Grip özgü antikor titreleri ölçmek için bir en iyi duruma getirilmiş hemaglütinasyon inhibisyon (hı) tahlil
1 Aralık 2017
Sunulan iletişim kuralları nasıl grip özgü antikor titreleri serum numuneleri grip aşısı alıcıların üzerinden ölçmek için bir hemaglütinasyon inhibisyon tahlil gerçekleştirileceğini açıklar. İlk tahlil hemaglütinasyon tarafından en iyi viral antijen konsantrasyonları belirler. İkinci tahlil hemaglütinasyon inhibisyon tarafından grip özgü antikor titreleri quantifies.
Bu hemaglütinasyon inhibisyon analizinin genel amacı, ilgilenilen spesifik virüslere karşı antikor titlerini ölçmektir. Bu yöntem, vaksinoloji alanında farklı popülasyonlar ile çeşitli yaş ve hasta grupları arasındaki aşı kaynaklı bağışıklık ve koruma hakkında temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, doğru sonuçlar vermesi ve nötralize edici antikorların varlığının hızlı bir şekilde titre belirlenmesine olanak tanımasıdır.
Bu yöntem insan antikor titresi hakkında bilgi sağlayabilse de, fare serumu antikor titresi veya kültür süpernatantları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarını uygun deneysel bilgilerle etiketleyerek başlayın. Ardından plakayı dikey konuma getirin ve alt arka titrasyon sırasının ilk kuyucuğu hariç, her kuyucuğa çok kanallı pipet kullanarak 25 µL PBS ekleyin.
İlgili taze hazırlanmış antijen çözeltisinden 50 µL'yi geri titrasyon satırının ilk kuyucuğuna, ardından RDE ile işlem görmüş serum örneklerinden 25 µL'yi üstteki on satırın ilk kuyucuklarına ekleyin. Pozitif kontrol olarak 11. satırın ilk kuyucuğuna 25 µL uygun antiserum ekleyin. Ardından, seri iki katlı dilüsyonlar gerçekleştirmek için her satırın ilk kuyucuğundan sonraki kuyucuklara 25 µL transfer edin.
Her dilüsyon adımı için pipetle 10 ila 15 kez yukarı-aşağı çekin ve son kuyucuklardaki son 25 microliters miktarını atın. Ardından, 1 ila 11 arasındaki satırların her bir kuyucuğuna 25 microliters antijen çözeltisi ve geri titrasyon satırındaki her bir kuyucuğa sadece 25 microliters PBS ekleyin. Karıştırmak için plakayı dört yanından dikkatlice 10 kez vurun.
Ardından plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca örtün. İnkübasyonun sonunda, her kuyucuğa 50 µL eritrosit solüsyonu ekleyin ve plakayı hafifçe vurarak karıştırın. Daha sonra plakayı tekrar örtün ve eritrositleri, tabloda belirtildiği üzere kullanılan türe göre inkübe edin.
Kırmızı kan hücreleri plakaya eklendikten sonra, analizde kullanılan kan tipine uygun inkübasyon süresine uyun. Çok kısa veya çok uzun süreli inkübasyon, sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açacaktır. İnkübasyonun sonunda, plaka 90 derece eğilerek 25 saniye boyunca hemaglütinasyonu değerlendirin ve plaka hâlâ eğik durumdayken her bir kuyucuğun sonucunu 96 kuyucuklu plakanın basılı bir şeması üzerine işaretleyin.
Bu deneyde, 2015-2016 influenza sezonu öncesinde influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 ve B/Massachusetts/O2/2012 içeren inaktive, trivalent influenza aşısı uygulanan 26 sağlıklı gönüllüde aşıyla indüklenen antikor yanıtı değerlendirilmiştir. A/H3N2/Switzerland/2013 ve A/H3N2/Texas/2012 virüs suşları için çapraz reaktif bir bağışıklık yanıtı gözlemlenmiş; influenza A/H3N2/Switzerland/2013'e karşı indüklenen seroproteksiyon ve geometrik ortalama hemaglütinasyon inhibisyon titreleri, influenza A/H3N2/Texas/2012'ye kıyasla anlamlı derecede düşük bulunmuştur. A/H3N2/Switzerland/2013 suşu aşının içerisinde yer almamasına rağmen, aşılamadan sonra her iki suşa karşı antikor titreleri artmıştır.
