İnsan böbrek Perivasküler Stromal hücreler için bir roman klinik sınıf izolasyon yöntemi

Bu klinik düzeydeki izolasyon yönteminin genel amacı, çeşitli böbrek hastalıklarının hücre terapisi ile tedavisi için insan böbrek perivasküler stromal hücrelerini veya kPSC'leri izole etmektir. Bu yöntem, böbrek hastalıkları ve transplantasyon için merkezi sinir terapisine uygun insan kPSC'leri gibi rejeneratif tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, klinik düzeyde olması ve hücre terapisi amaçları için yeterli sayıda kPSC üretmek için kullanılabilmesidir.

Laboratuvarımızdaki teknisyen Ellen Lievers, kPSC'lerin fonksiyonel testlerini gerçekleştirecektir. Böbrek hücresi izolasyon prosedürüne başlamadan önce, sterilize edilmiş bir perfüzyon tepsisini dikey konumda bir su banyosuna bağlayın. Perfüzyon tepsisi su tarafından ısıtıldığında, tepsiyi su banyosuna bağlı tutarak yatay konuma getirin ve ardından pompa içine bir L/S 25 tüp yerleştirin.

Kültür penslerini tüpün bir ucuna yerleştirin ve tüpün tepsinin tabanına oturmasını sağlayın. Tıkanmayı önlemek için tüpün üzerine steril gazlı bez yerleştirin ve tüpün diğer ucuna bir luer konnektör takın, ardından tepsiye yaklaşık 100 millilitersiyum besiyeri ekleyin ve L/S 25 tüpünü dakikada 100 millilitersiyum pompa hızıyla yıkamaya başlayın. Böbrek hücrelerini izole etmek için, böbreği çift steril torbalardan steril perfüzyon tepsisine aktarın; perirenal yağ dokusunu ve böbrek kapsülünü çıkarmak için makas kullanın ve nazikçe yırtın.

Aortik yamada renal arter tespit edildiğinde, renal arteri kanülize etmek için yardımcı spike'ı kullanın ve spike'ı sterilize edilmiş bir plastik kelepçe ile sabitleyin. Pompa açıkken, pompa tüp ucunu luer konnektöre bağlayın. Ardından böbreği, tepsideki medium ile dakikada 100 milliliter akış hızında yıkayın.

Ardından, perfüzyon tepsisine 20 mililitre kollagenaz ve 2,5 mililitre DNAz ekleyin ve enzimlerin böbreği sindirmesine izin verin; organ yumuşayana ve perfüzyon sıvısı opaklaşmaya başlayana kadar organı ara ara elinizle nazikçe döndürün. Kollagenaz sindirim süresi kritiktir; sürenin çok kısa olması hücre kümelerine, çok uzun olması ise hücre ölümüne yol açar. Enzimatik perfüzyonun sonunda, hücre süspansiyonu elde edilene kadar böbreğe nazikçe masaj yapın ve sindirilmemiş materyali ve spike'ı çıkarın.

Hücre süspansiyonuna 50 mililitre normal insan serumu ekleyin, ardından pompa düşük akış hızındayken, hücre süspansiyonunun perfüzyon tepsisinden toplama tüplerine boşalmasını sağlamak için böbreğe bağlı tüpü birkaç adet 50 mililitre toplama tüpünün üzerine yerleştirin. Tüm hücreler toplandığında, hücre süspansiyonlarını santrifüjleyin ve peletleri %10 normal insan serumu ile desteklenmiş yıkama medyumu ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, peletleri hücre peletlerinin hacmine eşit miktarda hücre kültür medyumu içinde yeniden süspanse edin.

Ham böbrek hücrelerini kültüre etmek için, her bir T 175 hücre kültürü flaskına yaklaşık bir mililitre hücre süspansiyonu ile 24 mililitre alfa-MEM %5 trombosit lizatı hücre kültürü besiyeri ekleyin ve flaskları 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. İki gün sonra süpernatantı ve hücre kalıntılarını uzaklaştırın ve hücreleri 25 mililitre taze hücre kültürü besiyeri ile besleyin. Hücreler konfluans olduğunda, standart protokollere uygun olarak manyetik hücre ayrıştırma ile NG2 pozitif fraksiyonu izole edin.

