Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Bu protokolün genel amacı, ultra hızlı mikroakışkan akışta etiketsiz yüksek kontrastlı tek hücreli görüntüleme için asimetrik algılama zaman uzatmalı optik mikroskopi sistemi hazırlamak ve kullanmaktır. ATOM'un ana avantajı, etiketlenmemiş hücrelerdeki görüntü kontrastını artırırken onlarca megahertz'e kadar satır tarama hızlarıyla ultra hızlı görüntü yakalamaya izin vermesidir. ATOM, standart akış sitometrisi ile mümkün olmayan, saniyede 100.000 hücreye kadar girilmemiş hücre bazlı tahlillerle hücresel ve hücre altı yapıların karmaşık morfolojik analizini sağlar.

sistemi kurmaya başlamak için, geniş bantlı bir femto veya pico saniyeyi IR darbeli lazere yakın bir optik amplifikatöre bağlı tek modlu dağıtıcı bir optik fibere bağlamak için bir fiber kolimatör kullanın. Spektral bir duş oluşturmak için lazerle bir iletim kırınım derecelendirmesini aydınlatın. Kırınım verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için derecelendirmeyi küçük konfigürasyona yakın yönlendirin.

Spektral yağmuru bir örnek platformun altındaki bir objektif lensin arka odak düzlemine yönlendirmek için bir 4f görüntüleme sisteminde teleskopik röle lens düzeneğini yapılandırın. Spektral duşun objektif merceğin arka diyaframını doldurduğundan emin olun. Numune platformunun üzerindeki arka açıklığına düzlem aynalı başka bir objektif lens yerleştirin.

Objektif lenslerini, odak düzlemleri üst üste gelene kadar ayarlayın. Spektral yağmurun görüntü düzlemini çift kez geçtiğini ve derecelendirmeye geri dönmek için aynı yolu izlediğini doğrulayın. Numune platformuna bir mikroakışkan çip yerleştirin ve spektral duşun mikroakışkan kanal boyunca düştüğünden emin olun.

Geri dönen ışığı, derecelendirmeden geçtikten sonra bir ışın ayırıcı ile yeniden yönlendirin. Geri dönen ışığı başka bir ışın ayırıcı ile iki huzmeye ayırın. Kirişler arasında bir zaman gecikmesi sağlamak için kirişleri farklı uzunluklardaki tek modlu fiberlere bağlamak için fiber kolimatörler kullanın.

Fiberleri bir fiber kuplör ve bir fotodetektör aracılığıyla gerçek zamanlı bir osiloskopa bağlayın. Optik sinyalin sinyal-gürültü oranı 10 desibelden büyük olana kadar optik amplifikatör kazancını ayarlayın. Ardından, geri dönen her kirişin yaklaşık yarısını bıçak kenarı kiriş bloklarıyla bloke edin.

Işın bloklarını, her bir fiberde ölçülen optik güç, bloktan önceki gücün yaklaşık yarısı olana kadar ayarlayın. Osiloskop bant genişliğinin ve örnekleme hızının her ikisinin de görüntü çözünürlüğünü etkilemeyecek kadar yüksek olduğunu doğrulayın. Deneye başlamak için, hücre örneklerini fosfat tamponlu tuzlu su veya kaynak suyu ile mililitre başına 10 ila 5. ve 10 ila 6. hücreler arasında seyreltin.

Ardından hücre çözeltisini 10 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Şırıngayı mikroakışkan kanal girişine bağlayın. Mikroakışkan kanal çıkışını bir santrifüj tüpüne yönlendirin.

Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin ve akış hızını kanal genişliğine uygun şekilde ayarlayın. Deneme için kaydedilecek veri noktası sayısını seçin. Ardından optik sinyal verilerini alın ve kaydedin.

Verileri osiloskoptan bir bilgisayara sayısallaştırın ve aktarın. Verileri 2B görüntülere dönüştürün ve görüntülerden bir parametre kitaplığı çıkarın. Parametre kitaplığındaki görüntüleri bir görselleştirme programına aktarın.

Her eksene ilgilendiğiniz bir parametre atayın ve dağılım grafiği olarak görüntülenecek veri kümesini seçin. Eğilimleri belirlemek için çizimdeki her grupla ilişkili hücre görüntülerini kontrol edin. Gerektiğinde daha fazla analiz için manuel geçit kullanın veya ek veri kümelerini görüntüleyin.

ATOM, insan hücrelerinin ve fitoplanktonun yüksek kontrastlı tek hücreli görüntülerini elde etmek için kullanıldı. Vakuoller, pirenoidler ve kamçı gibi karakteristik hücre yapıları fitoplankton görüntülerinde görülebilir. Sitometrik analiz için hücreleri sınıflandırmak için ATOM görüntülerinden hücre boyutu ve dairesellik gibi parametreler belirlendi.

Sınıflandırma sonuçları 2B dağılım grafikleri olarak görüntülenebilir. Burada, sarı renkle gösterilen bir MCF7 ve kırmızı ile gösterilen PBMC için hacim ve dairesellik çizilmiştir. MCF7 için iki küme gözlendi.

Bireysel veri noktalarına karşılık gelen yüksek kontrastlı görüntüleri tanımlayarak, alt kümenin hücre parçalarına ve döküntülere karşılık geldiği bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, görüntüleme sistemi düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde kurulabilir. Görüntüleme işlemleri bir saat içinde yapılabilir.

Lazer kaynağı ve lazer ışını hizalaması ile çalışırken göz güvenliğine özellikle dikkat etmeyi unutmayın. Bu işlemler yapılırken mutlaka koruyucu gözlük takılması gibi önlemler alınmalıdır. Bu prosedürü denerken, optimum görüntüleme kalitesini sağlamak için tüm görüntüleme sistemi kurulum süreci boyunca optik ışın hizalamasını izlemeyi unutmayın.

Bu teknik, hastalık sürecinde nadir veya belirgin hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi hakkında fikir verebilirken, aynı zamanda büyük ve heterojen hücre popülasyonları içinde hücre tipi sınıflandırmasına da uygulanabilir. Bu teknik, görüntü kalitesini korurken görüntüleme sitometrisinin verim sınırlamasının üstesinden gelmek istediğinizde özellikle avantajlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, sistem kurulumundan görüntüleme prosedürlerine kadar ATOM'un nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.