Yenidoğan hipoksik-iskemik beyin hasarı, fare modeli neurobehavioral değerlendirmesi
24 Kasım 2017
Tek taraflı Karotis arter tıkanıklığı postnatal gününde gerçekleştirilen 7-10 CD-1 fare pups yenidoğan hipoksik-iskemik (hı) model oluşturmak ve HI beyin hasarı etkileri araştırıldı. Neurobehavioral işlevleri olmayan çalışan normal farelere göre bu farelerde görmüştük.
Hipoksik-iskemik neonatal beyin hasarı cerrahisinin genel amacı, ardından bilişsel ve motor testler, bu tür yaralanmaları ve ilgili beyin hasarını incelemek için bir fare modeline sahip olmaktır. Bu yöntem, bu tür yaralanmaların motor ve bilişsel işlevleri nasıl etkilediği gibi yenidoğan hipoksik-iskemik beyin hasarı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iyi bilinmesi ve yaygın olarak kullanılmasıdır.
Aynı zamanda serebral palsi ve yenidoğan felçleri için klinik öncesi bir modeldir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, tek taraflı sağ karotis arterin tanımlanması zor olduğu için mücadele edecektir. Prosedürü kendimle birlikte gösteren, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yoon-Kyum Shin olacak.
En az beş P-yedi fare yavrusunu uyuşturduktan sonra, bir yavruyu karın yukarı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altında konumlandırın. Ardından boynu alkolle temizleyin. Ameliyata başlamak için, boyuna 0,7 milimetrelik bir kesi yapmak için makas kullanın.
Ardından, tek taraflı sağ karotis arter açığa çıkana kadar forseps kullanarak yağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Daha sonra, 5-0'lık bir sütür kullanarak, tek taraflı sağ karotis arteri bağlayın. Şimdi boyundaki kesiyi 5-0 naylon ile dikin ve kesiyi sterilize edin.
Ardından, yavrunun kapağı açık olarak 37 santigrat derecelik bir hipoksik odada yaklaşık bir saat iyileşmesine izin verin. İyileşmek için cerrahi olarak manipüle edilmiş başka bir fareyi hipoksik odaya yerleştirin. Yavruların hepsi tamamen uyandığında, hazne kapağını kapatın ve hipoksik koşullar oluşturmak için gaz seviyelerini azaltın.
90 dakikalık hipoksiden sonra, beyin hasarı görmüş yavruları kafeslerine geri koyun. Bir hafta sonra, yaralanmanın kanıtını aramak için yavruları daha önce olduğu gibi ameliyata hazırlayın. Sağ hemisferin posterolateral bölgesindeki beyin lezyonunu tanımlamak için kafa derisinde bir kesi yapın.
Kortikal yaralanma ve hipokampal yaralanma kanıtı için yarı saydam kafatasına bakın. Bu nedenle, yavruları yaralı veya yaralanmamış kontroller olarak sınıflandırın. Kontrol ettikten sonra kafa derisini dikişle kapatın ve kesiyi sterilize edin.
Fareler altı haftalık olduklarında, olumsuz bir uyaranın öğrenilmesi ve önlenmesine dayalı olarak hafızalarını değerlendirin. Bu görev için ticari iki bölmeli, kademeli bir pasif kaçınma aparatı kullanın. Başlamak için, bir fareyi 30 saniye boyunca kutunun parlak bölmesine yerleştirin.
Ardından, bölmeler arasındaki kapıyı açın ve karanlık bölmeye girmek için hayvanın gecikmesini kaydedin. Görevi gerçekleştirmek için 300 saniyeye kadar bekleyin. Farenin dört uzvu da karanlık bölmenin içine tamamen girdiğinde, kapıyı kapatın.
Ardından, iki saniye boyunca 1/2 miliamperlik bir elektrik ayak şoku uygulayın ve fareyi kafesine geri koyun. 24 saat sonra testi tekrarlayın. Bu sefer, farenin karanlık odaya girmesi için tam 300 saniye bekleyin ve fareyi şok etmeyin.
Hem kalitatif hem de kantitatif analizler kullanarak motor fonksiyondaki ince rahatsızlıkları ayırt etmek için altı haftalık fareler üzerinde merdiven yürüme testini gerçekleştirin. Önce merdiven aparatını kurun ve ardından aparat üzerinde bir farenin uzuv hareketlerini kaydetmek için bir video kamera kurun. Ardından, fareyi başlangıç paneline yerleştirin ve video kamerayla kayıt yapmaya başlayın.
Videonun bacakları iyi odaklanmış olarak gösterdiğinden emin olun. Fare merdiven aparatının son paneline dokunduğunda kaydı durdurun. Ardından, fareyi başlangıç paneline geri getirin ve farenin cihazı tekrar geçtiğini kaydedin.
