Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu Yüzücü ve Swarmer Hücreleri

Bu yöntemin genel amacı, Vibrio parahaemolyticus bakterisinin hücresel farklılaşmasını ve floresan mikroskobu ile tek hücre analizi için kolayca bulunabilen farklılaşmış sürü hücrelerinin bir popülasyonunun oluşumunu indüklemektir. Bu yöntem, bilim adamlarının hücresel farklılaşma ve morfogenez sırasında bakterilerin hücre içi organizasyonu nasıl düzenlediğini anlamalarına yardımcı olacaktır. Bakteri toplulukları içindeki hücrelerin görüntülenmesi zor olabileceğinden, bu tekniğin ana avantajı, tek hücre mikroskobu analizi için hazır bulunan tek bir hücre katmanında bulunan farklılaşmış sürü hücrelerinden oluşan bir popülasyon üretmesidir.

Bu tekniğin sonuçları, bakterilerin hücresel farklılaşma sırasında hücre döngüsündeki, hücre morfolojisindeki ve hücre içi organizasyondaki değişiklikleri nasıl düzenlediğinin daha iyi anlaşılmasına kadar uzanır. Bu yöntemin gösterilmesi, hücresel farklılaşmanın güvenilir bir şekilde indüksiyonu ve tek hücre analizi için mevcut hücrelerin oluşumunun elde edilmesinin zor olması nedeniyle kritiktir. Kaynama plakaları yapmak için agar çözeltisini hazırlamak için, dört gram kalp infüzyonunu veya H.I.agar tozunu ve 100 mililitre çift damıtılmış suyu askıya alın.

H.I.agar çözeltisini bir mikrodalga fırında dikkatlice kaynatın, toz eriyene kadar şişeyi zaman zaman sallayın. Agar çözeltisini 121 santigrat derecede 20 dakika otoklavlayın, agar çözeltisini sürekli karıştırarak 60 t0 65 santigrat dereceye soğutun. Bir sonraki adım, oldukça toksik olan 2, 2'Bipiridil kullanımını içerir, bu nedenle eldiven ve koruyucu gözlük takılmalıdır.

50 mikromolar nihai konsantrasyona 2, 2'Bipiridil ekleyin. Dört millamolarlık bir son konsantrasyona kalsiyum klorür ekleyin. Tek bir koloninin kenarından az miktarda V. parahaemolyticus hücresini 5 mililter LB suyuna aşılayın.

Kültürü, 600 nanometre 0.8'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu genellikle yaklaşık iki ila üç saat sürer. Hücre kültürü büyürken, son H.I.agar çözeltisinin 30 ila 35 mililitresini 150 milimetrelik yuvarlak bir petri kabına pipetleyin ve agarın katılaşmasına izin verin.

Hücre kültürünü tespit etmeden hemen önce, agar plakasını açık bir kapakla 37 santigrat derecede en az 10 dakika veya herhangi bir sıvı kalıntısı kaybolana kadar, ancak daha fazla olmamak üzere dik olarak kurutun. H.I.agar kaynatma plakasının merkezinde bir mikrolitre hücre kültürü tespit edin ve lekenin kurumasını bekleyin. Plakayı şeffaf plastik bantla kapatın, hava kabarcıklarının oluşmasını ve banda kıvrım oluşmasını önlemeye dikkat edin.

Plakayı gece boyunca 24 santigrat derecede inkübe edin. Bu, bu hızlandırılmış video klipte gösterildiği gibi, koloninin merkezinden uzanan sürü fişekleri ile bir V.Parahaemolyticus sürü kolonisinin oluşumuyla sonuçlanacaktır. Bu prosedürdeki ilk adım, mikroskopi için agaroz slaytları hazırlamaktır.

100 mililitre% 20 PBS ve% 10 LB et suyu çözeltisine bir gram agaroz ekleyin. Agarozu çözmek için çözeltiyi mikrodalgada dikkatlice kaynatın ve ardından manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırırken 65 ila 70 santigrat dereceye kadar soğumaya bırakın. Çalışma tezgahının mükemmel düz bir bölümüne temiz bir mikroskop lamı yerleştirin.

Sürgünün her iki ucunu iki kat genel amaçlı laboratuvar etiketleme bandı ile kaplayarak sürgüyü tezgaha sabitleyin. İki bant parçası arasındaki mesafe yaklaşık üç santimetre olmalıdır. Önceden hazırlanmış agaroz çözeltisinden yaklaşık 250 mikrolitre pipetleyin, kapalı olmayan cam yüzeye pipetleyin.

