Yenidoğan hipoksik-iskemik beyin hasarı, fare modeli neurobehavioral değerlendirmesi
24 Kasım 2017
Tek taraflı Karotis arter tıkanıklığı postnatal gününde gerçekleştirilen 7-10 CD-1 fare pups yenidoğan hipoksik-iskemik (hı) model oluşturmak ve HI beyin hasarı etkileri araştırıldı. Neurobehavioral işlevleri olmayan çalışan normal farelere göre bu farelerde görmüştük.
Kognitif ve motor testlerin ardından uygulanan hipoksik-iskemik neonatal beyin hasarı cerrahisinin genel amacı, bu tür yaralanmaları ve ilgili beyin hasarını incelemek için bir fare modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, bu tür yaralanmaların motor ve kognitif fonksiyonları nasıl etkilediği gibi neonatal hipoksik-iskemik beyin hasarına ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iyi bilinmesi ve yaygın olarak kullanılmasıdır.
Aynı zamanda serebral palsi ve neonatal inmeler için de bir preklinik modeldir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sağ tek taraflı karotis arterini belirlemek zor olduğu için güçlük çekeceklerdir. Prosedürü benimle birlikte laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Yoon-Kyum Shin uygulamalı olarak gösterecektir.
En az beş adet P-yedi fare yavrusu anesteziye alındıktan sonra, bir yavruyu karnı yukarı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Ardından, boyun bölgesini alkol ile temizleyin. Cerrahi işleme başlamak için, makas kullanarak boyun bölgesinde 0,7 mm'lik bir insizyon yapın.
Ardından, tek taraflı sağ karotis arteri açığa çıkana kadar adipoz dokuyu pens yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın. Sonra, 5-0 sütür kullanarak tek taraflı sağ karotis arterini bağlayın. Şimdi, boyundaki insizyonu 5-0 naylon ile dikin ve insizyon bölgesini sterilize edin.
Ardından, yavrunun kapağı açık bir 37 °C hipoksik oda içerisinde yaklaşık bir saat boyunca iyileşmesini bekleyin. İyileşmesi için cerrahi işlem uygulanmış başka bir fareyi hipoksik odaya yerleştirin. Yavruların tamamı tamamen uyandığında, oda kapağını kapatın ve hipoksik koşulları oluşturmak için gaz seviyelerini düşürün.
90 dakikalık hipoksiden sonra, beyin hasarı oluşmuş yavruları kafeslerine geri koyun. Bir hafta sonra, hasarın kanıtlarını incelemek için yavruları daha önce olduğu gibi cerrahiye hazırlayın. Sağ hemisferin posterolateral bölgesindeki beyin lezyonunu belirlemek için saçlı deride bir insizyon yapın.
Kortikal yaralanma ve hipokampal yaralanma kanıtları için yarı saydam kafatası üzerinden inceleme yapın. Buna göre, yavruları yaralanmış veya yaralanmamış kontrol grupları olarak kategorize edin. Kontrol işleminin ardından, kafa derisini sütür ile kapatın ve insizyon bölgesini sterilize edin.
Fareler altı haftalık olduğunda, belleklerini bir uyaranın öğrenilmesi ve ondan kaçınma durumuna göre değerlendirin. Bu görev için ticari, iki bölmeli, geçişli pasif kaçınma düzeneği kullanın. Başlamak için, bir fareyi kutunun aydınlık bölmesine 30 saniye boyunca yerleştirin.
Ardından, bölmeler arasındaki kapıyı açın ve hayvanın karanlık bölmeye girme süresini kaydedin. Görevin gerçekleştirilmesi için 300 saniyeye kadar süre tanıyın. Farenin dört uzvunun tamamı karanlık bölmeye girdiğinde kapıyı kapatın.
Ardından, iki saniye boyunca 1/2 mA elektrikli ayak şoku uygulayın ve fareyi kafesine geri koyun. 24 saat sonra testi tekrarlayın. Bu kez, fareye karanlık bölmeye geçmesi için tam 300 saniye süre tanıyın ve fareye şok uygulamayın.
Motor fonksiyonlardaki hafif bozulmaları ayırt etmek için altı haftalık farelere, hem kalitatif hem de kantitatif analizler kullanarak merdiven yürüyüş testi uygulayın. Öncelikle merdiven düzeneğini kurun ve ardından farenin düzenek üzerindeki ekstremite hareketlerini kaydetmek için bir video kamera yerleştirin. Sonrasında, bir fareyi başlangıç paneline yerleştirin ve video kamera ile kayda başlayın.
Videonun bacakları net bir şekilde gösterdiğinden emin olun. Fare, merdiven düzeneğinin son paneline dokunduğunda kaydı durdurun. Ardından, fareyi başlangıç paneline geri götürün ve farenin düzeneği tekrar geçişini kaydedin.
