Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi
June 28th, 2017
Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır.
Bu protokolün genel amacı, ultra hızlı mikroakışkan akışta etiketsiz yüksek kontrastlı tek hücreli görüntüleme için asimetrik algılama zaman uzatmalı optik mikroskopi sistemi hazırlamak ve kullanmaktır. ATOM'un ana avantajı, etiketlenmemiş hücrelerdeki görüntü kontrastını artırırken onlarca megahertz'e kadar satır tarama hızlarıyla ultra hızlı görüntü yakalamaya izin vermesidir. ATOM, standart akış sitometrisi ile mümkün olmayan, saniyede 100.000 hücreye kadar girilmemiş hücre bazlı tahlillerle hücresel ve hücre altı yapıların karmaşık morfolojik analizini sağlar.
sistemi kurmaya başlamak için, geniş bantlı bir femto veya pico saniyeyi IR darbeli lazere yakın bir optik amplifikatöre bağlı tek modlu dağıtıcı bir optik fibere bağlamak için bir fiber kolimatör kullanın. Spektral bir duş oluşturmak için lazerle bir iletim kırınım derecelendirmesini aydınlatın. Kırınım verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için derecelendirmeyi küçük konfigürasyona yakın yönlendirin.
Spektral yağmuru bir örnek platformun altındaki bir objektif lensin arka odak düzlemine yönlendirmek için bir 4f görüntüleme sisteminde teleskopik röle lens düzeneğini yapılandırın. Spektral duşun objektif merceğin arka diyaframını doldurduğundan emin olun. Numune platformunun üzerindeki arka açıklığına düzlem aynalı başka bir objektif lens yerleştirin.
Objektif lenslerini, odak düzlemleri üst üste gelene kadar ayarlayın. Spektral yağmurun görüntü düzlemini çift kez geçtiğini ve derecelendirmeye geri dönmek için aynı yolu izlediğini doğrulayın. Numune platformuna bir mikroakışkan çip yerleştirin ve spektral duşun mikroakışkan kanal boyunca düştüğünden emin olun.
Geri dönen ışığı, derecelendirmeden geçtikten sonra bir ışın ayırıcı ile yeniden yönlendirin. Geri dönen ışığı başka bir ışın ayırıcı ile iki huzmeye ayırın. Kirişler arasında bir zaman gecikmesi sağlamak için kirişleri farklı uzunluklardaki tek modlu fiberlere bağlamak için fiber kolimatörler kullanın.
Fiberleri bir fiber kuplör ve bir fotodetektör aracılığıyla gerçek zamanlı bir osiloskopa bağlayın. Optik sinyalin sinyal-gürültü oranı 10 desibelden büyük olana kadar optik amplifikatör kazancını ayarlayın. Ardından, geri dönen her kirişin yaklaşık yarısını bıçak kenarı kiriş bloklarıyla bloke edin.
Işın bloklarını, her bir fiberde ölçülen optik güç, bloktan önceki gücün yaklaşık yarısı olana kadar ayarlayın. Osiloskop bant genişliğinin ve örnekleme hızının her ikisinin de görüntü çözünürlüğünü etkilemeyecek kadar yüksek olduğunu doğrulayın. Deneye başlamak için, hücre örneklerini fosfat tamponlu tuzlu su veya kaynak suyu ile mililitre başına 10 ila 5. ve 10 ila 6. hücreler arasında seyreltin.
Ardından hücre çözeltisini 10 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Şırıngayı mikroakışkan kanal girişine bağlayın. Mikroakışkan kanal çıkışını bir santrifüj tüpüne yönlendirin.
Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin ve akış hızını kanal genişliğine uygun şekilde ayarlayın. Deneme için kaydedilecek veri noktası sayısını seçin. Ardından optik sinyal verilerini alın ve kaydedin.
Verileri osiloskoptan bir bilgisayara sayısallaştırın ve aktarın. Verileri 2B görüntülere dönüştürün ve görüntülerden bir parametre kitaplığı çıkarın. Parametre kitaplığındaki görüntüleri bir görselleştirme programına aktarın.
Her eksene ilgilendiğiniz bir parametre atayın ve dağılım grafiği olarak görüntülenecek veri kümesini seçin. Eğilimleri belirlemek için çizimdeki her grupla ilişkili hücre görüntülerini kontrol edin. Gerektiğinde daha fazla analiz için manuel geçit kullanın veya ek veri kümelerini görüntüleyin.
ATOM, insan hücrelerinin ve fitoplanktonun yüksek kontrastlı tek hücreli görüntülerini elde etmek için kullanıldı. Vakuoller, pirenoidler ve kamçı gibi karakteristik hücre yapıları fitoplankton görüntülerinde görülebilir. Sitometrik analiz için hücreleri sınıflandırmak için ATOM görüntülerinden hücre boyutu ve dairesellik gibi parametreler belirlendi.
Sınıflandırma sonuçları 2B dağılım grafikleri olarak görüntülenebilir. Burada, sarı renkle gösterilen bir MCF7 ve kırmızı ile gösterilen PBMC için hacim ve dairesellik çizilmiştir. MCF7 için iki küme gözlendi.
