ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması Saccharomyces cerevisiae

Bu prosedürün genel amacı, formaldehit çapraz bağlama, kromatin çözündürme veya antikorlara ihtiyaç duymadan, yüksek çözünürlüklü ve düşük arka plana sahip yerinde protein-DNA etkileşimlerinin genom çapında haritalarını oluşturmaktır. Bu yöntem, gen düzenleyici bölgelere göre çeşitli düzenleyici faktörlerin kromatin ile nerede ilişkili olduğu gibi transkripsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ihmal edilebilir bir arka plana sahip yüksek çözünürlüklü genomik bağlanma haritaları sağlaması ve standart ChEC-seq protokolleriyle ilişkili sınırlamalardan kaçınmasıdır.

Prosedürü göstermek, Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'nden meslektaşım Sebastian Grunberg olacak. Deneyden önceki günün öğleden sonra veya akşamı, deneysel kullanım suşunun bir ön kültürünü başlatın. Üç mililitre kullanılmış pepton dekstrozu veya MNase etiketli faktörü taşıyan tek bir suş kolonisi ile uygun bir seçici ortamı aşılayın.

Bu kültürü gece boyunca 30 santigrat derece çalkalayıcı inkübatörde inkübe edin. Ertesi sabah, gece boyunca kültürü 50 mililitre ortaya, 600 nanometre 0.2 ila 0.3'te bir optik yoğunluğa seyreltin. Kültürü, 600 nanometrede 0,5 ila 0,7 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar çalkalayıcı inkübatörde inkübe edin.

Gerekli miktarda Tampon A plus katkı maddesi hazırlayın ve işlem sırasında oda sıcaklığında tutun. Numune toplama için mikrofüj tüpleri hazırlayın. Analiz edilen her yeni faktör için, kalsiyum ilavesi olmadan numune toplayın ve kalsiyum ilavesinden 30 saniye, bir dakika, 2,5 dakika, 5 dakika ve 10 dakika sonra ekleyin.

Her tüpe 90 mikrolitre durdurma çözeltisi ve 10 mikrolitre% 10 SDS ekleyin. Kültür, 0,5 ila 0,7 arasında 600 nanometrede bir optik yoğunluğa ulaştığında, kültürü 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca 1.500 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, hücreleri bir mililitre Tampon A'da iyice yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir mikrofüj tüpüne aktarın.

Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.500 kez g'de bir mikrofüje peletleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri bir mililitre Tampon A'da yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.500 kez g'de peletleyin.

Süpernatanı çıkarın, hücreleri bir mililitre Tampon A'da yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri 570 mikrolitre Tampon A'da iyice yeniden süspanse edin. Hücrelerin geçirgenleşmesini kolaylaştırmak için 30 mikrolitre% 2 digitonin ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Hücreleri beş dakika boyunca 30 santigrat derecede bir ısı bloğunda geçirgenleştirin.

Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için reaksiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin. Negatif bir kontrol olarak, 100 mikrolitrelik geçirgen hücrelerin alikotunu, durdurma çözeltisi ve SDS içeren bir mikrofüj tüpüne aktarın ve karıştırmak için kısaca girdaplayın. Zaman seyrine başlamadan önce, erken zaman noktalarının verimli bir şekilde toplanabilmesi için durdurma çözeltisi tüplerinin, pipetin, pipet uçlarının ve ısı bloklarının yanında bir zamanlayıcının bulunması çok önemlidir.

Zaman seyrini başlatmak için, MNaz'ı aktive etmek için geçirgen hücrelere 1.1 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez hızlı bir şekilde ters çevirin. Karışık reaksiyonu hemen 30 santigrat dereceye getirin ve bir zamanlayıcı başlatın. Toplanacak her zaman noktasında, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için reaksiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından 100 mikrolitrelik geçirgen hücrelerden oluşan bir alikotu durdurma çözeltisi ve SDS içeren bir mikrofüj tüpüne çıkarın.

Karıştırmak için kısaca girdap. Tüm zaman noktaları toplandıktan sonra, her numuneye mililitre proteinaz K başına dört mikrolitre 20 miligram ekleyin. Karıştırmak için kısa bir süre girdap yapın ve 55 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Her numuneye 200 mikrolitre fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, karıştırmak için kuvvetlice girdap yapın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın. 30 mikrogram glikojen ve 500 mililitre% 100 etanol ekleyin.

Karıştırmak için kuvvetlice girdap yapın ve kuru buz üzerinde 10 dakika veya çözelti viskoz olana kadar çökeltin. Çökeltilmiş DNA'yı maksimum hızda santrifüjleyerek ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece ile peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve her peleti bir mililitre oda sıcaklığında% 70 etanol ile yıkayın.