Bunu her deneme tarihinde fare başına toplam dört kez yapın. Daha sonra videoyu analiz ederken, videoyu 1/10 hızında oynatırken her bir uzuv tarafından yapılan kayma sayısını manuel olarak sayın. Bir uzuv çubuklar arasında kaydığında, bu bir kayma oluşturur.
Fareler altı haftalık olduğunda, kavrama güçlerini değerlendirin. Tümü bir panele sabitlenmiş iki milimetre çapında üçgen bir tele takılmış bir itme/çekme gerinim ölçer kullanın. Fareyi kuyruğundan tutarak panelin üzerine yerleştirin.
Ardından, farenin ön ayaklarıyla metal tele ulaşmasına izin verin. Fareler teli kavrar kavramaz, kavrayışını serbest bırakana kadar kuyruğunu yavaşça çekin. Cihaz, tel üzerindeki tepe kuvvetini gram cinsinden kaydedecektir.
Fareyi dinlendirmeden önce bu testi beş kez tekrarlayın. Kavrama gücü testi sırasında, doğru performansların göze çarpan hareketleri vardır. Kas yorgunluğunu azaltmak için fareyi en az bir dakika dinlendirmeden önce beş çaba boyunca bu hareketleri bulmaya çalışın.
Fare en az bir dakika dinlendikten sonra, beş deneme serisini tekrarlayın. Ardından, fareyi bir kez daha dinlendirin ve o test günü için seriyi son bir kez gerçekleştirin. Verilerden, analiz için her iki ön ayak veya her iki ön ayak için en büyük üç puanın ortalamasını kullanın.
14 haftalık hipoksi-iskemi yaralı hayvanların beyinleri toplandıktan sonra, beyinler morfolojik olarak kortikal yaralanma, hafif yaralanma veya ciddi yaralanma olarak değerlendirildi. Aynı hayvanlar bir hafta önce bir MRI ile tarandı ve bu da çok açıklayıcıydı. Morfolojik olarak normal beyin bile hipokampusta hafif yaralanma gösterdi.
Altı haftalıkken, yaralanmadan beş hafta sonra, fareler çeşitli davranışsal görevlerle değerlendirildi. Hipoksi-iskemi yaralı fareler, 24 saatlik pasif kaçınma görevinde bilişsel olarak bozuldu. Sadece sağ hemisfer hasar gördüğü için fareler hemiplejik motor fonksiyonlar gösterdi.
Bu, her bir ön ayak için merdivenin enine basamaklarındaki kayma yüzdesindeki farkla ortaya çıktı. Ayrıca, kavrama kuvveti beyindeki motor korteksi içerdiğinden, normal ve kortikal yaralanma grupları kavrama gücünde farklılıklar göstermiştir. Normal kontroller ile kategorik olarak yaralanmamış fareler arasında bir fark gözlenmedi, ancak yaralı fareler açıkça bozuldu.
Bu videoyu izledikten sonra, neonatal hipoksik-iskemik fareler oluşturmak için tek taraflı sağ karotis arterin nasıl bağlanacağını ve takip davranış analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Yaralanmadan yedi gün sonra kortikal beyinde gözle görülür bir hasar görülmese bile, bir MRG'nin hipokampal bir yaralanmayı ortaya çıkarabileceğini not etmek önemlidir. Ayrıca, yavruları nazikçe tedavi etmeyi ve ameliyatı mümkün olan en kısa sürede tamamlamayı unutmamak önemlidir.
Yavruların derileri çok zayıf ve incedir, bu yüzden çok dikkatli olun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir fare modelinde neonatal hipoksik-iskemik (HI) beyin hasarının etkilerini incelemektedir. HI modelini oluşturmak ve nörodavranışsal fonksiyonların değerlendirilmesine olanak sağlamak amacıyla, postnatal 7-10. günlerdeki CD-1 fare yavrularına unilateral karotis arter oklüzyonu uygulanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Neonatal beyin hasarı
- Motor ve bilişsel fonksiyon değerlendirmesi
Arka Plan
- Neonatal hipoksik-iskemik beyin hasarı, pediatrik sağlıkta önemli bir sorundur.
- Bu model, söz konusu hasarların beyin gelişimi üzerindeki etkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
- Serebral palsi ve neonatal inmeler gibi durumlar için preklinik bir model görevi görür.
- Doğru karotis arterinin belirlenmesi, tekniğe yeni başlayanlar için zorlayıcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Neonatal HI beyin hasarını incelemek için güvenilir bir fare modeli oluşturmak.
- HI'nın farelerdeki motor ve bilişsel fonksiyonlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek.
- Neonatal beyin hasarları için potansiyel terapötik yaklaşımlara dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare yavrularında unilateral karotis arter oklüzyon cerrahisi.