Bireysel veri noktalarına karşılık gelen yüksek kontrastlı görüntüleri tanımlayarak, alt kümenin hücre parçalarına ve döküntülere karşılık geldiği bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, görüntüleme sistemi düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde kurulabilir. Görüntüleme işlemleri bir saat içinde yapılabilir.
Lazer kaynağı ve lazer ışını hizalaması ile çalışırken göz güvenliğine özellikle dikkat etmeyi unutmayın. Bu işlemler yapılırken mutlaka koruyucu gözlük takılması gibi önlemler alınmalıdır. Bu prosedürü denerken, optimum görüntüleme kalitesini sağlamak için tüm görüntüleme sistemi kurulum süreci boyunca optik ışın hizalamasını izlemeyi unutmayın.
Bu teknik, hastalık sürecinde nadir veya belirgin hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi hakkında fikir verebilirken, aynı zamanda büyük ve heterojen hücre popülasyonları içinde hücre tipi sınıflandırmasına da uygulanabilir. Bu teknik, görüntü kalitesini korurken görüntüleme sitometrisinin verim sınırlamasının üstesinden gelmek istediğinizde özellikle avantajlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, sistem kurulumundan görüntüleme prosedürlerine kadar ATOM'un nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, ultra hızlı mikroakışkan akışında etiket kullanmadan yüksek kontrastlı tek hücre görüntüleme için asimetrik-algılama zaman-germe optik mikroskopi sistemi uygulamasını tanımlar. ATOM sistemi, ultra hızlı görüntü yakalama sağlar ve etiketlenmemiş hücreler üzerinde görüntü kontrastını artırır, karmaşık morfolojik analizi mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optik Mikroskopi
- Tek Hücre Görüntüleme
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- ATOM, onlarca megahertz'e kadar çizgi tarama hızlarında görüntüleme sağlar.
- Etiketlenmemiş hücreler için görüntü kontrastını artırır.
- Hücresel ve alt hücresel yapıların analizini sağlar.
- Yüksek verimlilikte merkezler dışı hücre tabanlı tahlilleri destekler.
Çalışmanın Amacı
- Asimetrik algılama zaman-germe optik mikroskopi sistemini hazırlamak ve kullanmak.
- Etiket kullanmadan yüksek kontrastlı tek hücre görüntülemesini sağlamak.
- Ultra hızlı mikroakışkan akışında görüntülemeyi kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kurulum, bir fiber kolimatatör ve yakın IR darbeli lazer kullanmayı içerir.
- Lazerin tek modlu dağıtıcı optik fibere bağlanması.
- Sinyali artırmak için bir optik amplifikatör kullanımı.
- Spektral bir yağmur üretmek için bir ışınlama difraksiyonu ızgarasının aydınlatılması.
Ana Sonuçlar
- Saniyede 100.000'e kadar hücre görüntülemesini sağladı.
- Etiketlenmemiş hücreler için geliştirilmiş kontrastı gösterdi.
- Standart akış sitometrisi ile mümkün olmayan karmaşık morfolojik analizi mümkün kıldı.
- Yüksek verimli görüntüleme için yeni bir yaklaşım sundu.
Sonuçlar
- ATOM, tek hücre görüntüleme teknolojisinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder.
- Hücresel yapıların hızlı ve detaylı analizini sağlar.
- Bu yöntem, akış sitometrisi ve ilgili alanlardaki yaklaşımları dönüştürebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through label-free morphological analysis of cellular and subcellular structures.
- Operational Value: Supports functional target validation by de-risking mechanistic ambiguity via high-throughput biophysical phenotyping.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative morphological parameters (e.g., size, circularity) for cytometric classification of cell states and functions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering high-contrast, sub-cellular resolution images without labels or stains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through ultrafast line scan rates and consistent optical signal processing.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling imaging flow cytometry at 100,000 cells/s, overcoming traditional throughput bottlenecks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by detecting rare or aberrant cells in heterogeneous populations, as demonstrated with human cell lines and micro-algae.
- Preclinical Alignment: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through label-free imaging that complements biomarker-based assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement by linking morphological trends to functional outcomes via scatter plot analysis and manual gating.
Pipeline & Workflow Integration
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling complex morphological analysis of cellular structures in microfluidic flow.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through high-speed image capture and quantitative parameter extraction from single-cell images.
- Analytics: Provides measurable outputs such as cell size, circularity, and texture for comparative analysis and classification in scatter plots.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling label-free imaging of heterogeneous cell populations, supporting biomarker-independent phenotypic screening.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for high-throughput imaging across model systems, reducing dependency on staining protocols and accelerating assay development cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free morphological de-risking and reduction of ambiguity in cellular classification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via ultrafast imaging and consistent signal-to-noise ratio control (>10 dB).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of rare or aberrant cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative morphological data from high-throughput imaging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical microscopy, ultrafast laser systems, and microfluidic flow control.
- Needs broadband femtosecond/picosecond near-IR pulsed laser, optical amplifier, diffraction grating, and high-bandwidth oscilloscope.
- Demands cross-team standardization for beam alignment, knife-edge blocking, and fiber length calibration to maintain image contrast and timing.
- Involves adaptation considerations for varying cell types and microfluidic channel dimensions to ensure optimal spectral shower coverage.
- Includes practical limitations such as laser safety requirements and the need for precise optical path alignment to avoid resolution degradation.