Her deneme tarihinde, fare başına bu işlemi toplam dört kez tekrarlayın. Daha sonra, videoyu analiz ederken, videoyu 1/10 hızında oynatarak her bir ekstremitenin yaptığı kayma sayısını manuel olarak sayın. Bir ekstremitenin çubuklar arasından kayması, bir kayma olarak kabul edilir.
Fareler altı haftalık olduğunda, kavrama güçlerini değerlendirin. Tamamı bir panele sabitlenmiş, iki milimetre çapında üçgen bir tele monte edilmiş bir itme/çekme gerinim ölçer (strain gauge) kullanın. Fareyi kuyruğundan tutarak panel üzerine yerleştirin.
Ardından, farenin ön bacaklarıyla metal tele sadece ulaşmasına izin verin. Fareler teli kavrar kavramaz, tutuşlarını bırakana kadar kuyruğunu nazikçe çekin. Aparat, tel üzerindeki peak force değerini gram cinsinden kaydedecektir.
Fareye dinlenme süresi vermeden önce bu testi beş kez tekrarlayın. Kavrama gücü testi sırasında, doğru performansların belirgin hareketleri gözlemlenir. Fareyi kas yorgunluğunu azaltmak için en az bir dakika dinlendirmeden önce, beş deneme boyunca bu hareketleri tespit etmeye çalışın.
Fare en az bir dakika dinlendikten sonra, beş denemelik seriyi tekrarlayın. Ardından, fareye bir dinlenme süresi daha verin ve o test günü için seriyi son bir kez daha gerçekleştirin. Analiz için, veriler arasından tek bir ön bacak veya her iki ön bacak için elde edilen en yüksek üç skorun ortalamasını kullanın.
14 haftalık hipoksi-iskemi hasarlı hayvanların beyinleri hasat edildikten sonra, beyinler morfolojik olarak kortikal hasarın olmadığı, hafif hasarlı veya şiddetli hasarlı şeklinde değerlendirildi. Aynı hayvanlar bir hafta önce MRI ile taranmıştı ve bu sonuçlar da oldukça açıklayıcıydı. Morfolojik olarak normal görünen beyinde bile hippokampusta hafif hasar izlendi.
Altı haftalık olduklarında, yani yaralanmadan beş hafta sonra, fareler çeşitli davranışsal görevlerle değerlendirildi. Hipoksi-iskemi yaralanmalı fareler, 24 saatlik pasif kaçınma görevinde bilişsel bozukluk gösterdiler. Sadece sağ hemisfer hasar gördüğü için, fareler hemiplejik motor fonksiyonlar sergilediler.
Bu durum, her bir ön bacak için merdivenin enine basamaklarındaki kayma yüzdesindeki farkla ortaya konmuştur. Ayrıca, kavrama gücü beyindeki motor korteksi içerdiğinden, normal ve kortikal yaralanma grupları kavrama gücünde farklılıklar göstermiştir. Normal kontroller ile kategorik olarak yaralanmamış fareler arasında herhangi bir fark gözlemlenmemiş, ancak yaralı farelerin belirgin şekilde yetersiz olduğu görülmüştür.
Bu videoyu izledikten sonra, neonatal hipoksik-iskemik fareler oluşturmak için tek taraflı sağ karotis arterinin nasıl ligat edileceği ve takip davranış analizlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Yaralanmadan yedi gün sonra kortikal beyinde görünür bir hasar olmasa bile, bir MRI'ın hipokampal hasarı ortaya çıkarabileceğini belirtmek önemlidir. Ayrıca, yavrulara nazik davranmayı ve cerrahi işlemi mümkün olduğunca hızlı tamamlamayı hatırlamak önemlidir.
Yavruların derileri çok zayıf ve incedir, bu nedenle çok dikkatli olun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir fare modelinde neonatal hipoksik-iskemik (HI) beyin hasarının etkilerini incelemektedir. HI modelini oluşturmak ve nörodavranışsal fonksiyonların değerlendirilmesine olanak sağlamak amacıyla, postnatal 7-10. günlerdeki CD-1 fare yavrularına unilateral karotis arter oklüzyonu uygulanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Neonatal beyin hasarı
- Motor ve bilişsel fonksiyon değerlendirmesi
Arka Plan
- Neonatal hipoksik-iskemik beyin hasarı, pediatrik sağlıkta önemli bir sorundur.
- Bu model, söz konusu hasarların beyin gelişimi üzerindeki etkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
- Serebral palsi ve neonatal inmeler gibi durumlar için preklinik bir model görevi görür.
- Doğru karotis arterinin belirlenmesi, tekniğe yeni başlayanlar için zorlayıcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Neonatal HI beyin hasarını incelemek için güvenilir bir fare modeli oluşturmak.
- HI'nın farelerdeki motor ve bilişsel fonksiyonlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek.