- Cerrahi sonrası nörodavranışsal fonksiyonların değerlendirilmesi.
- Operasyon uygulanan farelerin operasyon uygulanmamış kontrollerle karşılaştırılması.
- Prosedür gösterimi için lisansüstü öğrencilerle iş birliği.
Temel Sonuçlar
- CD-1 farelerde neonatal HI modelinin oluşturulması.
- Nörodavranışsal fonksiyonlardaki anlamlı farklılıkların belirlenmesi.
- HI'nın motor ve bilişsel gelişim üzerindeki etkilerine dair öngörüler.
- Modelin, neonatal beyin hasarları üzerine yapılacak gelecekteki araştırmalar için doğrulanması.
Sonuçlar
- Unilateral karotis arter oklüzyonu, neonatal HI modellemek için etkili bir yöntemdir.
- Bu model, terapötik stratejilere yönelik daha ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.
- Nörodavranışsal sonuçların anlaşılması, neonatal beyin yaralanmalarının ele alınması açısından kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Alaka
Bu neonatal hipoksik-iskemik fare modeli, serebral palsi ve neonatal inme ile ilgili motor ve bilişsel eksikliklerin değerlendirilmesi için preklinik bir sistem sağlar. Davranışsal değerlendirmeler, sağ hemisfer hasarını fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek terapötik adayların mekanistik olarak risklerinin azaltılmasına olanak tanır. Model, nörodejeneratif hastalık araştırmalarında hedef doğrulamayı ve assay geliştirmeyi destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hemiplejik motor disfonksiyon ve bilişsel bozuklukla ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Neonatal beyin hasarı yolaklarında fonksiyonel hedef doğrulaması için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Öngörücü Değer: Kortikal hasar şiddetini motor ve bilişsel test sonuçlarıyla ilişkilendirerek öngörüsel güvenilirliği destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik taramaları için standartlaştırılmış nörodavranışsal çıktılar (pasif kaçınma latansı, merdiven kayma sayıları, kavrama gücü) üretir.
- Kantitatif Ölçüm: Yüksek çıktılı davranışsal analize uygun, tekrarlanabilir ve ölçülebilir uç noktalar sağlar.
- Tarama Uygunluğu: Nöroprotektif veya nörorestoratif ajanların ileri aşama değerlendirmeleri için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Serebral palsi ve neonatal inme gibi insan neonatal hipoksik iskemik (HI) durumlarını, motor defisitlerdeki yüz geçerliliği ile modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Klinik gözlemlerle uyumlu bilişsel ve motor fenotipleme kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya geçiş sağlayan bir köprü kurar.
- Riskle Uyumlu Kararlar: MRI ile korele davranışsal fenotipler aracılığıyla yaralanma şiddetini nicelendirerek, devam/durdurma (go/no-go) kriterlerini bilgilendirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Model, hedef validasyonundan preklinik etkinlik testlerine kadar olan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak nörodavranışsal iyileşmenin boylamsal değerlendirilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Hipoksik-iskemik kaskadlarda yer alan hedeflerin yolak aydınlatılmasını ve biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için standardize motor ve bilişsel okumalarla analiz hazır fenotipler sunar.
- Analitik: Gruplar arası karşılaştırma ve etki büyüklüğü hesaplaması için kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (latans, kayma sıklığı, kavrama kuvveti) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: MRI ile doğrulanmış hasar sınıflandırması ve boylamsal davranışsal izleme yoluyla preklinik sürekliliğe bağlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Nörodejeneratif ve gelişimsel hasar programları genelinde çoklu terapötik modalitelerin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Unilateral karotis ligasyonunu hemisfer spesifik fonksiyonel defisitlerle ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar arası standartlaştırılmış cerrahi ve davranışsal protokoller aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Motor ve bilişsel etkinliğe dair erken öngörücü sinyaller sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hasar açısından eşleştirilmiş kohortlardaki davranışsal iyileşmeye dayalı olarak, adayların risk ayarlı önceliklendirmesini mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- Neonatal kemirgen cerrahisi ve mikrosirürjik damar ligasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Tutarlı yaralanma indüksiyonu için hipoksik chamber ekipmanına ve hassas gaz regülasyonuna bağımlıdır.
- Kayma sayımı ve latans ölçümünde gözlemci yanlılığını önlemek için körlenmiş davranışsal testler gereklidir.
- Davranışsal aparatın, altı haftalık farelerin boyutuna ve motor kapasitesine göre uyarlanması gerekir.
- Yaralanma penetransındaki değişkenlikle sınırlıdır; bu durum, kohort stratifikasyonu için post-operatif MRI veya morfolojik tarama yapılmasını zorunlu kılar.