Ardından, uygun boyutlardaki bir hücre kültür balonu içerisine santimetrekare başına 4x10³ NG2 pozitif hücre ekleyin ve balonu hücre kültür inkübatörüne yerleştirin. Hücreler %90 ila %100 konfluens düzeyine ulaştığında, süpernatantı toplayın ve yapışık hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Hücreleri, balon boyutuna uygun hacimdeki tripsin ile ayırın ve beş dakika sonra reaksiyonu ayrılan süpernatant ile durdurun.

Hücreleri nazikçe resüspande edin, ardından hücre süspansiyonunu santrifüj için uygun boyuttaki konik bir tüpe aktarın ve hücreleri santimetrekare başına 4 × 10³ hücre yoğunluğunda yeniden ekim yapın. NG2 zenginleştirmesinden sonra hücreler bazen proliferasyonu durdurabilir veya 3D yapılar şeklinde büyümeye başlayabilir. Bu durum, hücrelerin tripsinizasyonu ve yeniden ekimi ile çözülebilir.

Dört ila beş pasajdan sonra, kPSC'leri altı kuyucuklu bir plakaya her kuyucuk başına 2 mL ortamda 2x10⁵ hücre konsantrasyonunda ekiniz ve ayrı bir altı kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 2 mL proksimal tübüler epitel hücresi ortamında 5x10⁵ proksimal tübüler epitel hücresi ekiniz. Her iki plakayı da 48 saat boyunca hücre kültürü inkübatöründe bekletiniz; inkübasyon sonunda kPSC hücre süpernatantını toplayınız, ardından proksimal tübüler epitel hücresi süpernatantını uzaklaştırınız ve her kuyucuğun tabanındaki hücre monotabakasında bir çizik oluşturmak için sarı bir pipet ucu kullanınız. Çizilen hücreleri PBS ile yıkayınız ve böbrek vasküler stromal hücre kültürlerinden elde edilen kondisyonlu ortamı ekleyiniz.

Ardından, zaman içindeki kapanma yüzdesini değerlendirmek için bir ters brightfield mikroskobunda aynı işaretli konumda dört, sekiz, 12 ve 24. saatlerde çizginin görüntüsünü alın. Böbrek perivasküler stromal hücreleri; stromal ve perivasküler hücre belirteçleri için pozitif, CD31, CD34, CD45 ve HLA-DR belirteçleri için ise negatif olan, plastiğe yapışan, iğ şekilli hücrelerdir. Tipik olarak, dördüncü pasajda homojen bir böbrek perivasküler stromal hücre popülasyonuna ulaşılabilir ve hücreler dokuzuncu ila 10. pasaj civarında senesense ulaşır.

kPSC'lerin fonksiyonel kapasitesini değerlendirmek için yapılan bu temsili yara çizme deneyinde, böbrek perivasküler stromal hücre kültüründen elde edilen kondisyonlu ortam eklendiğinde, yara kontrol ortamında kültüre edilen kuyucuklara göre anlamlı derecede daha hızlı kapanmıştır. Primer izolasyon tekniği uzmanlaşıldığında yaklaşık iki saat sürecektir; homojen bir kPSC popülasyonu oluşturmak ise bir ila iki ayınızı alacaktır. Bu prosedürü uygularken, böbrek yumuşayıp sıvılar daha az şeffaf hale gelir gelmez kollagenaz işlemini durdurmak önemlidir.

Burada gösterilen prosedürlere ek olarak, bu teknikler diğer katı organlardan perivasküler stromal hücrelerin izolasyonu için de kullanılabilir. Bu teknikle izole edilen kPSC'ler, çeşitli farklı böbrek hastalığı ve transplantasyon modellerinde bu hücrelerin rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, klinik düzeyde kPSC izole edebilmeli ve kültüre edebilmelisiniz.

İnsan materyalleriyle çalışmanın virüs bulaşma riski taşıdığını unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman HIV, hepatit B ve hepatit C testleri gibi önlemler alın.