İkinci bir mikroskop lamını üstteki alt slaytla aynı yönde yerleştirin ve kalan agarozun yanlara akabilmesi için hafifçe aşağı bastırın. Agarozun bir ila iki dakika katılaşmasına izin verin. Mikroskop lamının kenarlarına tutturulmuş herhangi bir kalıntı agarozu kesmek için bir neşter kullanın.

agaroz katılaştığında, üst cam sürgüyü yatay bir hareketle alttakinden yavaşça çekin. Mikroskop lamının uçlarındaki bandı yavaşça çıkarın. Agaroz slaytı, yavaş yavaş kurumaya başlayacağı için mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır.

Sürü hücrelerinin mikroskop lamına aktarılmasından hemen önce, önceden hazırlanmış sürü plakasından plastik bandı kesmek için bir neşter kullanın. Sürü halindeki agarın eksizyonu sırasında, sürü halindeki fişekleri koloninin ortasından kaynaklanan hücrelerle kontamine etmemek için kesimi dışarıdan gelen koloninin içine yönlendirmek önemlidir. Sürü halindeki bir koloninin en dış kenarından üç milimetreye 10 milimetrelik bir sürü agar parçasını kesmek için yeni bir neşter kullanın ve kesikleri sürü halindeki koloni kenarının dışından koloninin içine yönlendirdiğinizden emin olun.

Sürü halindeki agar parçalarını, sürü halindeki hücreleri agaroz pedine basmak için hücreler agaroz pedine bakacak şekilde mikroskop agaroz lamına aktarın. Yaklaşık 30 saniye bekledikten sonra agar parçasını agaroz pedinden dikkatlice çıkarın. Hücrelerin basıldığı agaroz pedin üzerine bir cam lamel yerleştirin.

Hücreler artık floresan mikroskobu için hazırdır. Bir V. parahaemolyticus sürü kolonisinin artan büyütme oranındaki stereo-mikroskopi görüntülemesi, sürü kolonisinin çevresinden uzanan sürü parlamalarını göstermektedir. Parlamalardaki hücreler yalnızca tek veya çift katmanlar halinde gruplandırılırken, sürü kolonisinin ortasındaki hücreler birden çok katman halinde istiflenir.

DIC mikroskopi görüntülemesi, parlamaların yalnızca tamamen farklılaşmış bir sürü hücresi popülasyonundan oluştuğunu, sürü kolonisinin ortasındaki hücrelerin önemli ölçüde daha kısa olduğunu ve muhtemelen yüzücü ve sürü hücrelerinin bir karışımını temsil ettiğini ortaya koydu. Prensip kanıtı olarak, DIC ve floresan mikroskobu görüntüleme, ektopik olarak temel bir kemotaksis proteini olan YFP-CheW'yi eksprese eden vahşi tip V. Parahaemolyticus yüzücü ve sürü hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Yüzücü hücrelerinde, YFP-CheW tek kutuplu ve iki kutuplu bir şekilde lokalize olur, ancak sürü hücrelerinde, YFP-CheW her zaman bipolar olarak lokalizedir ve ayrıca hücre uzunluğu boyunca rastgele konumlandırılmış kümeler oluşturur.

Yüzücüden sürüye hücre farklılaşması sırasında YFP-CheW'nin lokalizasyon modelindeki değişiklikler, odak dağılımının gösterilmesi ve floresan yoğunluk profillerinin demografik analizleri ile de gösterilmiştir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, mikrobiyal hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, Vibrio parahaemolyticus bakterisinin, yüzücü ve sürü hücrelerinin farklı farklılaşmış durumları sırasında iç organizasyonunu nasıl düzenlediğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Vibrio parahaemolyticus bakterisinin hücresel farklılaşmasının nasıl indükleneceğini ve floresan mikroskobu ile tek hücre analizi için farklılaşmış sürü hücrelerinden oluşan bir popülasyonun nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Vibrio parahaemolyticus'un bir insan patojeni olduğunu ve bölgenizdeki BSL 2 patojenlerinin nasıl ele alınacağına dair uygun prosedürler ve düzenlemelerin uygulanması gerektiğini unutmayın.