Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Bu gerçek zamanlı, yüksek verimli döngüsel AMP testinin genel amacı, koku maddelerini koku reseptörlerine karşı taramaktır ve bunun tersi de geçerlidir. Fareler, koku reseptörünün işleyişini araştırmak için yararlı olduğundan, hem koku reseptörlerinin hem de ligandların daha büyük ölçekli taramalarına ve ayrıca ilgilenilen bir reseptör-ligand çiftlerinin farmakolojik kartelizasyonlarına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, koku maddesinden reseptöre aktivasyonu verimli ve güvenilir bir şekilde değerlendirebilmemizdir.

Canlı hücreler kullanan heterolog kokudan reseptöre ekspresyon sistemi. Hücre canlılığını sağlamak ve birleşmeyi tahmin etmek için Hana3A hücrelerini bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyerek başlayın. Daha sonra hücre kültürü kabından tüm besiyerini aspire edin.

Ve plakaya 10 mililitre fosfat tamponlu salin ekleyerek, tabağı döndürerek ve PBS'yi aspire ederek hücreleri yıkayın. Ardından, üç mililitre% 0.5 tripsin-EDTA'yı plakaya ekleyin. Tripsini hücrelerin üzerinde bir dakika veya tüm hücreler yüzer hale gelene kadar bırakın.

% 10 FBS ile 5 mililitre MEM ekleyerek ve hücre kütlesi parçalarını parçalamak için yukarı ve aşağı pipetleyerek tripsini etkisiz hale getirin. Bir hücre sayımı yaptıktan sonra, 15 mililitrelik bir tüpe transfekte edilecek 96 oyuklu plaka başına 2x10'u 6. hücrelere aktarın. Stimülasyondan önce hücrelerin fazla veya az büyümesini önlemek için 96 oyuklu plaka üzerine hazırlanacak doğru hücre sayısını hesaplamanız önemlidir.

Tüpleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Ve sonra hücre paletini rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin. Her 96 oyuklu plaka için antibiyotiksiz altı mililitre ortam ekleyin ve hücre kütlesinin parçalarını parçalamak için hava kabarcıkları oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyin.

Asılı hücreleri bir rezervuara aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 50 mikrolitre hücre pipetleyin. Gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.

Transfeksiyondan önce, oyuk başına yaklaşık% 30 ila 50'lik uygun bir birleşme sağlamak için kaplanmış hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin ve ardından inkübatöre geri dönün. Koku antından reseptör yapısına, aksesuar faktör yapılarına ve döngüsel AMP biyosensör varyant yapısına etiketli satırı takip edin. Daha sonra her 96 oyuklu plaka için 500 mikrolitre MEM'de bir plazma transfeksiyon karışımı hazırlayın.

Daha sonra, 500 mikrolitre MEM içinde 18 mikrolitre lipid aracılı transfeksiyon reaktifi içeren bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. Transfeksiyon karışımını plazma karışımı ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, transfeksiyon karışımına %10 FBS içeren 5 mililitre MEM ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücre kültürü başlığına kalın bir steril kağıt havlu tabakası yayın. Kuluçka makinesinden hücreler içeren 96 oyuklu bir plaka alın.

Yavaşça ve tekrar tekrar, ortamın kağıt havlu tarafından tamamen emilmesi için plakayı kağıt havlu yığınının üzerine baş aşağı vurun. 50 mikrolitre kombine transfeksiyon karışımını 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna aktarın ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 18 ila 24 saat boyunca gece boyunca inkübe edin. Transfeksiyonu yönetebilirsiniz ve stimülasyon programı, bir deneyde birden fazla 96 oyuklu plaka test edildiğinden daha fazla cihaz üzerinde devam etmelidir, böylece tüm plakalar aynı transfeksiyon ve damıtıcı maruz kalma aralığından sonra yansıtılır.

Stimülasyondan önce, inkübatöre geri dönmeden önce kuyu başına% 50 ila% 80'lik uygun bir birleşme sağlamak için transfekte edilmiş hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. Daha sonra Hanks'in dengeli tuz çözeltisine 10 milimolar yığın ve beş milimolar glikoz ekleyerek stimülasyon ortamını hazırlayın. Gerçek zamanlı döngüsel AMP tahlili substrat reaktifi alloquats'ın 55 mikrolitre alloquat'ını buz üzerinde çözün.

55 mikrolitre substrat reaktifi ve 2.750 mikrolitre stimülasyon ortamını karıştırarak% 2 eşit abrasyon çözeltisi hazırlayın. Tezgahın üzerine kalın bir kağıt havlu tabakası yaydıktan sonra, transfeksiyon ortamının kağıt havlular tarafından emilmesi için plakayı kağıt havluların üzerine baş aşağı hafifçe ve tekrar tekrar vurun. Her bir oyuğa 50 mikrolitre stimülasyon ortamı pipetleyerek hücreleri yıkayın.

96 oyuklu plakadan stimülasyon ortamını nazikçe ve tekrar tekrar dışarı vurun. Her bir kuyucuğa 25 mikrolitre% 2 dengeleme solüsyonu pipetleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyon süresinin bitiminden önce, çözülmüş koku stok çözeltilerini çalışma konsantrasyonuna ve stimülasyon ortamına seyreltin.

Koku ilavesinden önce, plakanın bazal lüminesans seviyesini ölçmek için bir kemilüminesans plaka okuyucusu kullanın. Plakayı plaka okuyucudan hızlı bir şekilde çıkarın ve her bir oyuğa 25 mikrolitre koku seyrelticisi ekleyin. Ardından, 30 dakika içinde 20 döngü boyunca tüm kuyucukların sürekli lüminesans ölçümünü hemen başlatın.

379 benzersiz insan koku reseptörü, gerçek zamanlı döngüsel AMP testi kullanılarak 30 mikromolar kas konisine karşı tarandı. X ekseni boyunca renkli bloklar, farklı insan koku reseptörü ailelerini gösterir. Y ekseni, pozitif kontrol için yanıt maksimuma ulaştığında, koku ilavesinden 30 dakika sonra normalleştirilmiş lüminesansı temsil eder.

OR5AN1'in yanıtı belirtilir. Bu şekil, farklı kas koni konsantrasyonları ile OR5AN1 aktivasyonunun gerçek zamanlı ölçümlerini ve kokusuz bir negatif kontrolün sonucunu göstermektedir. Ok, oderant toplamanın zaman noktasını gösterir.

Burada, oderant ilavesinden 30 dakika sonra kas konuna karşı OR5AN1'in bir konsantrasyon tepki eğrisi gösterilmektedir. Burada açıklanan teknik, ilk gün bir kültür katmanları stok plakası ile başlayarak toplam üç gün sürer. Bir kez ustalaştıktan sonra, son günkü işlem, uygun şekilde yapılırsa her 96 oyuklu plaka için üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, sonuçlardan yararlanmak için döngüsel bir AMP testi kullanarak oderant reseptörlerinin aktivasyonunu nasıl yöneteceğinizi iyi anlamış olmalısınız.