresyon sistemi. Hücre canlılığını doğrulamak ve konfluensle ilgili tahminde bulunmak için önce Hana3A hücrelerini bir faz-kontrast mikroskobunda inceleyerek başlayın. Ardından, hücre kültürü kabındaki tüm besiyerini aspire edin.Plakaya 10 mililitre fosfat tamponlu salin ekleyip, kabı dairesel hareketlerle sallayarak ve PBS'yi aspire ederek hücreleri yıkayın. Ardından, plaka üzerine üç mililitre %0,5 trypsin-EDTA ekleyin. Trypsin'i bir dakika boyunca veya tüm hücreler yüzene kadar hücrelerin üzerinde bırakın.%10 FBS içeren 5 mililitre MEM ekleyerek ve hücre kütlesi topaklarını dağıtmak için pipetle yukarı aşağı çekerek tripsini inaktive edin. Hücre sayımı yaptıktan sonra, transfekte edilecek 96 kuyucuklu plaka başına 2x10⁶ hücreyi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Stimülasyon öncesinde hücrelerin aşırı büyümesini veya yetersiz büyümesini önlemek için 96 kuyucuklu plakaya hazırlanacak doğru hücre sayısını hesaplamanız önemlidir.Tüpleri 5 dakika boyunca 200 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, hücre peletini rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin. Her 96 kuyucuklu plaka için 6 mL antibiyotiksiz besiyeri ekleyin ve hücre kütlesi topaklarını dağıtmak için hava kabarcığı oluşturmadan pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın.Süspansiyon halindeki hücreleri bir rezervuara aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 50 µL hücre ekleyin. %5 CO2 içeren 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Transfeksiyondan önce, her kuyucukta yaklaşık %30 ila %50 oranında uygun bir konfluens olduğundan emin olmak için ekilmiş hücreleri faz-kontrast mikroskobu altında gözlemleyin ve ardından inkübatöre geri koyun. Odorant-reseptör konstrüktü, aksesuar faktör konstrüktleri ve siklik AMP biyosensör varyant konstrüktü ile işaretlenmiş satırı takip edin. Ardından, her 96 kuyucuklu plaka için 500 µL MEM içerisinde bir plazmit transfeksiyon karışımı hazırlayın.Ardından, 500 µL MEM içinde 18 µL lipid aracılı transfeksiyon reaktifi içeren bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. Transfeksiyon karışımını, pipetle yukarı-aşağı çekerek plazma karışımı ile karıştırın. Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, transfeksiyon karışımına 10%FBS içeren 5 mililitre MEM ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücre kültürü davlumbazına kalın bir katman steril kağıt havlu yayın. İnkübatörden içinde hücrelerin bulunduğu 96 kuyucuklu plakayı alın.Besiyerinin kağıt havlu tarafından tamamen emilmesi için plakayı ters çevirip kağıt havlu yığınının üzerine nazikçe ve defalarca vurun. Birleştirilmiş transfeksiyon karışımından 50 µL'yi 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna aktarın ve 37 °C'de %5 CO2 içeren ortamda 18 ila 24 saat boyunca gece boyunca inkübe edin. Bir deneyde birden fazla 96 kuyucuklu plaka test ediliyorsa, tüm plakaların aynı transfeksiyon ve uyaran maruziyet aralığına sahip olması için transfeksiyon ve stimülasyon programını cihaz üzerinde yönetebilirsiniz.Stimülasyondan önce, inkübatöre geri döndürmeden önce her kuyucukta %50 ila %80 arasında uygun bir konfluens olduğundan emin olmak için transfekte edilen hücreleri bir faz-kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. Ardından, Hanks dengeli tuz çözeltisine 10 millimolar heaps ve beş millimolar glukoz ekleyerek stimülasyon ortamını hazırlayın. Real-time cyclic AMP assay substrat reaktifinin 55 microliters'lik alikotlarını buz üzerinde çözdürün.55 µL substrat reaktifi ve 2.750 µL stimülasyon ortamını karıştırarak %2'lik abrasyon çözeltisi hazırlayın. Tezgah üzerine kalın bir kağıt havlu tabakası yaydıktan sonra, transfeksiyon ortamının kağıt havlular tarafından emilmesi için plakayı ters çevirip havluların üzerine nazikçe ve tekrarlayan şekilde vurun. Her bir kuyucuğa 50 µL stimülasyon ortamı pipetleyerek hücreleri yıkayın.Stimülasyon ortamını 96 kuyucuklu plakadan hafifçe ve tekrarlayarak boşaltın. Her kuyucuğa 25 µL %2 dengeleme çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi dolmadan önce, çözülmüş koku maddesi stok çözeltilerini çalışma konsantrasyonuna ve stimülasyon ortamına seyreltin.Koku maddesi eklemeden önce, plakanın bazal lüminesans düzeyini ölçmek için bir kemilüminesans plaka okuyucu kullanın. Plakayı hızlıca plaka okuyucudan çıkarın ve her kuyucuğa 25 µL koku maddesi seyreltisi ekleyin. Ardından, 30 dakika içinde tüm kuyucukların sürekli lüminesans ölçümünü 20 döngü boyunca hemen başlatın.Gerçek zamanlı siklik AMP testi kullanılarak 379 benzersiz insan koku reseptörü, 30 mikromolar muskon karşısında tarandı. X ekseni boyunca yer alan renkli bloklar, farklı insan koku reseptörü ailelerini göstermektedir. Y ekseni, pozitif kontrol için yanıtın maksimuma ulaştığı, koku maddesi eklenmesinden 30 dakika sonraki normalize edilmiş lüminesan değerini temsil etmektedir.OR5AN1'in yanıtı belirtilmiştir. Bu şekil, farklı muskon konsantrasyonları ile OR5AN1 aktivasyonunun gerçek zamanlı ölçümlerini ve koku içermeyen negatif kontrolün sonucunu göstermektedir. Ok, koku maddesinin eklendiği zaman noktasını belirtmektedir.Burada, odorant eklemesinden 30 dakika sonra muscone'a karşı OR5AN1'in konsantrasyon yanıt eğrisi gösterilmiştir. Burada açıklanan teknik, ilk gün kültür katmanlarının stok plağı ile başlayarak toplam üç gün sürmektedir. Bir kez uzmanlaşıldığında, son günkü işlem uygun şekilde yürütülürse her bir 96 kuyucuklu plaka için üç saat içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, sonuçlardan yararlanmak için siklik AMP analizi kullanarak koku reseptörlerinin aktivasyonunun nasıl yönetileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.

