Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Bu protokol, in vitro nöro-biyolojik model veya nöro-rejeneratif bir tedavi olarak kullanılmak üzere kendi kendine bir araya getirilmiş, uzunlamasına hizalanmış astrositik somat demetlerinin ve mikron boyutunda bir hidrojel mikro kolon içindeki işlemlerin imalatına rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. Travma ve nörodejeneratif hastalıklar, merkezi sinir sisteminde rejenerasyonu sınırlayan inhibitör ortamdaki sınırlı nörojenik kapasite nedeniyle hastalar için özellikle zararlıdır. Tasarlanmış astrositik demetler, hedeflenen hücre göçünü ve akson yolu bulmayı teşvik etmek için temel nöroanatomik özellikleri ve glia aracılı gelişimsel mekanizmaları çoğaltmaya çalışarak mevcut tedavi stratejilerinin sınırlamalarını ele alır.

Bu astrositik iskelelerin mimarisi, öncelikle rostral göç akımının glial tüplerindeki hizalanmış astrositik süreçlerden esinlenmiştir. Steril bir beherde hacim başına% 3'lük bir agaroz çözeltisi ve DPBS hazırlayarak başlayın. Çözeltinin erken katılaşmasını önlemek için ısıtmayı ve karıştırmayı sürdürün.

Ampul dağıtıcısının alt açıklığına bir akupunktur iğnesi sokun. Açıkta kalan iğnenin üzerine bir kılcal tüp yerleştirin ve bir kısmını ampul dağıtıcı silindirinin kauçuk kısmına girerek ikisini sabitleyin. Montajı tamamlamak için silindiri kapatın.

Bir mililitre sıvı agarozu boş bir petri kabının yüzeyine aktarın. Ampul dağıtıcısının lastik kapağını sıkıştırırken, kılcal borunun bir ucunu agarozun içine sokun ve agarozu tüpe çekmek için kapak üzerindeki basıncı serbest bırakın. Ampulü, tüpü, iğne tertibatlarını bir petri kabına yerleştirin ve agarozun kılcal tüplerin içinde 5 dakika katılaşmasına izin verin.

Ardından, iğneyi kılcal borudan dışarı çekin ve mikro sütunu hala iğneyi çevreleyen halde bırakın. Mikro sütunu iğnenin ucuna kadar itmek için ön pazinin uçlarını kullanın, ardından iğneyi açık bir DPBS içeren petri kabının üzerinde tutun ve mikro sütunu DPBS'ye itin. Bu yapıların daha sonra işlenmesini kolaylaştıran mikro sütunlu tekneler imal etmek için, hacim başına ağırlıkça %4'lük bir agaroz çözeltisi yaparak ve çözeltiyi ısıtılmış ve karıştırılmış halde tutarak başlayın.

Bir mikro sütunu boş bir petri kabına taşımak için forseps kullanın. Ardından, bir stereoskop altında çalışırken, mikro sütunları istenen uzunlukta kesmek için bir mikro neşter kullanın ve uçları 45 derecelik bir açıyla kesin. Üç mikro sütunu daha kırptıktan sonra, dört sütunu paralel olarak hizalayın.

50 mikrolitre% 4 agaroz çözeltisi içeren bir pipet yükleyin ve yapıları bir tekneye bağlamak ve demetlemek için mikro sütun dizisinin üzerine bir dizi sıvı dağıtın. % 4 agarozun jelleşmesine izin vermek için 1 ila 2 dakika soğumaya bırakın. Ardından, mikro sütunlu tekneyi bağlantı agaroz köprüsünden almak için ince forseps kullanın.

Ve DPBS içeren bir petri kabına taşıyın. Mikro sütunlu tekneyi bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve otuz dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakarak sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabini içinde, ko-kültür ortamında mililitre başına 1 miligram sıçan kuyruğu tip 1 kollajen çözeltisi hazırlayın.

Ve sonra buzun üzerine yerleştirin. ECM çözeltisinin pH'ını, pH 7,2 ila 7,4 aralığında stabil olana kadar gerektiği gibi asit veya baz ile ayarlayın. Mikro sütunlu tekneyi forsepsli 35 veya 60 mL'lik bir petri kabına aktarın.

Rehberlik için stereoskopu kullanarak, bir mikro pipetin 10 mL ucunu her mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve DPBS ve hava kabarcıklarının lümenini boşaltmak için emdirin. Kollajen solüsyonu ile bir P10 mikropipeti şarj edin. 10 mL'lik ucu her mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve lümeni doldurmak için yeterli çözelti verin.

Ardından, mikro sütunun her iki ucuna bir ECM rezervuarı pipetleyin. Tüm sütunlar doldurulduktan sonra, sütunların kurumasını önlemek için kokültür ortamını petri kabının etrafına bir halka halinde pipetleyin. Hücreleri eklemeden önce kollajenin polimerizasyonunu teşvik etmek için mikro sütunları içeren kabı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte en az bir saat inkübe edin.

Daha sonra, bir P10 mikropipetinin ucunu bir mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve doldurmak için yaklaşık 5 mL hücre solüsyonunu lümene aktarın. Tüm mikro sütunları bir tekneye oturttuktan sonra, astrositlerin ECM'ye bağlanmasını teşvik etmek için 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 1 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, oturmuş mikro sütunları içeren tabakları sırasıyla 35 veya 60 mL petri kapları için 3 veya 6 mL kokültür ortamı ile dikkatlice doldurun.

Altı ila on saat sonra demetlenmiş, kablo benzeri bir yapı oluşturması gereken astrositik demetlerin hizalanmış kendi kendine montajını teşvik etmek için kaplanmış mikro sütunları ve kültürü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun. Kaplamadan bir saat sonra, astrositler küre şeklindedir ve yapı boyunca dağılır. Kaplamadan beş saat sonra, astrositler işlem uzamasını ve büzülmesini başlatır.

Kaplamadan sekiz saat sonra, astrositler hizalanır ve büzülür. Kaplamadan 24 saat sonra, bu örnekte yoğun bir astrositik süreç demeti oluşmuştur. Bu tam şekillendirilmiş astrositik demet, kaplamadan 24 saat sonra, kablonun uçlarının lümen duvarının farklı uçlarına bağlandığı fermuarlama etkisini gösterir.

Bu video, kaplamadan 3 ila 10 saat sonra demetlemenin nasıl yapıldığını göstermektedir. Astrositik iskelelerin immüno-etiketlemesi, astrositik süreçlerin uzunlamasına hizalanmasını gösterir. Bir astrositik demetin bu konfokal görüntüsünde, astrositik işaretleyici GFAP okunur.

Ve çekirdekler mavi renkte görülür. Demetin bu daha yüksek büyütülmesi, mikro sütunlar içindeki astrositlerin sito-mimarisinin görselleştirilmesine izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, biyomateryal bir kılıf içinde biyolojik olarak ilham almış bir sitomimariye sahip, uzunlamasına hizalanmış astrositik demetlerden oluşan canlı iskeleler üretebilmelisiniz.

Bu prosedürü takiben, nörojenik bölgelerden yönlendirilmiş hücre göçünü teşvik etmek ve sınırlayıcı CNS mikro çevresine rehberlik etmek için astrositik demetleri biyomateryal kılıfı olsun veya olmasın yaralı beyin dokusuna iletmek için bir transplantasyon stratejisi tasarlanabilir. Ek olarak, bu teknik, doğal üç boyutlu ortamın taklidi ve in vitro sistemlerin doğal deneysel kontrolünden yararlanan biyofidik modelleme platformu glia aracılı nörobiyolojik fenomen olarak genişletilebilir.