Etanolü boşaltın ve kalanını ters çevirerek ve tüpleri bir kağıt havluya hafifçe vurarak çıkarın. Numuneleri tezgah üstü bir santrifüj kullanarak kısa bir süre döndürün, ardından peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek kalan ehtanol'ü çıkarmak için bir pipet kullanın. Peletleri oda sıcaklığında beş dakika havayla kurutun.

DNA peletleri kururken, peletler kuruduktan sonra yeniden süspanse etmek için bir Tris tamponu ve RNase A ana karışımı yapın ve karıştırmak için girdap yapın. Her kurutulmuş DNA peletine 30 mikrolitre RNase A çözeltisi ekleyin, karıştırmak için girdap yapın ve RNa'yı sindirmek için 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 20 dakika sonra, bir mikrolitre 6X DNA yükleme boyasını her numuneden beş mikrolitre ile karıştırın ve 40 dakika boyunca 120 voltta% 1.5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın.

Her numuneye bir polietilen glikol çözeltisi içinde 75 mikrolitre SPRI boncuk ekleyerek boyut seçim prosedürüne başlayın. Boncukları ve DNA karışımını karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. SPRI boncuk inkübasyonu sırasında, her numune için 96 mikrolitre 10 milimolar Tris pH 8.0 ve dört mikrolitre beş molar sodyum klorür içeren mikrofüj tüpleri hazırlayın.

Boncukları ve DNA karışımını içeren tüpleri, tüpün yan tarafındaki boncukları toplamak için iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, ardından her bir süpernatanı Tris ve sodyum klorür içeren yeni bir tüpe aktarın. Her numuneye 200 mikrolitre fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, karıştırmak için girdap yapın ve oda sıcaklığında maksimum hızda beş dakika santrifüjleyin. Her sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın, 30 mikrogram glikojen ve 500 mikrolitre% 100 etanol ekleyin.

DNA'yı kuru buz üzerinde 10 dakika veya çözelti viskoz olana kadar çökeltin. Çökeltilmiş DNA'yı 10 dakika boyunca maksimum hızda ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve her peleti bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın.

Etanolü boşaltın, kalanını tüpleri ters çevirerek ve bir kağıt havluya hafifçe vurarak çıkarın. Numuneleri tezgah üstü bir santrifüj kullanarak kısa bir süre döndürün ve peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Peletleri oda sıcaklığında beş dakika havayla kurutun.

Her kurutulmuş peleti 25 mikrolitre Tris pH 8'de yeniden süspanse edin. Yüksek hassasiyetli bir tahlil kullanarak her bir numunenin konsantrasyonunu belirleyin. Nükleozom tükenmiş bölgeleri bağlayan genel bir düzenleyici faktör olan Reb1'in kromatin endojen bölünme analizinden elde edilen DNA'nın agaroz jel elektroforezi, bulaşma ile belirtildiği gibi zaman içinde DNA parçalanmasında kalsiyuma bağlı bir artış ve genomik DNA'nın nihai olarak tamamen sindirilmesini ortaya çıkarır.

Bir Reb1 kromatin endojen bölünme dizileme deneyinden parça uçlarının görselleştirilmesi, 30 saniyelik kalsiyum tedavisinden sonra serbest MNaz suşundan türetilen Reb1'in arka plan üzerinde sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ortaya koymaktadır. Benzer şekilde, aracı alt birim Med8'in MNaz ile füzyonu ile önemli DNA bölünmesi gözlendi, ancak kalsiyum ilavesinden bir dakika sonra Med8 promotörü tarafından yönlendirilen serbest MNaz gözlenmedi. Reb1 kromatin endojen bölünme dizileme verilerini kromatin immünopresipitasyon ve yüksek verimli dizileme verileriyle karşılaştırmak için, organik yöntemle belirlenen 1.992 Reb1 tepe noktası motif merkezlendi ve motif orta noktası etrafındaki 100 baz çifti penceresinde her bir taban pozisyonundaki ortalama parça uç sayısı belirlendi.

Çarpıcı bir asimetri ve bölünme gözlendi ve Reb1-MNase tarafından serbest bırakılan parça uçlarının çoğunluğu motifin yukarı akış tarafına eşlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa tam bir iş günü içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, doğru pipetleme ve işleme sürelerini sağlamak için paralel olarak test edilen numune sayısını sınırlamayı unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, transkripsiyon alanındaki araştırmacıların, ilk kez, mayadaki DNA bağlayıcı olmayan, megadalton büyüklüğünde bir protein kompleksinin genomik ilişkisini açık bir şekilde karakterize etmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, tomurcuklanan maya genomundaki protein bağlama bölgelerinin genom çapında haritalanması için ChEC-Seq yönteminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.