Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

Bu fraksiyonasyon protokolünün genel amacı, insan ölüm sonrası beyin dokusundan deterjanda çözünmeyen protein agregatlarını zenginleştirmektir. Dolayısıyla bu yöntem, hastalıkta yanlış katlanmış protein agregatlarının tanımlanması ve karakterizasyonu gibi nörodejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deterjanda çözünmeyen protein agregatlarının kısa bir zaman dilimi içinde beyin dokusundan fasyal olarak zenginleştirilmesi ve izole edilmesidir.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Tram Nguyen olacak. Sağlıklı kontrolden donmuş postmortem beyin dokusu elde edin ve patolojik olarak doğrulanmış AD. Her doku örneğinden yaklaşık 250 miligram gri madde parçalarını çıkarmak için forseps ve tıraş bıçağı kullanın. Beyin segmentinin bir dakika çözülmesine izin verin.

Şimdi, bir doku parçasını çözülürken kabaca iki milimetre küp küp parçalar halinde doğrayın. Buz üzerinde iki mililitrelik önceden soğutulmuş Dounce homojenizatör tüpüne aktarın. Beyaz maddeden ve büyük kan damarlarından kaçınmayı unutmayın.

Hızlı çalışın ve mendili TARE tek kullanımlık tartım botlarına yerleştirin. Beyin dokusunun bulunduğu tartı teknesini sık sık kuru buzlu polistiren kaplara yerleştirerek dokunun çözülmesini önlemeye özen gösterin. Gerekli tüm doku parçalarını inceledikten ve tarttıktan sonra, kuru buzdan bir parça doku içeren bir tartı teknesini çıkarın.

Daha sonra, bir gram doku başına proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile beş mililitre buz gibi düşük tuzlu tampon ekleyin ve yaklaşık 10 vuruş yüksek boşluklu havaneli A ve 15 vuruş düşük boşluklu havaneli B kullanarak buz üzerinde homojenize edin. Kalan homojenatı, eksi 80 santigrat derecede saklamak için benzer şekilde ek etiketli 1,5 mililitrelik tüplere ayırın. Fraksiyonlamaya devam etmek için, her 0.8 mililitrelik alikotuna 100 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 100 mikrolitre yüzde 10 sarkosil ekleyin.

Ters çevirerek iyice karıştırın. Ve sonra 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, yüzde 30 genlikte üç adet beş saniyelik darbe vermek için bir mikrotip probu ile donatılmış bir sonikatör kullanın.

Homojenatların protein konsantrasyonlarını belirlemek için bikinkoninik asit yöntemini kullandıktan sonra, her numuneye mililitre başına 10 miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren buz gibi soğuk sark tamponu ekleyin. Daha sonra her numunenin 500 mikrolitresini 500 mikrolitrelik polikarbonat ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri önceden soğutulmuş bir rotora yükleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 180.000 kez g'de ultrasantrifüj edin.

Santrifüjlemeyi takiben, S1 sarkosilde çözünür süpernatanları 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Deterjanda çözünmeyen P1 fraksiyonlarını içeren ultrasantrifüj tüplerine 200 mikrolitre sark tamponu ekleyin ve peletleri ultrasantrifüj tüplerinin altından çıkarmak için pipet ucunu kullanın. Daha sonra, yeniden askıya alınmış P1 peletlerini yeni 500 mikrolitrelik ultrasantrifüj tüplerine aktarın, çift dengeleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika daha 180.000 kez g'de santrifüjleyin.

S2 süpernatantını atın. Daha sonra sarkosilde çözünmeyen peletlere proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile 50 ila 75 mikrolitre üre tamponu ekleyin ve P2 peletini çözündürmek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yeniden askıya alınmış P2 peletlerini etiketli 0.5 mililitrelik tüplere aktarın ve yüzde 20 genlikte kısa bir saniyelik mikrotip sonikasyon kullanarak peletleri tamamen çözündürün.