- Neonatal beyin hasarları için potansiyel terapötik yaklaşımlara dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare yavrularında unilateral karotis arter oklüzyon cerrahisi.
- Cerrahi sonrası nörodavranışsal fonksiyonların değerlendirilmesi.
- Operasyon uygulanan farelerin operasyon uygulanmamış kontrollerle karşılaştırılması.
- Prosedür gösterimi için lisansüstü öğrencilerle iş birliği.
Temel Sonuçlar
- CD-1 farelerde neonatal HI modelinin oluşturulması.
- Nörodavranışsal fonksiyonlardaki anlamlı farklılıkların belirlenmesi.
- HI'nın motor ve bilişsel gelişim üzerindeki etkilerine dair öngörüler.
- Modelin, neonatal beyin hasarları üzerine yapılacak gelecekteki araştırmalar için doğrulanması.
Sonuçlar
- Unilateral karotis arter oklüzyonu, neonatal HI modellemek için etkili bir yöntemdir.
- Bu model, terapötik stratejilere yönelik daha ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.
- Nörodavranışsal sonuçların anlaşılması, neonatal beyin yaralanmalarının ele alınması açısından kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Alaka
Bu neonatal hipoksik-iskemik fare modeli, serebral palsi ve neonatal inme ile ilgili motor ve bilişsel eksikliklerin değerlendirilmesi için preklinik bir sistem sağlar. Davranışsal değerlendirmeler, sağ hemisfer hasarını fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek terapötik adayların mekanistik olarak risklerinin azaltılmasına olanak tanır. Model, nörodejeneratif hastalık araştırmalarında hedef doğrulamayı ve assay geliştirmeyi destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hemiplejik motor disfonksiyon ve bilişsel bozuklukla ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Neonatal beyin hasarı yolaklarında fonksiyonel hedef doğrulaması için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Öngörücü Değer: Kortikal hasar şiddetini motor ve bilişsel test sonuçlarıyla ilişkilendirerek öngörüsel güvenilirliği destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik taramaları için standartlaştırılmış nörodavranışsal çıktılar (pasif kaçınma latansı, merdiven kayma sayıları, kavrama gücü) üretir.
- Kantitatif Ölçüm: Yüksek çıktılı davranışsal analize uygun, tekrarlanabilir ve ölçülebilir uç noktalar sağlar.
- Tarama Uygunluğu: Nöroprotektif veya nörorestoratif ajanların ileri aşama değerlendirmeleri için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Serebral palsi ve neonatal inme gibi insan neonatal hipoksik iskemik (HI) durumlarını, motor defisitlerdeki yüz geçerliliği ile modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Klinik gözlemlerle uyumlu bilişsel ve motor fenotipleme kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya geçiş sağlayan bir köprü kurar.
- Riskle Uyumlu Kararlar: MRI ile korele davranışsal fenotipler aracılığıyla yaralanma şiddetini nicelendirerek, devam/durdurma (go/no-go) kriterlerini bilgilendirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Model, hedef validasyonundan preklinik etkinlik testlerine kadar olan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak nörodavranışsal iyileşmenin boylamsal değerlendirilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Hipoksik-iskemik kaskadlarda yer alan hedeflerin yolak aydınlatılmasını ve biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için standardize motor ve bilişsel okumalarla analiz hazır fenotipler sunar.
- Analitik: Gruplar arası karşılaştırma ve etki büyüklüğü hesaplaması için kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (latans, kayma sıklığı, kavrama kuvveti) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: MRI ile doğrulanmış hasar sınıflandırması ve boylamsal davranışsal izleme yoluyla preklinik sürekliliğe bağlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Nörodejeneratif ve gelişimsel hasar programları genelinde çoklu terapötik modalitelerin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Unilateral karotis ligasyonunu hemisfer spesifik fonksiyonel defisitlerle ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar arası standartlaştırılmış cerrahi ve davranışsal protokoller aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Motor ve bilişsel etkinliğe dair erken öngörücü sinyaller sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hasar açısından eşleştirilmiş kohortlardaki davranışsal iyileşmeye dayalı olarak, adayların risk ayarlı önceliklendirmesini mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- Neonatal kemirgen cerrahisi ve mikrosirürjik damar ligasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Tutarlı yaralanma indüksiyonu için hipoksik chamber ekipmanına ve hassas gaz regülasyonuna bağımlıdır.
- Kayma sayımı ve latans ölçümünde gözlemci yanlılığını önlemek için körlenmiş davranışsal testler gereklidir.
- Davranışsal aparatın, altı haftalık farelerin boyutuna ve motor kapasitesine göre uyarlanması gerekir.
- Yaralanma penetransındaki değişkenlikle sınırlıdır; bu durum, kohort stratifikasyonu için post-operatif MRI veya morfolojik tarama yapılmasını zorunlu kılar.