Viral hemaglütinin, eritrosit hemaglütinasyonu için türe bağlı bir potansiyel sergiler. Özellikle, gine domuzu kanı influenza B ile düzgün şekilde hemaglütine olmazken, hindi kanı yüksek titreli hemaglütinasyon potansiyeline ve düşük çapraz reaktiviteye sahiptir. Bu teknik kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde üç saat içinde tamamlanabilir.
Bu prosedür uygulanırken, virüsün hemaglütinasyonu sırasında meydana gelebilecek spesifik olmayan inhibitörleri ve spesifik olmayan bağlanmaları inaktive etmek için serumun RDE ile işlenmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Bu prosedürün ardından, bireysel patojen spesifik immünoglobulinlerin rolü hakkında ek soruları yanıtlamak için ELISA gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, viral immünoloji alanındaki araştırmacıların, farklı yaş gruplarındaki sağlıklı ve immünsüprese hastalarda aşıyla ilişkili immüniteye dair anlayışımızı geliştirmelerine yol açmıştır.
Bu videoyu izledikten sonra, influenza suşuna özgü antikor titrelerini büyük ölçekte belirlemek için hemaglütinasyon inhibisyon testi yönteminin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir bilgi sahibi olmalısınız. Viral antijenler, hayvan kanı ve insan serum örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman BSL2 laboratuvarında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, serum örneklerinden influenzaya özgü antikor titrelerini belirlemek için hemaglütinasyon inhibisyon testi gerçekleştirme protokollerini sunmaktadır. Bu yöntem, farklı popülasyonlarda aşı aracılı bağışıklılığın anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Vaksinoloji
- İmmünoloji
- Seroloji
Arkaplan
- Hemaglütinasyon inhibisyon testi, influenza'ya karşı antikor yanıtlarını ölçer.
- Aşı etkinliği ve popülasyon bağışıklığı hakkında bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, insan ve fare serumu dahil olmak üzere çeşitli örnek türlerine uygulanabilir.
- Antikor titrelerini anlamak, aşı performansının değerlendirilmesi için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Aşılanan kişilerde influenzaya özgü antikor titrelerini belirlemek.
- Farklı demografik gruplardaki bağışıklık yanıtını değerlendirmek.
- Titre tayini için hızlı ve doğru bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plaklarının deneysel bilgilerle etiketlenmesi.
- Kuyucuklara PBS eklemek için çok kanallı pipet kullanımı.
- Optimal viral antijen konsantrasyonlarını belirlemek için hemaglütinasyon gerçekleştirilmesi.
- Antikor titrelerini nicelendirmek için hemaglütinasyon inhibisyonunun yürütülmesi.
Temel Sonuçlar
- Analiz, influenza'ya karşı antikor titrelerini doğru bir şekilde nicelleştirir.
- Serum örneklerinde nötralize edici antikorların varlığını kanıtlar.
- Sonuçlar, aşı geliştirmeye ve halk sağlığı stratejilerine veri sağlayabilir.
- Yöntem, çeşitli örnek türleri ve popülasyonlar için uyarlanabilir durumdadır.
Sonuçlar
- Hemaglütinasyon inhibisyon testi, immün yanıtların ölçümü için güvenilir bir araçtır.
- Bu teknik, aşı kaynaklı bağışıklığın anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gelecekteki uygulamalar, diğer viral enfeksiyonlara ve popülasyonlara genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluk
İnfluenzaya özgü antikor titrelerinin doğru şekilde nicelendirilmesi, aşı kaynaklı immünitenin değerlendirilmesi ve preklinik ile klinik geliştirme süreçlerindeki immünojenite değerlendirmelerine yön verilmesi için temel öneme sahiptir. Hemaglütinasyon inhibisyon (HI) testi, farklı popülasyonlar genelindeki nötralize edici antikor yanıtlarını ölçmek için standartlaştırılmış ve hızlı bir yöntem sunarak, aşı geliştirme sürecindeki veri odaklı devam/durdur kararlarını destekler. Çapraz suş reaktivite analizine ve türe özgü eritrosit optimizasyonuna olanak tanıyan bu test, translasyonel immünoloji çalışmalarındaki öngörü güvenilirliğini artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Suşa özgü antikor titrerini nicelleştirerek aşı aracılı immün yanıtları sorgular ve antijenik hedeflerin mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Operasyonel Değer: Viral aglütinasyonun inhibisyonu yoluyla, temel bir influenza antijeni olan hemaglutininin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hemaglütinasyon (HA) titrasyonu yoluyla antijen konsantrasyonlarını standardize ederek, sonraki HI taramaları için tekrarlanabilir girdiler sağlar.