BCA tahlil yöntemini kullanarak sarkosilde çözünen ve sarkosilde çözünmeyen fraksiyonların protein konsantrasyonlarını belirleyin. Toplam homojenat, sark-çözünür S1 ve sark-çözünmeyen P2 fraksiyonlarından oluşan 40 mikrogramlık numuneleri, pH yedi'de beş milimolar TCEP ile bir x Laemmli SDS-PAGE numune tamponunda hazırlayın. Numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Numuneleri prekast 10 kuyulu dört ila yüzde 12 Bis-Tris SDS-PAGE jellerine yükleyin. İlk santimetre için 80 voltta ve yaklaşık bir saat boyunca 120 voltta veya izleme boyası jelin dibine ulaşana kadar elektroforez. Prekast jel kasetlerini damıtılmış suya batırın ve ardından açmak için yeni bir tıraş bıçağı ve jel bıçak kullanın.

Tarakları ve her bir jelin en altını yeni bir tıraş bıçağıyla nazikçe kesin. Bir kurutma makinesinde kuru transfer yöntemi kullanarak 0.2 mikron nitroselüloz membranlara aktarın. Transferden sonra, membranları 30 dakika boyunca Tween-20 olmadan bloke edici tamponda bloke edin, ardından 30 dakika boyunca yüzde 0.5 Tween-20 ile bloke edici tampon uygulayın.

Blokajdan sonra, fazla blokaj tamponunu çıkarmak için TBS'deki membranları yüzde 0.1 Tween-20 ile beş dakika boyunca durulayın. Yüzde 0.5 Tween-20 ile bloke edici tamponda primer antikorların 1: 1.000 dilüsyonunu hazırlayın. Burada fosfo-Tau pT231 ve EEA1 kullanılmaktadır.

Membranları birincil antikor çözeltisi içinde gece boyunca dairesel çalkalama ile dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, TBS'deki zarları yüzde 0.1 Tween-20 ile her biri 15 dakika boyunca üç kez durulayın. Membranları, floresan etiketli yakın kızılötesi ikincil antikorun 1:20.000 oranında seyreltilmesi ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında karanlıkta 60 dakika boyunca yüzde 0.5 Tween-20 ile bloke edici tampon ile araştırın.

İnkübasyondan sonra, zarı TBS'de 10 dakika boyunca üç kez, yüzde 0.1 Tween-20 ile ve TBS'de iki kez her seferinde beş dakika boyunca durulayın. Kullanılan ikincil antikor için uygun uyarma dalga boyunda bir kızılötesi görüntüleme sistemi kullanarak zarı tarayın. Bu Coomassie lekeli jel, TH-S, S1, S2 ve P2 fraksiyonlarından 20 mcg protein gösterir.

Western blot analizi, AD beyninde, sarkosil fraksiyonlarında sarkosil-çözünmeyen ve çok az fosfo-Tau ile patolojik yüksek moleküler ağırlıklı fosforile Tau agregatlarının kaldığını açıkça göstermektedir. EEA1, hem kontrol hem de AD beyninde doğal olarak sarkosilde çözünen ve S1 fraksiyonuna bölünen çoğu doğal patolojik olmayan protein için genel bir belirteç olarak kullanıldı. Özellikle, çözünebilir fraksiyonda EEA1 için TH-S fraksiyonuna kıyasla biraz daha az sinyal vardı, bu da küçük bir EEA1 havuzunun muhtemelen sarkosil-çözünmez olduğunu, ancak bu özel antikor ile western blot tarafından tespit sınırının altında olduğunu gösteriyor.

Bu şekil, tek aşamalı veya çok aşamalı bir fraksiyonasyon protokolü kullanılarak patolojik AD proteinlerinin proteomik analizini göstermektedir. Tek aşamalı fraksiyonlama tekniği, genel numune kayıpları önemli ölçüde azaldığından, düşük bolluktaki proteinler için avantajlı olabilir. Bu prosedürü denerken, beyin dokusundan mümkün olduğunca fazla beyaz maddeyi çıkarmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, dejeneratif hastalıklarında patolojik agregatların çekirdek protein bileşenlerini tanımlamak ve karakterize etmek için kütle spektrometresi tabanlı proteomik gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.