Heterolog Hücreler kimyasal-duyusal reseptörleri Yüzey İfade Assaying

Bu video, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörü ve lüminesans tespiti kullanarak transfekte edilmiş hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunu ölçmek için kullanılan protokolü gösterir. Yöntem, koku alma nöronlarındaki reseptör-ligand etkileşimlerini ve sinyal yollarını incelemek için uygulanır.

Gerçek Zamanlı Döngüsel Adenozin Monofosfat Testi Kullanılarak Koku Reseptörü Aktivasyonunun Ölçülmesi

Kaynak: de March, C. A. et. al., Buhar Fazındaki Bir Koku Maddesi Tarafından Koku Reseptörü Aktivasyonunun Gerçek Zamanlı İn Vitro İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, lüminesans ölçümü kullanarak rekombinant memeli hücrelerinde koku reseptörlerinin gerçek zamanlı aktivasyonunu izleme yöntemini göstermektedir. Koku bağlanması, G-protein aktivasyonunu ve cAMP üretimini tetikler, substrat bağlanması üzerine ışıldama yayan glosensör proteinlerini aktive eder ve reseptör yanıtının kantitatif bir...

Rekombinant hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Koku reseptör aktivasyonu desenler koku kimliğini kodlamak, ancak memeli koku reseptörleri için Odorant ligandlar belirlenmesi yayınlanan verilerin eksikliği koku kodlama kapsamlı bir modelinin gelişmesini engellemektedir. Bu protokol, koku reseptör ligandları ve reseptör aktivasyonunun miktar yüksek throughput belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem tarif etmektedir.

Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Bu çalışmada sunulan protokol, cAMP Fark Dedektörünün In Situ  olarak cAMP ölçümündeki etkinliğini iki yöntemle göstermektedir. Bir yöntem, HEK-293 hücreli 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır. Diğer yöntem, bir floresan mikroskobu altında tek tek HASM hücrelerini gösterir.

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Öğrenin, canlı hücrelerde gerçek zamanlı cAMP tahlili kullanarak koku alma reseptörlerinin aktivasyonunu nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, reseptör-ligand çiftlerinin farmakolojik karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Daha fazla video keşfet