- Operasyonel Değer: 96 kuyucuklu formatta seri iki katlı dilüsyonlar kullanarak yüksek kapasiteli serum taramasını destekler ve assay ölçeklenebilirliğini artırır.
- Bilimsel Değer: Hayvan kırmızı kan hücrelerinin (örneğin, guinea pig, hindi) ampirik seçimi yoluyla çapraz reaktiviteyi minimize ederek, influenza B ve heterolog suşlar için assay özgünlüğünü artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Sağlıklı kohortlarda aşı kaynaklı seroproteksiyonu ve geometrik ortalama titreleri (GMT'ler) ölçerek immünojeniteye dair translasyonel biyobelirteçler sağlar.
- Operasyonel Değer: Standart titreyim eşik değerlerini kullanarak farklı yaş grupları ve hasta popülasyonları arasında immün yanıtların çapraz fonksiyonel karşılaştırılmasını sağlar.
- Bilimsel Değer: Aşı dışı suşlara (örneğin, A/H3N2/Switzerland/2013) karşı çapraz reaktif immün yanıtları tespit ederek geniş spektrumlu aşı tasarımına veri sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
HI analizi, erken keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan immünojenite iş akışına uyum sağlayarak; antijen seçimi, adjuvan optimizasyonu ve doz aralığı çalışmalarına veri sağlayan kantitatif antikor verileri sunar.
- Keşif Biyolojisi: Hemaglütinasyonun fonksiyonel antikor inhibisyonunu ölçerek aşı etkinliğinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Seri dilüsyonlardan tekrarlanabilir, kantitatif titra çıktıları sağlayarak güvenilir bileşik veya aşı adayı değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Deney grupları arasındaki immün yanıtların istatistiksel karşılaştırmasına izin veren son nokta titraları ve geometrik ortalamalar oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: İnsan deneyleri öncesinde hayvan modellerinde (örneğin, fare serumu) immünojeniteyi değerlendirerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çoklu influenza suşlarına ve aşı formatlarına uygulanabilir standart bir seroloji platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Korumanın bir korelatı olarak nötralize edici antikor titrelerini ölçerek, aşı kaynaklı bağışıklıkta öngörüsel güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış antijen hazırlama, RDE ile işlem görmüş serum ve türe özgü eritrosit inkübasyon süreleri aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Yetersiz immünojeniteyi erkenden belirleyerek karar alma süreçlerini iyileştirir ve geç aşamadaki biyolojik riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: Çapraz suş titre genişliği ve seroproteksiyon oranlarına dayanarak, aşı adaylarının risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Viral antijenlerin işlenmesi, RDE ile işlem görmüş serumların hazırlanması ve hemaglütinasyon bitiş noktalarının yorumlanması için viroloji ve seroloji alanında uzmanlık gerektirir.
- İnfluenza virüslerinin ve insan/hayvan kan ürünlerinin güvenli bir şekilde işlenmesi için BSL2 uyumlu tesislere erişime bağlıdır.
- Çapraz reaktiviteyi en aza indirmek ve türe özgü aglütinasyonu sağlamak için eritrosit kaynaklarının (örneğin; guinea pig, hindi, insan O) standardizasyonunu gerektirir.
- Yalancı negatif veya yalancı pozitif hemaglütinasyon okumalarını önlemek için eritrosit inkübasyonu sırasında hassas zamanlama kontrolleri gerektirir.
- Yalnızca fonksiyonel antikor aktivitesinin ölçümü ile sınırlıdır; tamamlayıcı analizler (örneğin; ELISA) olmadan nötralize edici olmayan veya fonksiyonel olmayan immünoglobulin sınıflarını nicelleştirmez.
